产志贺毒素大肠杆菌的RPA-LF快速检测方法的建立

为建立一种快速检测产志贺毒素大肠杆菌的基于侧流层析的重组酶聚合酶扩增技术(RPA-LF)方法,以志贺毒素stx1和stx2基因序列为靶序列,设计了用于RPA-LF方法的特异性引物及探针,并对RPA-LF反应条件进行优化.结果显示,针对stx1和stx2基因的最佳反应温度分别为39℃和37℃,最佳反应时间分别为10min...     

病毒性出血败血症病毒实时荧光RT-RPA恒温检测方法的建立

为建立一种简单、快速的病毒性出血败血症病毒(VHSV)检测方法,本研究通过比较分析VHSV N基因的保守序列,设计了多对引物和一条探针。经过筛选优化,建立了实时荧光RT-RPA检测方法。该方法在39℃恒温反应20 min即可快速、特异性地检测出VHSV,与其他水生动物病毒不发生交叉反应,该方法检测限为1.83×10^3PFU/mL,利用本研究方法对30份鲑鳟鱼临床样品以及9份鱼类疫病病原样品进行检测,检测结果与荧光定量PCR方法结果一致。上述结果表明,本研究建立的检测方法操作简单,反应灵敏,结果可靠,仪器依赖性低,适用于现场对VHSV快速检测。     

猫疱疹病毒Ⅰ型RAA检测方法的建立与应用

为建立一种快速检测猫疱疹病毒Ⅰ型(FHV-1)的方法,本研究根据GenBank上登录的FHV-1 UL55序列设计特异性探针及引物,筛选最佳引物对,建立了FHV-1的重组酶介导等温扩增(RAA)检测方法。该方法在39℃反应20 min即可快速、特异性地检测FHV-1。灵敏性试验结果显示,RAA最低检测限为7.60×10¹ copies/μL,比普通PCR最低检测限高100倍。特异性试验结果显示,该RAA方法与猫杯状病毒、猫传染性腹膜炎病毒、猫细小病毒无交叉反应。对34份临床样本进行检测,其中13份为阳性,阳性检出率为38.23%。综上所述,本研究成功建立了猫疱疹病毒Ⅰ型RAA检测方法。     

阿卡斑病毒荧光RT-RAA快速检测方法的建立及初步应用

为建立一种快速检测阿卡斑病毒(AKAV)的分子生物学检测方法,本研究通过比较分析AKAV基因组序列,在S基因保守序列区域设计重组酶介导等温扩增(RAA)引物及探针,筛选最佳引物对,然后对RAA反应温度、引物浓度以及探针浓度进行优化,建立了AKAV的荧光逆转录重组酶介导的核酸等温扩增(RT-RAA)快速检测方法。结果显示,所建立的荧光RT-RAA方法在42℃反应20 min即可快速检测出AKAV,检测下限可达6.26×10¹copies/μL,与牛病毒性腹泻病毒、蓝舌病毒、伪狂犬病病毒、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒等无交叉反应,并具有良好的重复性。对37份临床样品进行检测,阳性检出率为43.24%,与RT-qPCR检测结果符合率为94.59%。结果表明,建立的AKAV荧光RT-RAA快速检测方法具有快速、特异、灵敏、稳定等特点,可为AKAV的现场快速检测提供可靠方法。     

非洲猪瘟病毒实时荧光RAA检测方法的建立

为了建立非洲猪瘟病毒(ASFV)简捷、高效的基层临床检测方法,本研究选取非洲猪瘟病毒保守基因B646L(P72)序列,设计特异性引物和探针,建立非洲猪瘟病毒实时荧光重组酶介导等温扩增(RAA)检测方法.结果显示,所建立方法与OIE推荐的荧光定量PCR方法灵敏度相当,低至10 copies/μL,检测时长仅需10min,...     

牛布氏杆菌间接ELISA检测方法的建立

采用原核表达并纯化的布氏杆菌周质蛋白BP26作为包被抗原,建立了检测牛布氏杆菌血清抗体的间接ELISA(iELISA)方法。用建立的iELISA方法对138份临床奶牛血清样本进行了检测,并与虎红平板凝集试验(RBPT)和套式PCR(nested-PCR)进行了比较。结果表明,所建立的iELISA与RBPT和nes-ted-PCR的符合率分别为97.82%和98.55%。尽管该方法的敏感性略低于nested-PCR,但用iELISA检测病牛血清的阳性率可达93.00%。该iELISA方法可作为一种有效的牛布氏杆菌病血清学诊断的备用方法。     

