猪肺炎霉形体热休克蛋白Hsp70单克隆抗体的制备及鉴定

以肺炎霉体体(Mhp)Yin-1株为模板,利用所合成的引物扩增了伴侣蛋白DnaK(热休克蛋白Hsp70)C末端基因,将得到的目的片段分别克隆至表达载体pET-28a和pGEX-6P-1中,原核表达获得了重组蛋白6P-1-DnakC和28a-DnakC,经Western-blot分析,均能被Mhp抗血清识别.以28a-DnakC作为包被抗原,建立了间接ELISA检测方法,以6P-1-DnakC为免疫抗原,免疫BALB/c小鼠.筛选和鉴定了2株分泌抗DnaK的杂交瘤细胞株,命名为1AD10、2AF11.Western-blotting结果表明,这2株单抗与Mhp发生特异性反应而不与其他相关霉形体发生反应.抗体亚类鉴定结果显示,1AD10、2AF111分别为IgG2b和IgG2a亚类,且轻链均为κ链.相加ELISA试验表明,2株单抗能识别不同的抗原表位.     

抗菌新药与疫苗对猪霉形体肺炎的防治效果研究

用氟甲砜霉素等3种抗菌新药及猪霉形体肺炎疫苗对猪肺炎的临床使用方法与防治效果进行了比较.试验结果表明,氟甲砜霉素、普乐健、复方中草药及猪霉形体肺炎疫苗等均能提高试验猪的增重与饲料转化率;普乐健、复方中草药还能显著减轻病猪的症状与病理变化,其防治效果明显优于其他试验组药物.     

绵羊肺炎霉形体单克隆抗体的研制及初步应用

用绵羊肺炎霉形体（ＭＯ）抗原免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠，融合其脾细胞和ＳＰ２／Ｏ骨髓瘤细胞，筛选出６株分泌抗ＭＯ的单克隆抗体（ＭｃＡｂ）杂交瘤细胞系。用间接ＥＬＩＳＡ法对３株ＭｃＡｂ做特异性分析，该ＭｃＡｂ只特异地与ＭＯ抗原发生反应，而不与猪肺炎霉形体、山羊无乳症霉形体抗原发生反应。用检测ＭＯ抗体的间接ＥＬＩＳＡ与ＩＨＡ比较检测绵羊血清中抗ＭＯ抗体，前者的阳性检出率较后者高７．１４个百分点     

猪肺炎霉形体168弱毒株的回归试验

将猪肺炎霉形体168无细胞培养弱毒株F340经健康小梅山猪连续传5代,每代观察11-16 d,临床无气喘和咳嗽症状,剖检无胰样小叶性肺炎病变,表明该菌株的稳定性和安全性良好;同时采集各传代猪的肺组织,用病肺块组织接种法分离培养猪肺炎霉形体,经72 h培养,其培养液呈微混浊,无沉淀,pH降至6.6,镜检见类圆球形菌体.     

猪肺炎霉形体膜制备方法对膜活性影响的研究

以猪肺炎霉形体为材料 ,分别采用反复冻融、低渗裂解、超声破碎等方法进行破膜试验。从膜蛋白收获率、标志酶活性、膜毒性等方面加以分析 ,以探索获取膜制剂的最佳条件。结果表明 ,采用低渗冻融超声相结合的膜制备方法使膜蛋白的收获率达 3 0 %左右 ;ATPase活力及膜毒性良好     

猪肺炎霉形体膜蛋白抗体间接ELISA检测方法的建立

通过提取猪肺炎霉形体ATCC25095株膜蛋白,并用免疫亲和层析柱对膜蛋白进行纯化,经SDS-PAGE分析得到了分子质量分别为66、50、46、42、32和24 ku的6种膜蛋白。以纯化的膜蛋白为包被抗原,建立了检测猪肺炎霉形体抗体的间接ELISA检测方法。结果显示,纯化的抗原具有更好的重复性和敏感性,对临床检测样品的检出率高于IDX ELISA试剂盒。     

河北省部分地区羊肺炎霉形体的分离和鉴定

自保定、廊坊、邢台、邯郸等市的 6个有呼吸道病的羊场采集病料 2 4份 ,分离纯化获得13株分离物 ,经理化特性和血清学鉴定 ,证实分离物与绵羊肺炎霉形体 (Mycoplas maovipneumoniae ,MO)标准株Y98为同一血清型。人工复制试验结果表明 ,分离物具有致病性     

羊肺炎霉形体病调查

1992年在西北某地区的3个县10个牧场,对2160余只羊进行了羊肺炎霉形体病的调查,血清样品673份,检出阳性101份,阳性率为16％;并从发病地区羊群采集的2例山羊和1份鼻拭子病料中分离到3株霉形体。经系统鉴定和人工感染试验确诊为羊肺炎霉形体(M.ovipneumonia)。     

