双峰驼初乳IgG的分离纯化及其向幼驼的转移

通过跟踪检测内蒙古阿拉善双峰母驼初乳IgG和幼驼血清IgG的动态含量,探讨了影响幼驼由母体获得被动免疫的因素。采用硫酸铵沉淀法2次沉淀乳清蛋白,再结合离子交换层析方法,从双峰驼初乳中分离纯化驼IgG;再用SDS-PAGE鉴定其纯度,测定其分子质量;用分离纯化的驼IgG免疫家兔,制备效价至少为1∶32的兔抗驼IgG抗血清,采用单向免疫扩散法测定双峰驼初乳和幼驼血清IgG含量。揭示了初乳IgG向幼驼血液的转移模式,为生产中更好地饲养幼驼提供科学依据。     

腺胃型IBV豫北株的分离鉴定及灭活疫苗的研制

1998年9月,豫北地区一些鸡场的鸡群发生了以腺胃肿胀为特征的传染病.采集腺胃组织进行病原分离,鸡胚传至8代以上时出现典型侏儒化和规律性死亡;鸡胚尿囊液经磷钨酸负染后电镜下观察,可以看到有囊膜和纤突,圆形,直径90-160 nm的病毒粒子;未经处理的分离毒株不能凝集鸡红细胞,经卵磷脂酶C处理后能凝集鸡红细胞,此凝集能特异的被抗分离株超免疫血清所抑制.用分离毒株制备油佐剂灭活疫苗,保护率达100%.建议预防IB时用本地区分离株制成多价灭活疫苗免疫,效果会更好.     

鸡骨钙素多克隆抗体及其间接竞争ELISA试剂盒的制备与应用

为了建立鸡骨钙素间接竞争ELISA检测方法,使用原核表达的重组鸡骨钙素蛋白作为免疫原,免疫4只雄性新西兰大白兔,成功获得兔抗鸡骨钙素多克隆抗体。该抗体能用于Western-blot检测天然骨钙素。以天然提取的鸡骨钙素为包被抗原,葡聚糖A亲和纯化后的兔抗鸡骨钙素多克隆抗体为一抗建立ELISA反应。结果,最佳包被抗原浓度为0.5μg/mL,最佳抗体工作浓度为1∶10 000,标准品浓度在50～0.39ng/mL间,具有较好的线性关系,检测下限为0.34,批间变异系数和批内变异系数分别为10.6%和4%。使用制备的试剂盒测定30个鸡血清样本及其倍比稀释后的血清样本;结果,鸡血清骨钙素浓度为4.42～19.83ng/mL,稀释前与稀释后测定的血清样本浓度相关性r2=0.952。结果表明,制备的鸡骨钙素间接竞争ELISA试剂盒可用于定量检测鸡血清骨钙素含量。     

应用免疫荧光法检测鸡血T、B淋巴细胞值

鸡体的免疫状况与免疫器官及血液中T、B淋巴细胞密切相关。因此,可通过测定血液中淋巴细胞数量的变化,了解鸡的免疫状态。我们试用兔抗鸡胸腺及抗腔上囊血清作为特异性抗体,以羊抗兔荧光抗体作为第二抗体,检测了不同日龄鸡血液中T、B淋巴细胞数量的正常值。介绍如下。 (一)材料和方法 1.抗腔上囊及抗胸腺血清的制备:取25～30日龄来航鸡的腔上囊及胸腺,除去被膜和脂肪,用汉克氏液冲洗后,在有汉克氏液的培养皿中充分剪碎,过滤,滤液用Ficoll—Hv—     

兔源抗IBDV独特型抗体疫苗的制备

用纯化的抗鸡传染性腔上囊病病毒（ＩＢＤＶ）抗体免疫家兔，将所获效价较高（１∶１６）的兔源抗ＩＢＤＶ独特型抗体分别与福氏完全和福氏不完全佐剂按１∶１比例乳化制备成抗ＩＢＤＶ独特型抗体疫苗。用该疫苗免疫迪卡公雏鸡和ＳＰＦ鸡，经用ＩＢＤＶ强毒株以点眼和滴鼻方式攻击，试验组的保护率分别为９８／９８，１００／１００，４９／４９，大群免疫接种的应答率为１００％。     