罗非鱼湖病毒逆转录重组酶介导链替换扩增（RT-RAA）快速检测方法的建立

为建立针对罗非鱼湖病毒(TiLV)的逆转录重组酶介导链替换扩增(RT-RAA)快速检测方法,在NCBI建立的核酸序列数据库GenBank中获取TiLV全基因序列,以其假定蛋白基因片段为依据,设计上游引物3个、下游引物3个(交叉构建9组引物组合)和1条探针。构建TiLV的RNA标准品、筛选引物组和优化扩增温度后,分析该方法的特异性、灵敏性和重复性。结果显示,在TiLV RNA标准品基础上,确定F1/R3引物组和最佳温度为39℃,于20 min的短时间内,该方法即可检测出TiLV。该方法特异性强、灵敏度高,检测下限达到5.2×10⁰copies/μL。30份临床样品中共检出2份阳性样品,检测结果与荧光定量RT-PCR结果相符。结果表明,本研究建立的RT-RAA检测方法可操作性强,重复性好,适用于TiLV的现场快速检测。     

伪结核棒状杆菌可视化LAMP现场检测方法的建立

为建立伪结核棒状杆菌可视化LAMP检测方法,根据伪结核棒状杆菌16S rRNA基因的特异性保守核苷酸序列设计2对引物,通过反应体系和反应条件的优化,建立了伪结核棒状杆菌可视化LAMP现场检测方法,并评价该方法的特异性和敏感性。结果显示,本实验所建立LAMP方法的最佳反应条件为62℃1 h。利用该方法检测大肠杆菌、肠炎沙门菌、金黄色葡萄球菌等山羊和绵羊常见的15种细菌的DNA样品,结果显示仅伪结核棒状杆菌检测为阳性,其他细菌检测为阴性。该方法对阳性质粒标准品pMD19-Cory的最低检出浓度为4.7 copies/μL。应用建立的LAMP方法和普通PCR方法对128份山羊皮下脓肿样品进行检测,结果显示LAMP方法和普通PCR方法的阳性率分别为21.1%(27/128)和20.3%(26/128),2种检测方法的总符合率为99.2%(127/128)。结果表明,本研究建立的可视化LAMP检测方法具有特异性强、敏感性高、快速的优点,为山羊和绵羊伪结核棒状杆菌感染的可视化现场快速诊断提供可行方法。     

重组酶聚合酶扩增技术结合胶体金试纸条检测新城疫病毒方法的建立及应用

本研究旨在根据鸡新城疫病毒（Newcastle disease virus）F基因序列,利用Oligo 7设计RPA引物以及nfo探针,建立快速检测新城疫病毒的结合胶体金试纸条的RPA检测方法。在试验中,对探针浓度、引物浓度、反应温度、反应时间进行了优化;并将检测结果与荧光RT-PCR商品化试剂盒的检测结果进行了比较。结果显示,本方法采用50μL体系,37℃20 min即可对新城疫病毒F基因进行快速检测。该方法灵敏度高,特异性强,重复性好,检测结果与荧光RT-PCR商品化检测试剂盒检测结果一致,为养殖场检测新城疫病毒提供了一种简便可靠的检测方法。     

猪链球菌血清2型环介导等温扩增快速检测方法的建立

为了建立快速、灵敏的猪链球菌血清2型(SS2)LAMP检测方法,根据GenBank登录的SS2特异的荚膜多糖(cps2 H)基因序列作为检测靶标,在其序列的保守区域设计LAMP引物,利用参考菌株S735基因组DNA为模板进行扩增,优化了LAMP的反应条件和反应体系,并进行了敏感性、特异性和重复性试验。结果,利用建立的LAMP方法对SS2进行扩增,扩增产物显色呈现阳性反应,电泳出现阶梯状条带,最低检测量为0.186fg/μL模板DNA,比常规PCR高1 000倍;且与其他常见的细菌无交叉反应。结果表明,建立的LAMP方法具有灵敏、特异、快速和重复性强等优点,适用于猪链球菌病的实验室快速检测。     

