抗O型口蹄疫病毒单克隆抗体的制备及其生物学特性分析

用灭活O型口蹄疫病毒为抗原免疫BALB/c小鼠4次后,取致敏的脾B淋巴细胞和SP2/0小鼠骨髓瘤细胞进行融合,在HAT选择培养基中培养2周,经间接ELISA法筛选,最终获得了3株抗O型FMDV的阳性杂交瘤细胞株,命名为2F1、2G7和6H4。血清学试验证明该McAbs能与FMDV抗原结合,具有高度特异性。     

口蹄疫病毒O型和A型交互反应性单克隆抗体的筛选与鉴定

不同血清型口蹄疫病毒(FMDV)之间不能产生交叉免疫保护,但是血清学的交叉反应确实存在。本研究旨在建立一种筛选型间交互反应性抗体的方法,以期为解析FMDV血清型间保守的抗原结构奠定基础。本方法主要依据单个B细胞抗体技术,首先采用两种不同的荧光染料FluoProbes 647H和Pacific Blue分别标记O型与A型FMDV 146S灭活抗原,然后利用流式细胞分选技术,从免疫牛外周血单个核细胞(PBMCs)中分选出结合两种抗原的特异性B细胞,通过单个B细胞抗体基因测定,获得Ig G抗体重链与轻链可变区编码序列,并将可变区基因插入含有牛IgG抗体恒定区的pcDNA3.4载体中,构建IgG抗体的重链与轻链表达质粒。将重链与轻链表达质粒共转染中国仓鼠卵巢悬浮细胞(CHO-S)进行完整抗体表达。结果显示,通过该方法获得了5株FMDV特异性单克隆抗体,其中4株(H64、R82、I16、R29)经间接免疫荧光(IFA)检测都可特异性识别O和A型FMDV;ELISA结果显示,H64、R82、I16与O、A型抗原均具有较好的亲合力;Western-blot结果显示,I16可特异性结合O、A型FMDV结构蛋白VP2中的线性表位,说明在衣壳蛋白VP2上存在血清型间保守的抗原表位,通过本研究进一步加深了对FMDV抗原结构的认识。     

口蹄疫病毒非结构蛋白3A单克隆抗体的制备和鉴定

以原核表达并纯化的口蹄疫病毒(FMDV)非结构蛋白3A免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行融合,用间接ELISA方法筛选杂交瘤细胞,有限稀释法进行亚克隆,获得3株能稳定分泌抗3A蛋白单抗的杂交瘤细胞,分别命名为3H2、4B1、7F5,并对这3株单抗进行了生物学鉴定。结果显示,单抗3H2和4B1为IgG2a亚型,7F5为IgG2b亚型。单抗7F5针对的表位与3H2和4B1两株单抗的表位不一致;这3株单抗均能够与FMDV特异性结合,且单抗4B1与所有3A相关蛋白均反应。稳定性鉴定结果表明,获得的3株杂交瘤细胞均能稳定分泌单克隆抗体。研究结果为进一步探索3A蛋白的结构和功能以及建立诊断方法奠定了基础。     

高浓度口蹄疫病毒抗原的稀释试验

用预备试验初选的 4种稀释剂a、b、c、d ,对经浓缩培养法繁殖的牛、猪O型口蹄疫病毒进行稀释 ,使其与普通毒 (对照 )浓度相当。然后将其与普通毒一起在不同温度下放置不同时间后 ,测定TCID50 ,并对测定结果进行方差分析和多重比较。结果显示 ,4种稀释剂稀释的病毒TCID50 存在显著差异 ;a和b稀释的病毒TCID50 之间无显著差异 ,但均显著高于c和d稀释的病毒TCID50 ;a和b稀释的病毒与普通对照毒的TCID50 也无显著差异。表明 ,a和b均可用于稀释口蹄疫病毒抗原 ,考虑到成本 ,宜选用b。     

O型口蹄疫病毒VP1基因和牛集落刺激因子基因的融合表达

将O型口蹄疫病毒VP1基因和牛集落刺激因子(GMCSF)成熟肽基因共同克隆到原核表达载体pGEX6P1中,转化RS21后经IPTG诱导,实现了重组融合蛋白BoGMCSF/VP1在大肠埃希氏菌RS21中的高效表达,表达产物经SDSPAGE和Westernblotting分析,重组的蛋白质分子质量约为66ku,与预期大小相符。表达蛋白占菌体总蛋白的30%,表达产物以包涵体形式存在;包涵体提取物经变性复性,用透析方法提纯,得到高纯度的表达蛋白。     

