鸭肿头出血症病毒在鸭胚原代成纤维细胞中增殖特性的研究

将鸭肿头出血症病毒(DSHDV)强毒株经尿囊腔接种10日龄鸭胚,传3代,取第3代尿囊液接种鸭胚成纤维细胞(DEF),传代培养至有细胞病变出现,并对接毒细胞进行TCID50动态检测和透射电镜观察。结果显示,第1代接毒细胞培养至120 h出现变圆、脱落,并形成少量蚀斑,第2代培养至96~120 h,DEF形成大量圆形或椭圆形的典型蚀斑,第3代培养至72~96 h,DEF出现典型蚀斑;此后可稳定适应于DEF,典型细胞病变出现于72~96 h。DSHDV在DEF上的TCID50值随传代次数的增加而增高,由第1代的102.75增加到第10代的106.82,最高毒价出现于96 h,该点是收获病毒的最佳时间。经透射电镜观察,可见DSHDV粒子呈球形或椭圆形,大小为60~75 nm,无囊膜,具有双层衣壳。结果证实,DSHDV强毒株已经适应了DEF,传代后可获得较高的病毒效价。     

鸡胚成纤维细胞培养鸭瘟病毒的试验

将鸭瘟病毒强毒(DPV34)经12日龄鸭胚连续传2代,收获的尿囊液DPV34F2作为细胞培养的病毒接种于鸡胚成纤维细胞,连续传代5次.结果,从第2代开始,接种DPV的鸡胚成纤维细胞出现细胞病变,随着代次的增加,细胞病变愈加明显.经电镜观察,第5代细胞培养物中有典型的DPV病毒粒子;将第5代培养物接种鸭胚,出现典型鸭瘟病变;用PCR方法检测培养物,也出现DPV的特征DNA带.     

一种新的鹅病毒病的病原分离与初步鉴定

对湖北省某县发生的一种以成年鹅皮下血包囊及内脏广泛性肿块为特征的传染性疾病的病原进行了初步分离、鉴定。用成年病死鹅和病鹅肝组织悬液接种12 日龄鹅胚,48~72 h鹅胚死亡,再用第一代鹅胚尿囊液连传6 代,鹅胚均死亡(GVF1~6)。用GVF2 接种鸡胚,48~96 h 死亡,连传4代,鸡胚均死亡(EVF1~4);用GVF3回归成年母鹅,出现与自然感染病例类似的病变;对EVF4进行毒力测定,其ELD50为10-5.3;鸡胚平均死亡时间为96 h;将EVF4鸡胚尿囊液进行纯化和浓缩,电镜观察,可见大小120~220 nm有囊膜的近似球形的病毒颗粒;该病毒能凝集鹅、豚鼠、牛、羊、人等多种红细胞,能被相应的血清和鸡新城疫血清所抑制,经核酸型测定,为RNA。初步确定本病毒是未曾报道过的一新型鹅副黏病毒。     

鸭病毒性肠炎病毒荧光实时定量PCR检测方法的建立和应用

根据已发表的鸭病毒性肠炎病毒(DEV)基因保守序列设计TaqMan探针,建立了检测 DEV的荧光实时定量PCR方法,用该法对DEV在鸭胚成纤维细胞(DEF)中的增殖进行了检测。结果显示,DEV接种DEF 22 h后开始释放,第50 h病毒在细胞和上清中的含量增幅均为1×103 左右,病毒主要存在于细胞中,其含量是上清的1×102-1×103倍。     

鸭2型腺病毒的分离鉴定及hexon基因的序列分析

为了鉴定广东惠州某鸭场疑似鸭肝病患病鸭的病原,通过接种11日龄番鸭胚,从发病鸭群病料中分离出1株未知病毒,经PCR鉴定为鸭2型腺病毒。选取第6代毒株进行血凝性、鸭胚致病性、致细胞病变、动物回归试验以及六邻体(hexon)基因序列分析。结果表明:接种病毒后第36~72小时,鸭胚集中出现死亡,胚体全身弥漫性出血,ELD_(50)为1×10~(6.31)/m L;分离的病毒不凝集鸡、鸭红细胞,在鸭胚成纤维细胞上可致细胞变圆、折光性增强等病变。将0.1 m L病毒液经肌肉接种1日龄泥鸭,主要引起雏鸭肝、脾出血和肿大。分离株hexon基因与GenBank数据库中CH-GD-12-2014株(登录号:KR135164.1)和GR株(登录号:NC_024486.1)的核苷酸同源性分别为100%和76.6%。本试验为深入研究鸭2型腺病毒的致病机制及综合防控提供了重要的基础数据。     