鸭肠炎病毒ul47基因的原核表达及其抗血清中和活性的鉴定

提取鸭肠炎病毒(DEV)基因组DNA,采用PCR方法扩增获得了DEVul47基因,将该基因片段定向克隆到原核表达载体pET-30a,构建重组质粒pET-30a-ul47,并转化受体菌Rosetta(DE3)pLysS中,经IPTG诱导表达,表达产物用SDS-PAGE分析。结果显示,ul47基因在大肠杆菌Rosetta中获得与预期大小相符的表达蛋白。利用Ni-NTA纯化表达蛋白,制备了兔抗DEV UL47蛋白的多克隆抗体,经琼脂双扩散测定,该抗血清效价为1∶16。间接免疫荧光试验和蚀斑减数中和试验结果显示,DEV UL47蛋白主要定位于感染细胞的细胞质和细胞膜,制备的兔抗DEV UL47多克隆抗体对DEV有中和活性。     

链球菌群特异性IHA的建立和应用

采用链球菌C、D、E 和R 4 个血清群的参考菌株分别经十二烷基硫酸钠(SDS) 法制备群抗原致敏绵羊红细胞与相应的群特异性兔抗血清进行IHA 试验,均能发生特异性血凝反应,并有良好的重复性。血凝反应能够被致敏用的SDS抗原所抑制。IHA 试验中4 个血清群之间血清学反应与环状沉淀试验的结果一致。用以上两种方法对湖北省8 个疫区猪场共222 份血样群特异性抗体检测结果,二者总符合率为85 .78 % 。     

鸭肠炎病毒gB N端(60～110aa)抗原优势区的原核表达及抗血清的制备

以本实验室已克隆的鸭肠炎病毒(DEV)C-KCE株ul27基因序列为模板,设计特异性引物,PCR扩增获得编码鸭肠炎病毒gB N端第60~110aa的目的基因片段,大小为150bp。将目的基因亚克隆至原核表达载体pET-32a(+)中,阳性质粒被命名为pET-32a(+)-gB-1。经IPTG诱导,SDS-PAGE分析表明,重组蛋白以包涵体形式表达,大小约为27ku。用Ni-NTA柱亲和层析获得纯化的重组蛋白,鸭抗DEV阳性血清经间接ELISA检测证实其具有抗原性,并以此为免疫原免疫家兔制备抗血清,经间接ELISA检测,抗血清效价为1∶25 600。应用间接免疫荧光及Western-blot分析制备的抗血清的反应性,均证实抗血清可特异性识别DEV gB蛋白。分别以重组蛋白和DEV超离病毒为检测抗原进行间接ELISA,检测DEV免疫鸭的抗体消长规律,结果显示两者的抗体变化趋势一致。以上结果表明,制备的抗血清可作为DEV检测的候选试剂,表达的重组蛋白可作为DEV抗体检测的诊断抗原。     

黑龙江省鸭肝炎病毒HD-Ⅰ株的分离与鉴定

从黑龙江省某鸭场疑似鸭病毒性肝炎 (DVH )的发病雏鸭肝等组织中分离到 1株病毒HD Ⅰ株。经病理学检查、电镜观察、鸭胚中和试验、雏鸭保护试验、动物回归试验等鉴定为血清Ⅰ型鸭肝炎病毒 (DHV)。证实引起该鸭场雏鸭发病和死亡的主要原因为DVH所致。用DHV标准R85 95 2毒株多次强化免疫健康鸡 ,获得高效价的鸡抗鸭肝炎超免疫抗体。     