表达O型口蹄疫病毒VP1中和表位的重组猪圆环病毒2型毒株的构建及其生物学特性

为构建以猪圆环病毒2型(PCV2)为载体,表达O型口蹄疫病毒(FMDV)中和表位的重组病毒,将FMDV-VP1蛋白中和抗原表位(第141～160位氨基酸)插入PCV2-ORF2编码的Cap蛋白C-末端,利用感染性克隆技术拯救出1株表达FMDV-VP1的中和抗原表位PCV2重组毒株(命名为recPCV2-CL-VP1);采用免疫过氧化物酶单层试验、捕获ELISA和免疫电镜技术鉴定该重组病毒。结果表明,在重组病毒感染细胞中检出PCV2特异性抗原及VP1表位抗原;重组病毒的形态学特征与亲本病毒相似,可采用PCR和ELISA法相鉴别;拯救毒株的繁殖能力较亲本毒差,经细胞连续传10代,体外培养增殖性能稳定。证实成功构建了1株表达FMDV-VP1中和抗原表位的PCV2重组病毒,为进一步研制基因工程疫苗奠定了基础。     

兔出血症病毒单克隆抗体的制备及鉴定

为建立兔出血症病毒(RHDV)的检测方法及为变异株监测做储备,用蔗糖密度梯度离心法纯化的RHDV免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0细胞进行融合,以昆虫细胞一杆状病毒表达的重组VP60蛋白建立的间接ELISA法筛选抗RHDV单克隆抗体杂交瘤细胞,并对其主要生物学特性进行了鉴定.结果表明,筛选出6株单抗,它们分属于IgG1(AD4,AG10,DE2)、IgG2b(BC9,BE8)和IgM(BH3)亚类;这6株单抗杂交瘤细胞的平均染色体数为87～89条,将其冻存6个月后复苏,在体外传20代的过程中分泌的抗体效价变化不大,具有很好的稳定性;Western-blot及免疫荧光分析表明,单抗DE2、AG10识别线性表位,其余4株单抗识别构象型表位;竞争ELISA试验表明,这6株单抗可识别5种抗原表位.     

猪圆环病毒2型Cap蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

利用重组杆状病毒表达的猪圆环病毒2型(PCV2)Cap蛋白免疫BALB/c小鼠,通过杂交瘤技术,共获得6株能稳定分泌抗Cap蛋白抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为3H9/1H5、3H9/3C7、4A9/3E2、4A9/3D7、6G7/7B6和6G7/8D3,并通过ELISA、Western-blotting和间接免疫荧光试验(IFA)对6株单抗的特性和抗原表位进行分析鉴定。结果显示,6株杂交瘤细胞培养上清的抗体效价为1∶1 024～1∶2 048,腹水效价为1∶163 840～1∶204 800。3H9/1H5、3H9/3C7、6G7/7B6和6G7/8D3的亚型为IgG1型,4A9/3E2和4A9/3D7为IgG2b型,所有单抗的轻链均为κ型。Western-blotting和IFA结果表明6株单抗均能与重组Cap蛋白和PCV2产生特异性反应。相加ELISA结果显示,6株单抗可能识别不同的抗原表位。为准确鉴别不同单抗针对的抗原位点,以截短表达的重组Cap蛋白为抗原,进行Western-blot鉴定。结果显示,4A9/3E2与4A9/3D7的抗原表位位于101～150aa,其余4株单抗可能针对1～50aa或者天然...     

口蹄疫病毒12S抗原免疫学性质的研究

用口蹄疫病毒（ＦＭＤＶ）Ａ型１２Ｓ基础免疫，Ｏ型１２Ｓ加强免疫的ＢＡＬＢ／ｃ小鼠脾细胞与ＳＰ２／０细胞融合，筛迭，得到了一组群特异性单抗。用ＲＰＨＩ，ＡＧＤ，ＥＬＩＳＡ及阻断式和竞争式ＥＬＩＳＡ分析这组单抗得出以下结论：１２Ｓ抗原至少存在一个１２Ｓ独有的型间交叉的群特异性抗原表位，该表位是非中和性抗原表位，免疫原性较低；这组群特异性单抗可与ＦＭＤＶＯ，Ａ，Ｃ，Ａｓｉａ－１型１２Ｓ发生不同程度的反应，表明该表位存在于ＦＭＤＶＯ，Ａ，Ｃ，Ａｓｉａ－１型１２Ｓ上，但不同血清型的１２Ｓ表位构成存在细微的差别     