鸭肿头出血症病毒强毒的致病性及感染组织细胞的超微病理变化

将鸭肿头出血症病毒(DSHDV)强毒株以不同途径接种10日龄鸭胚,研究了病毒在鸭胚中的繁殖规律,并用透射电镜观察了感染鸭胚各组织器官的超微结构变化,同时用DSHDV人工感染不同日龄雏鸭,比较了不同感染途径对雏鸭的致病性和对不同日龄雏鸭的致病性。结果显示,尿囊腔和卵黄囊2种途径均能使病毒在鸭胚上繁殖并传代,对鸭胚的半数致死量分别为10-7.24/0.2 mL和10-6.4/0.2 mL。病毒感染鸭胚后,电镜下可观察到肝和尿囊膜中的病毒粒子,病毒粒子呈球形或椭圆形,大小为60~80 nm,无囊膜;病毒在细胞浆内复制,可形成特征性包涵体;病毒侵害的主要靶器官为尿囊膜与肝,细胞器的变化主要表现为粗面内质网扩张以及线粒体肿胀和嵴断裂、消失。病毒经肌肉注射、口服和滴鼻均能使28日龄鸭感染发病,致死率分别为86%、89%和97%。研究表明,DSHDV能很好地在鸭胚上生长并致鸭胚各组织器官超微结构发生变化,不同感染途径均能使雏鸭感染发病且致病性强。     

猪伪狂犬病病毒S1株的分离与鉴定

从上海某猪场发病仔猪体内分离到 1株病毒 ,该毒株能在鸡胚成纤维细胞、RK、Vero、BHK2 1、ST、PK15细胞上增殖并产生细胞病变。通过蚀斑克隆对其进行纯化 ,克隆毒株在BHK2 1细胞上的TCID50 为 5 0 μL 10 -6.68稀释液。该病毒能被伪狂犬病毒 (PRV )阳性血清中和。接种细胞经PRV荧光抗体染色呈阳性反应。电镜观察可见直径 110～ 180nm的典型疱疹病毒粒子。用该病毒接种兔和仔猪均出现典型的伪狂犬病症状。表明该分离毒株为PRV。     

鸡病毒性关节炎病毒的分离与鉴定

将疑似病毒性关节炎病鸡关节炎炎性渗出物处理之后，在ＳＰＦ鸡胚上传代，第６代时鸡胚开始死亡，第９代以后呈现规律死亡，胚体出血，绒毛膜水肿。以此尿囊液接种Ｖｅｒｏ细胞出现明显的合胞体病变，继而产生严重的细胞脱落。电镜观察，病毒粒子呈六角形，无囊膜，直径约７０ｎｍ。琼扩试验中，该病毒与关节炎病毒特异抗血清呈明显阳性反应。回归试验中，该病毒能使１日龄ＳＰＦ鸡雏在７２ｈ内发生严重的关节炎病变，最终全部死亡。理化特性鉴定证明其核酸为ＲＮＡ，能抵抗乙醚和氯仿。结果表明该分离物为鸡病毒性关节炎病毒。     

鸭瘟病毒CY07株诱导的细胞凋亡及凋亡对其增殖的影响

通过荧光染色对鸭瘟病毒(DPV)CY07株诱导的细胞凋亡进行了测定,并通过real-time PCR测定了其在鸭胚成纤维细胞上的增殖规律,探讨了DPV CY07诱导鸭瘟发生的机制.结果显示,DPV CY07株诱导鸭胚成纤维细胞凋亡的凋亡率于接毒后第12 h时达到峰值12.85%,对照毒株鸭瘟标准毒诱导的细胞凋亡在接毒后第8 h达到峰值10.57%.DPV CY07株的数量在接毒后第20 h开始急剧增加,至第24 h增幅为102.02;鸭瘟标准毒的数量在接毒后第16 h开始急剧增加,至第24 h增幅为102.21,且试验结束时DPV CY07株的病毒量低于鸭瘟标准毒株.说明,DPV CY07株诱导细胞凋亡的能力较强,这可能是其毒力强的主要原因.     