鸭疫里氏杆菌外膜微孔蛋白基因的克隆和序列分析及PCR检测方法的建立

根据GenBank中的鸭疫里氏杆菌(RA)外膜磷酸盐选择性微孔蛋白(Porin)基因序列设计特异性引物,以血清1、2、6、10、11、13、14和17型RA菌株的基因组DNA为模板均扩增出大小为1 212bp的目的片段,序列比对显示该基因在8种血清型菌株间同源性均大于99.6%。针对保守性最高的357bp片段设计特异性引物,建立了PCR检测方法,对鸭致病性大肠杆菌、鼠伤寒沙门菌、鸭巴氏杆菌及鸭肝炎病毒均未扩增出目的条带,表明该方法具有较高的特异性;敏感性试验显示最小检出量为73.96pg的基因组。应用建立的PCR方法对分离自吉林、河北及北京的8个菌株进行扩增,均在357bp处扩增出清晰的目的条带,与细菌分离鉴定的符合率达100%。本研究为RA的鉴定提供了新方法,为RA外膜微孔蛋白的后续研究提供了理论依据。     

猪圆环病毒3型RAA检测方法的建立及初步应用

为建立猪圆环病毒3型(PCV3)的快速简便检测方法,根据PCV3 Cap基因的保守序列设计多对引物和探针,建立了一种实时荧光RAA检测方法.通过筛选引物和优化试验条件,验证对常见动物疾病病毒的特异性,并与PCR方法在敏感性上进行比较.结果 表明,PCV3与猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆...     

光滑型布鲁杆菌抗体竞争ELISA检测方法的建立

用提纯的布鲁杆菌疫苗株M5-90光滑型脂多糖(S-LPS)作为包被抗原,以针对S-LPS C表位的单抗16C5为竞争抗体,建立了检测光滑型布鲁杆菌血清抗体的cELISA方法.通过对临床507份牛血清样本进行检测,结果经统计分析表明,cELISA与RBT和IDEXX公司的iELISA试剂盒符合率分别为84.7%和91.2%.其中142份样品与Svanova公司的cELISA试剂盒和黑龙江省动物监察所提供的iELISA试剂盒的符合率分别为97.2%和94.4%.κ统计显示,该cELISA方法与RBT、IDEXX公司的iELISA试剂盒、Svanova公司的cELISA试剂盒和黑龙江省动物监察所提供的iELISA试剂盒的κ值均大于0.5,符合率很高.该cELISA方法为布鲁菌病的检测提供了一种有效的血清学方法,并且能够有效地排除常见的革兰阴性菌引起的假阳性结果.     

牛布氏杆菌和副结核分枝杆菌双重PCR检测方法的建立

为快速检测牛布氏杆菌和副结核分枝杆菌,根据GenBank中的布氏杆菌OMP31基因序列(JF918757)及副结核分枝杆菌ISMav2基因序列(AF286339)设计、合成2对特异性引物,通过对PCR条件的优化,建立了快速鉴别检测牛布氏杆菌和副结核分枝杆菌的双重PCR方法。经对建立的方法进行特异性和敏感性试验,结果表明,分别扩增出602、246bp的特异性牛布氏杆菌和副结核分枝杆菌DNA目的条带,作为对照的双芽巴贝斯虫、大肠杆菌、沙门氏菌、弓形虫、链球菌、牛放线菌的DNA及其混合物均未扩增出任何条带。牛布氏杆菌与副结核分枝杆菌的最低检测限分别为1.92和2.51pg;牛肉样品中人工污染的牛布氏杆菌和副结核分枝杆菌的检测敏感性分别为6×104和7×104 CFU/mL。该双病原检测体系的成功建立为牛布氏杆菌病及副结核病的检测、鉴定和流行病学调查提供了有力的技术支持。     

食品中沙门氏菌DNA环介导等温扩增快速检测方法的建立

根据沙门氏菌属高度保守的fimY基因序列设计了2对特异性引物,采用环介导等温扩增方法(LAMP)建立了食品中沙门氏菌的LAMP快速检测方法。结果表明,建立的LAMP方法具有高度特异性,经对40种共68株细菌进行扩增,所试32株沙门氏菌均为LAMP阳性,其他菌株为LAMP阴性。建立的LAMP方法对培养的沙门氏菌的检测灵敏度为5CFU/管,对污染食品中沙门氏菌的检测灵敏度为9CFU/管,60min内即可完成检测。用建立的LAMP方法对802份肉类、蛋、奶及其制品和动物腹泻物、人工污染样品等进行检测,共检出165份LAMP阳性样本,与国标(GB/T4789.4-2008)方法的检测结果一致。建立的LAMP方法操作简便、特异性强、灵敏度高,具有良好的实用性。     