口蹄疫病毒受体猪源整联蛋白β6亚基配体结合域单克隆抗体的制备

以纯化的口蹄疫病毒受体猪源整联蛋白β6亚基配体结合域重组蛋白为抗原,免疫雌性BALB/c小鼠,经3次免疫后取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,制备口蹄疫病毒受体猪源整联蛋白β6亚基配体结合域单克隆抗体(McAb);采用有限稀释法和间接ELISA克隆和筛选阳性杂交瘤细胞株,并用SDS-PAGE、间接ELISA以及间接免疫荧光法对制备的McAb的特异性进行鉴定。结果显示,成功获得5株能稳定传代并分泌抗β6亚基配体结合域的杂交瘤细胞株,分别命名为C4C7、E7C7、B8C9、C2D8和B7B6,其分泌的McAb为IgG2b(C2D8)和IgG2a(C4C7、E7C7、B8C9、B7B6)亚类。制备的口蹄疫病毒受体猪源整联蛋白β6亚基配体结合域McAb可为深入研究整联蛋白αvβ6在口蹄疫病毒感染过程中的作用奠定基础。     

抗禽流感H9亚型血凝素单克隆抗体的抗原结合特性分析

为了解和确定抗H9亚型禽流感病毒血凝素单克隆抗体所针对的抗原表位及今后的确切用途,用竞争性结合ELISA试验结合Western-blotting分析,对10株单克隆抗体的抗原结合特性进行了分析。抗体反应增值结果表明,10株单抗针对的是同一大的抗原决定簇,根据增值结果可将10株单抗分成4个亚群。除2A1外,其他9株单抗的ELISA反应增值结果与Western-blot- ting分析结果一致,认为可能是由于2A1与其他9株单抗的免疫原不同所致。     

抗鹅细小病毒NS1蛋白单克隆抗体的制备及对应抗原表位区的分析

以鹅细小病毒非结构蛋白NS1(GPV-NS1)的重组质粒pcDNA3.1-GPV-NS1及纯化的重组蛋白GPV-NS1为抗原,分组免疫4～6周龄的BALB/c鼠,免疫3次后,取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,利用间接ELISA方法筛选阳性杂交瘤细胞株,并研究其部分生物学特性.结果共获得6株能稳定分泌特异性抗体的阳性杂交瘤细胞株.单克隆抗体亚型鉴定结果显示,2株为IgG2a型,4株为IgM型,轻链均为κ链.用制备的单克隆抗体对分段表达的NS1蛋白进行免疫印迹分析,结果鉴定出3个抗原表位区,分别位于NS1蛋白的第453～514 aa、485～542 aa、533～598 aa区段.证实,6株杂交瘤细胞在体外长期培养能稳定地分泌抗GPV-NS1单克隆抗体.     

鹅细小病毒VP1蛋白单克隆抗体的制备及其对应抗原表位区的分析

为获得抗鹅细小病毒(GPV)VP1蛋白的单克隆抗体,以纯化的VP1蛋白为免疫原,免疫4～6周龄的雌性BALB/c鼠,经4次免疫后,取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,共获得5株能稳定分泌特异性抗体的阳性细胞株。Western-blot结果表明,这5株杂交瘤细胞分泌的抗体均能特异地与纯化后的GPV-VP1重组蛋白发生反应,单克隆抗体亚型鉴定结果表明,3株单抗为IgG1亚型,1株单抗为IgG2b亚型,1株单抗为IgA亚型,轻链均为κ链。用单克隆抗体对分段表达的VP1蛋白进行免疫印迹分析,结果鉴定出3个抗原表位识别区,分别位于VP1的第92～123、92～145和111～145aa。证实,这5株杂交瘤细胞在体外长期培养能稳定地分泌抗GPVVP1的单克隆抗体。     

抗新城疫单克隆抗体的制备与特异性分析

以蔗糖反透析浓缩及ＳｅｐｈａｄｅｘＧ 200层析纯化Ｆ48Ｅ8和ＬａＳｏｔａ新城疫病毒(ＮＤＶ),取纯化的病毒液免疫接种ＢＡＬＢ ｃ小鼠,将小鼠脾细胞与ＮＳ 1骨髓瘤细胞融合,经次黄嘌呤、氨基喋呤和胸苷(ＨＡＴ)培养基选择,间接ＥＬＩＳＡ检测,有限稀释法克隆,筛选出了3株杂交瘤细胞,依次命名为1Ｄ4、1Ｄ5、16Ｇ12。3株杂交瘤细胞的染色体数为80～100,并能稳定传代,其产生的单克隆抗体重链属于ＩｇＧ1,轻链属于κ链;ＥＬＩＳＡ检测时仅与ＮＤＶ发生特异性反应,而与其他常见禽类病毒抗原不出现交叉反应,应用这些单克隆抗体对ＮＤＶ分离株进行了分群研究。