抗鹅细小病毒卵黄IgG的制备及其间接ELISA检测方法的建立

采用水稀释-辛酸-硫酸铵法粗提与DEAE50纤维素层析相结合的方法从免疫鹅细小病毒(GPV)的鹅卵内提取鹅卵黄IgG,通过核酸蛋白检测仪和SDS-PAGE测定IgG的浓度和纯度后,制备兔抗鹅IgG酶标抗体;建立了针对GPV的间接ELISA抗体检测方法,确定其最佳工作条件,并对该ELISA的特异性及重复性进行检测;应用该间接ELISA检测了GPV VP3基因疫苗的免疫效果。结果显示,获得的纯化鹅卵黄IgG浓度为10mg/mL,抗体纯度达到94.5%,兔抗鹅IgG的血清琼脂扩散效价约为1∶32;经筛选确定该ELISA的最佳工作条件为:最适抗原包被浓度为20μg/mL,最适血清稀释度为1∶100,酶标抗体的最佳工作浓度为1∶3 000。用建立的间接ELISA检测禽流感病毒、新城疫病毒、传染性支气管炎病毒、传染性法氏囊炎病毒、鸭肝炎病毒、鸭瘟病毒的阳性血清均为阴性,表明该方法特异性强、重复性好。经临床初步应用,能检出GPV VP3基因疫苗产生的抗体,在肌肉注射100μg与200μg基因疫苗的鹅血清中,IgG均从第14天开始上升,并分别在第35、21天达到最大值。表明本试验制备的兔抗鹅IgG酶标抗体具有较好的应用价值。     

水貂肠炎病毒VP2基因的原核表达及多克隆抗体的制备

利用原核表达系统表达水貂肠炎细小病毒(MEV)VP2衣壳蛋白,以制备抗VP2超免疫血清。根据VP2的基因序列,设计1对特异性引物,以MEV全基因组重组质粒p B-MEV-L为模板,利用PCR技术扩增出MEV VP2片段,并定向克隆到pET-32a载体中,经酶切与序列测定,证明成功构建了VP2基因原核表达质粒pET-MEV-VP2。将其转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导后实现了高效表达。免疫印迹试验表明,获得的重组蛋白具有较好的反应原性。以该蛋白为免疫原免疫新西兰兔,制备抗血清,四免后用ELISA方法检测其效价达到1∶1 024。免疫荧光试验证明,获得的抗体具有良好的结合活性。为MEV的病原生物学研究奠定基础。     

Ⅰ群禽腺病毒抗体间接hexon-ELISA检测方法的建立

为建立一种检测Ⅰ群禽腺病毒(FAVⅠ)抗体的间接ELISA方法,以FAVⅠhexon重组蛋白作为包被抗原,优化反应条件,建立了FAVⅠ抗体间接hexon-ELISA检测方法。抗原最佳包被浓度为10.0μg/mL,最适包被条件为37℃2h加4℃过夜;最佳封闭液为50g/L脱脂乳;血清最佳稀释度为1∶100,最佳作用时间为75min;酶标二抗最佳工作浓度为1∶2 000,最佳作用时间为45min;hexon-ELISA阴性、阳性临界值为0.379。用建立的hexon-ELISA方法检测100份鸡血清样品,阳性率为45%。结果表明,建立的hexon-ELISA方法简便、快捷,可大批量检测,具有良好的特异性、敏感性和重复性,适用于FAVⅠ的诊断、抗体水平监测及流行病学调查。     

云南省鸽Ⅰ型副黏病毒的致病性研究

用鸽Ⅰ型副黏病毒地方分离株KM 1感染鸽 ,在 5～ 7d复制出与自然病例相似的症状 ,且感染鸽全部发生血清学抗体转换 ;将KM 1静脉接种 6周龄雏鸡 ,10d后血凝抑制 (HI)效价显著增高 ,且其静脉接种致病指数 (IVPI)为 0 ;用鸡新城疫病毒LaSota株感染鸽 ,第 8d出现临床症状 ;病毒能在 9日龄鸡胚中增殖 ,并使鸡胚出现病变 ,尿囊液血凝 (HA)效价为 1∶2 0 ～ 1∶2 5。     

鸭病毒性肝炎病毒分离和血清型鉴定

从病鸭出现特异性神经症状,死时呈现典型角弓反张姿势,剖检以肝肿大、出血为主要特征疫病的病死雏鸭肝脏分离到一株鸭肝炎病毒(称DHV-N株)。使用工型鸭肝炎病毒抗血清,通过中和试验和血清被动免疫保护试验进行鉴定,证明该分离毒株为Ⅰ型DHV。     