适合鸭瘟病毒弱毒增殖的MHC单倍型鸭胚肝间充质干细胞的建立

为了建立适于鸭瘟病毒(DPV)弱毒增殖的细胞系,利用4个主要组织相容性复合体(MHC)单倍型鸭品系,体外分离鸭胚肝细胞,在干细胞因子、白细胞抑制因子和成纤维细胞生长因子诱导下,获得鸭胚肝间充质干细胞(DuLMSC)。接种DPV疫苗株C-KCE后,结果显示:F1~F10代均能稳定出现CPE;将F10病毒接种细胞24 h后,通过扫描电镜在胞质、胞核及细胞间隙均能够观察到典型的疱疹病毒粒子;F1至F10代均能扩增出DPV UL2基因片段,序列测定结果表明F1、F5、F10代的扩增产物与NCBI中公布的DPV株(EU082088)的核苷酸同源性为100%;组织培养半数感染量和一步生长曲线结果表明,源自B4系单倍型鸭的DuLMSC细胞系增殖DPV的病毒含量明显高于B1、B2和B3系。本研究为稳定培养鸭瘟病毒提供了优良稳定的实验材料。     

几种动物病毒的基因芯片检测技术

分别用水疱性口炎病毒、蓝舌病病毒、口蹄疫病毒、猪瘟病毒、牛病毒性腹泻病毒、鹿流行性出血热病毒和赤羽病病毒各一段高度保守的基因片段构建质粒 ,在此基础上制备了芯片探针。提取样品中的核酸 ,经反转录和荧光标记后滴加到芯片上进行特异性杂交 ,对杂交结果扫描检测 ,可同时对上述 7种动物传染病进行快速、准确的诊断 ,此方法敏感性高 ,特异性强 ,适合于大批动物高通量检疫。     

尼帕病毒病及其病原的研究进展

概述了尼帕病毒病在国外的流行状况、尼帕病毒(Nipah virus,NiV)的变异及我国的研究现状,着重阐述了近年来在其基础病毒学、诊断技术及防治方面的研究进展,主要包括病毒蛋白的功能及其相互作用、受体的发现、动物模型、荧光PCR及ELISA诊断技术、抑制NiV感染及治疗等方面的研究成果,为该病的深入研究提供了参考。     

表达狂犬病病毒CVS-11株糖蛋白的重组伪狂犬病病毒在犬体内的免疫效果

为研制一种新型有效的狂犬病重组活载体疫苗,将EGFP-rgp的表达框克隆入p8-AA载体的Sph Ⅰ/Nde Ⅰ酶切位点处,将酶切鉴定为正向连接的阳性重组子命名为p8AA-EGFP-rgp.在质脂体介导下将该质粒与Bartha-K61共转染PK-15细胞,获得能够表达狂犬病病毒(RV)CVS-11株糖蛋白的重组伪狂犬病病毒rPRV/EGFP-rgp,经RT-PCR和Western-blot鉴定后对犬进行肌肉注射免疫,并测定相应试验指标,研究重组病毒对犬的免疫诱导情况.结果显示,重组病毒可以有效地刺激机体产生体液免疫和细胞免疫;产生的针对RV的中和抗体水平[(0.95±0.21)U/mL]在14周时还保持相对国际最低保护标准(0.5U/mL)较高的水平;且产生的针对RV和PRV的中和抗体水平均达到了相应灭活疫苗和减毒活疫苗的水平,抗体效价均维持在14周以上.     

H5N1亚型禽流感病毒NA基因在重组禽痘病毒中的表达及其产物的免疫原性

将禽流感病毒A/Goose/Guangdong/1/96(H5N1)株的NA基因及LacZ报告基因克隆到禽痘病毒载体pSY681中,构建重组转移载体pSY(NA+LacZ),将其转染鸡胚成纤维细胞,经蓝白斑筛选,纯化表达NA基因的重组禽痘病毒rFPV-NA,用其免疫SPF鸡,检测该重组禽痘病毒的免疫原性。结果显示,该重组禽痘病毒能够在体外培养细胞内表达具有生物学活性的NA蛋白,表达产物的分子质量约为55 ku;用该重组禽痘病毒免疫SPF鸡后,能够使免疫鸡获得对H5N1和H7N1两种亚型HPAIV攻击的部分保护。表明,重组禽痘病毒rFPV-NA具有良好的免疫原性。     