结核分枝杆菌与牛分枝杆菌PCR快速鉴别检测方法的建立

根据结核分枝杆菌与牛分枝杆菌基因组的比对分析结果,针对结核分枝杆菌与牛分枝杆菌153bp、RD10和TbD1的3处差异缺失区域设计引物,分别建立了结核分枝杆菌与牛分枝杆菌PCR快速鉴别检测方法.应用建立的3种方法分别对84株结核分枝杆菌、3株牛分枝杆菌、51株非结核分枝杆菌及9种其他常见菌株进行了检测.结果显示,用针对153 bp缺失片段建立的PCR方法分别在结核分枝杆菌及牛分枝杆菌中扩增出645 bp及492 bp的目的条带;用针对RD10、TbD1建立的PCR方法分别在结核分枝杆菌及牛分枝杆菌中扩增出478 bp及361 bp的目的条带、358 bp及524 bp的目的条带.这3种PCR检测方法的准确率和特异性均为100%.敏感性试验结果显示,这些检测方法对结核分枝杆菌和牛分枝杆菌基因组DNA的检测极限均为10 pg.表明,此方法可用于牛源或人源结核分枝杆菌及牛分枝杆菌的快速鉴别检测.     

H5亚型禽流感病毒RT-LAMP快速检测方法的建立

根据GenBank中登录的H5亚型禽流感病毒(H5-AIV)血凝素基因序列,设计了1套特异识别HA基因序列中6个不同区段的环介导恒等温扩增(LAMP)引物,并以此套引物建立了一种基于LAMP技术的H5亚型禽流感病毒诊断方法。结果表明,该方法对H5-AIV RNA的最小检测限为10-6,灵敏性高于一步RT-PCR方法;全部反应可在1.5 h内完成;在反应体系中添加SYBR GREENⅠ染料后,可通过肉眼观察有无荧光直接判定结果。灵敏性及特异性试验证明,该方法灵敏度高、特异性好,能够作为H5亚型禽流感病毒的快速诊断方法。     

副猪嗜血杆菌抗体间接ELISA检测方法的建立与应用

采用超声裂解的副猪嗜血杆菌菌体上清作为包被抗原,建立了检测副猪嗜血杆菌抗体的间接ELISA方法.通过对试验条件进行筛选优化,确定了最佳反应条件:抗原包被浓度80μg/mL;37℃作用2 h后4℃过夜包被,待检血清的稀释度为1:320,抗原抗体反应时间为1 h,酶标二抗稀释度为1:15 000,作用时间为1 h,底物显色时间为15 min.待检血清S/N值≥2.5时判为阳性,S/N值<2.5时判为阴性.特异性、重复性和敏感性试验以及对200份送检血清的检测结果表明,建立的间接ELISA方法的特异性和重复性良好,敏感性比间接血凝试验高,可用于副猪嗜血杆菌的检疫和流行病学调查.     

副猪嗜血杆菌抗体间接血凝检测方法的建立及应用

将副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,HPS)血清型4、5型分离菌株经超声波破碎处理后的产物致敏醛化红细胞,建立了检测HPS抗体的间接血凝试验方法。最适反应条件为绵羊红细胞30℃醛化5 h,4、5型菌株浓缩抗原以1∶8稀释致敏红细胞。免疫猪2周后检出率达89%。对15种HPS血清型阳性血清进行检测,结果均为阳性;对猪瘟病毒、口蹄疫病毒、猪圆环病毒、猪细小病毒、猪伪狂犬病病毒、猪生殖与呼吸综合征病毒、猪肺炎支原体、猪链球菌、猪肺疫巴氏杆菌、Ⅰ相支气管败血波氏杆菌及胸膜肺炎放线杆菌阳性血清进行检测,结果均为阴性。敏感性为琼脂扩散试验的16倍。对1 665份猪血清进行检测,阳性率为47.1%。结果表明,该方法敏感性较高,特异性强,重复性好,可用于疫苗免疫后抗体水平的检测及副猪嗜血杆菌的流行病学调查。     

猪瘟病毒RT-LAMP检测方法的建立

利用逆转录环介导等温核酸扩增技术(RT-LAMP),建立了猪瘟病毒快速检测方法,同时评价了该方法的灵敏性和特异性。结果,根据猪瘟病毒5′端非编码区的一段保守序列设计的LAMP引物能够在65℃下1h内实现目标核酸区段的大量扩增,检测结果可直接用肉眼判断。结果表明,该检测体系具有极高的特异性,只能检测到目标病毒,与其他类似病毒如猪繁殖与呼吸综合征病毒、伪狂犬病病毒、传染性胃肠炎病毒、猪细小病毒和猪圆环病毒2型的核酸等无交叉反应,可检测到1×10-3稀释度的目标病毒核酸量,比普通RT-PCR的灵敏性高10倍。