用血细胞吸附抑制试验快速鉴定鸡毒霉形体

鸡源霉形体的鉴定,通常用已知的标准阳性血清与分离物进行生长抑制试验(GI)、代谢抑制试验(MI)或用表面免疫荧光法(epi-IF)进行,前两种方法费时,往往需要1～2周才能得出结果;后一种方法需要荧光显微镜,不易普及应用。笔者根据鸡毒霉形体菌落有很强的吸附鸡红细胞的特点,试用已知的阳性血清进行菌落血细胞吸附抑制试验(HAI)来鉴定鸡毒霉形体。结果表明,这种方法与GI、MI、epi-IF一样具有很强的特异性,而且方法简单快速,对琼脂培养基表面的菌落2小时内可得出结果。(一)材料与方法1.抗血清:鸡毒霉形体抗血清、滑液霉形体     

用醛化红细胞分离抗禽流感病毒独特型多克隆抗体

用纯化的鸡抗禽流感病毒(AIV)抗体免疫家兔,制备抗独特型多克隆抗体;用戊二醛醛化的红细胞固定非特异性鸡抗体,再吸附兔抗鸡抗体,获得了纯的抗独特型抗体。经鉴定,该抗体既有弱的血凝性又有弱的血凝抑制性,并能与原病毒竞争性地和鸡抗AIV抗体结合。     

禽腺病毒T型琼脂扩散抗原的研制及应用

研制了禽腺病毒Ⅰ型琼脂扩散抗原,检测了该抗原的效价和特异性,并用该抗原对人工感染鸡沉淀抗体的变化以及现地血清样本进行了检测.结果显示,该抗原不与其他主要禽类病原体阳性血清反应,可与1:8稀释的禽腺病毒工型阳性血清反应.对3月龄SPF鸡进行人工感染后,第7 d可检测到沉淀抗体,血清中的沉淀抗体可持续3个月以上.抗原在-20℃条件下可保存2年.经对现地38个鸡场进行检测,其中阳性场14个,阳性率为36.84%,表明我国的禽腺病毒感染率很高.结果证实,研制的禽腺病毒Ⅰ型琼脂扩散抗原敏感、特异,可用于禽腺病毒感染的血清学检测.     

鸡传染性腔上囊病病毒双夹心ELISA检测方法的建立

通过制备兔抗鸡传染性腔上囊病病毒(IBDV)、小鼠抗IBDV和绵羊抗兔免疫血清,并纯化绵羊抗兔辣根过氧化物酶标记抗体,采用方阵滴定法测定其最佳使用浓度,建立了IBDV双夹心ELISA检测方法.结果显示,包被抗体的最适稀释度为1160,兔抗IBDV的最佳稀释度为1200,酶标记抗体的最佳稀释度为1400.特异性和重复性试验结果表明,该方法特异性强,重复性好,与鸡新城疫、鸡传染性支气管炎和鸡减蛋综合征病毒抗原均不发生交叉反应.对人工感染病例的检测结果表明.建立的双夹心ELISA方法可用于临床快速诊断IBDV.     

从肿大的鸡腺胃中分离出冠状病毒

山西省某鸡场的鸡群发生一种以腺胃肿大为病变特征的传染病,从送检的鸡腺胃病料中分离到1株病毒,命名为S96,经电镜观察、直接血凝试验、理化特性鉴定等试验表明,S96符合冠状病毒的特征.ELISA检测结果表明,S96能与鸡传染性支气管炎病毒(IBV)单克隆抗体及多抗血清发生反应,腺胃组织切片在鼠抗S96血清、鼠抗IBV M41株血清及IBV单克隆抗体介导的免疫组化染色中表现阳性反应,阳性抗原主要存在于腺胃粘膜上皮细胞,上述结果提示S96在血清学上与IBV密切相关.     

猪氨肽酶N多抗血清的制备及活性分析

为进一步研究猪氨肽酶N(pAPN)介导TGEV与靶细胞相互作用的机制,将编码猪氨肽酶N成熟肽基因(105～2889bp)克隆至原核表达载体pET-30a,将重组质粒pET-30a-pAPN转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导后进行SDS-PAGE分析,利用蛋白切胶纯化技术对目的蛋白进行纯化,制备其多抗血清,并通过琼扩试验、Western-blot分析、病毒抑制试验及体外瞬时转染试验分析该多抗血清的生物活性。结果,获得了大小为112ku的目的蛋白,多抗血清效价为1∶32,该血清在低浓度时仍具有抑制病毒的活性。结果证实,制备的多抗血清具有较高的抗体效价、较强的特异性及良好的生物活性。