病毒受体及其研究进展

介绍了病毒受体的基本生物学特性,重点阐述了噬菌体展示、免疫共沉淀及酵母双杂交等病毒受体研究方法,综述了几种重要动物病毒细胞膜受体的研究进展,并对病毒受体研究的发展前景进行了展望。     

LncRNA9606对猪流行性腹泻病毒复制的影响

长链非编码RNA(lncRNA)是一种长度大于200 nt的非编码RNA分子,在调节多种生命活动中起着重要作用。本团队前期研究发现,宿主的lncRNA表达谱在猪流行性腹泻病毒(PEDV)感染后发生显著变化。本研究选择其中一条差异表达的LncRNA TCONS_00009606(LncRNA9606),以研究它对PEDV复制的影响。为此,本研究首先检测LncRNA9606在PEDV感染后不同时间点的动态表达变化。结果,PEDV感染显著上调LncRNA9606的表达。随后对猪肠上皮细胞、派伊尔氏淋巴集合结以及外周血单个核细胞中LncRNA9606的表达丰度进行了分析,结果显示派伊尔氏淋巴集合结和外周血单个核细胞中的LncRNA9606含量显著高于小肠上皮细胞系细胞,并主要定位于细胞核中。在LLC-PK1细胞中过表达LncRNA9606后,PEDV复制水平显著降低。由此可见,LncRNA9606可在LLC-PK1细胞中抑制PEDV病毒的复制。     

屠宰猪肝和血清中乙型肝炎病毒及戊型肝炎病毒的检测

应用1对乙型肝炎病毒(HBV)S基因保守区的引物,采用PCR方法从屠宰猪肝、血清中检测到了HBV,序列分析表明,扩增片段与已发表的HBV S基因的同源性高达98%~100%。电镜负染色样品观察结果表明,在HBV表面抗原ELISA检测强阳性反应的血清样品中存在有形态、大小与人HBV Dane颗粒和小球状颗粒相似的病毒粒子。针对戊型肝炎病毒(HEV)ORF2/ORF3重叠区设计了简并引物,采用巢式RT-PCR对屠宰猪肝和血清样品进行了检测。结果表明,部分屠宰猪肝中存在HEV。     

应用PCR检测羊接触传染性脓疱性皮炎病毒

设计合成了 1对引物 ,建立用于检测羊接触传染性脓疱性皮炎病毒的PCR方法。结果表明 ,PCR对羊接触传染性脓疱性皮炎病毒细胞培养毒的检测与细胞培养CPE、电镜检测的结果相一致。经对扩增产物进行序列分析 ,与已报道NZ 2株的核苷酸序列同源性高达 97%。用此PCR方法扩增羊痘病毒、口蹄疫病毒、蓝舌病病毒 ,结果均为阴性。此方法用于检测羊接触传染性脓疱性皮炎病毒是可行的、特异的     

猪传染性胃肠炎病毒的血凝作用

将猪传染性胃肠炎病毒（ＴＧＥＶ）Ａ株在ＩＢＲＳ２细胞上增殖，培养物经差速离心浓缩后与鸡红细胞出现了高凝集价（２８），这种凝集作用能被兔抗ＴＧＥＶ高免血清所抑制。试验的最适反应条件为体积分数０．５０％红细胞４℃作用１ｈ。通过反复试验，建立了一种简单实用的血凝抗原制备方法，病毒培养液不需浓缩可直接应用。     

鸡马立克氏病病毒HC135分离株的致病性

从辽宁省某鸡场疑似马立克氏病发病鸡外周血淋巴细胞中分离到1株适应鸭胚成纤维细胞生长的马立克氏病病毒(MDV),经蚀斑克隆和细胞传代,成功培育了1株增殖性能稳定的MDV细胞毒株,命名为HC135株;将HC135株第4代细胞培养物分别人工感染非免疫和不同疫苗免疫的SPF鸡,分析其对鸡的致病力,分离毒株攻毒对照组鸡的发病率为100%(10/10),死亡率为30%(3/10);HVT疫苗及HVT/SB1双价疫苗对分离毒株的保护指数分别为22.2和40.0。结果表明,该毒株可以突破HVT疫苗和HVT/SB1双价疫苗的免疫保护,具有特超强毒株(vv+MDV)的特点;也证实了我国商品鸡群中存在vv+MDV毒株。同时比较了HC135株与14株参考毒株的Meq基因序列,发现其Meq基因的ORF内没有基因片段的插入或缺失,推导的氨基酸存在点突变,这种突变符合高毒力毒株的变异规律。