猪肺炎霉形体p52基因重组腺病毒的构建及其免疫特性

为构建携带猪肺炎霉形体(Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp)p52基因的重组腺病毒,从Mhp J株扩增p52基因,克隆到穿梭载体pShuttle-CMV中,经Pine Ⅰ线性化后,电转化入BJ5183菌内,与其含有的骨架载体pAdEasy-1同源重组,再与脂质体混合转染AD-293细胞,包装成完整的腺病毒,经RT-PCR、间接免疫荧光鉴定后扩增,收集病毒液,免疫BALB/c小鼠,并分析了体液免疫、黏膜免疫和细胞免疫效果.结果表明,重组质粒pShuttle-CMV-P52插入片段为1 202 bp;同源重组成功;重组腺病毒可以正确表达目的蛋白,效价达1×106TCID50/mL.重组病毒经肌肉注射和滴鼻均可诱导小鼠产生血清和肺匀浆液特异性IgG、SIgA,但不能诱导特异的淋巴细胞增殖.证实,成功构建了表达p52基因的重组腺病毒,该病毒可诱发小鼠产生特异的体液免疫和黏膜免疫,但不产生细胞免疫应答.     

聚合酶链反应检测绵羊肺炎霉形体的研究

参照基因库中已发表的绵羊肺炎霉形体Y98株的 1 6SrDNA序列 ,设计合成了 1对引物 ,建立了聚合酶链反应 (PCR)检测绵羊肺炎霉形体的方法。结果显示 ,所建立的PCR能特异扩增绵羊肺炎霉形体的DNA ,而对照的菌株均为阴性 ;其敏感性可达 1pg。经对绵羊肺炎霉形体分离株HD 1的扩增产物进行测序 ,并与绵羊肺炎霉形体标准株Y98的 1 6SrDNA序列进行比较 ,发现有 6个碱基的差异     

猪肺炎支原体P97 C末端蛋白单克隆抗体的制备及其抗原表位分析

以大肠杆菌表达的pET-30a-P97C重组蛋白为免疫原免疫BALB/c小鼠,制备针对猪肺炎支原体P97C末端蛋白的单克隆抗体,并将其与截短表达的P97C末端蛋白进行免疫印迹分析,初步鉴定了P97C末端蛋白的抗原表位。进一步采用肽探针扫描技术确定最小抗原决定区域,并通过生长抑制试验及抗黏附特性试验对抗原表位进行了分析。结果显示,获得2株能稳定分泌特异性抗体的杂交瘤细胞株A3C9和B4D5,并成功鉴定出P97C末端蛋白的2个独立线性表位F905PMAFSY911和G991TPNQGKKAE1000。2株单抗对猪肺炎支原体的生长均有一定的抑制作用,但对其黏附特性没有显著抑制作用。     

环丙沙星在霉形体性肺炎猪体内的组织药代动力学研究

将21头健康杜洛克×长白×大白杂交猪复制成霉形体性肺炎模型后,分别肌肉注射环丙沙星(5.0 mg/kg)进行组织及血浆药代动力学研究。结果显示,环丙沙星在感染猪肺中的浓度-时间数据适合一级吸收二室开放模型,外观正常肺与外观实变肺的主要参数分别是:t1/2Ka为0.19和0.46 h,t1/2α为2.68和2.52 h,t1/2β为8.12和6.87 h,tmax为1.10和1.47 h,Cmax为6.00和4.46μg/g,AUC为38.65和33.33mg/(L.h),Tcp(ther)为57.10和50.59 h。气管、支气管组织中的药物浓度-时间数据适合一级吸收一室开放模型,主要参数分别是:t1/2Ka为0.56和0.38 h,t1/2ke为5.68和5.67 h,tmax为2.08和1.60 h,Cmax为3.73和2.62μg/g,AUC为39.44和26.10 mg/(L.h),Tcp(ther)为50.60和47.16 h。表明,环丙沙星对霉形体性肺炎猪呼吸道组织具有良好的穿透性,组织药物浓度明显高于血浆药物浓度,且消除缓慢。     

阿维菌素单克隆抗体的制备与鉴定

将与牛血清白蛋白(BSA)偶联的阿维菌素人工合成抗原AVM-BSA免疫8周龄雌性BALB/c小鼠,利用杂交瘤技术获得了2株分泌抗阿维菌素特异性抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为2F2和2H10。生物学特性鉴定的结果表明,2株杂交瘤细胞株诱生腹水的效价为1∶6 400,分泌的抗体亚型均为IgM;间接竞争酶联免疫吸附试验结果表明,抗体的50%抑制质量浓度(IC50)为101 ng/mL,2株单克隆抗体与伊维菌素、多拉菌素、红霉素和白霉素均无交叉反应,证实单克隆抗体2H10具有很强的特异性,可用于阿维菌素药物残留免疫分析方法的建立。     

鸭肠炎病毒单克隆抗体的制备

采用差速离心和蔗糖密度梯度离心法提纯鸭肠炎病毒 (DEV)鸭胚成纤维细胞适应毒 ,免疫BALB/c小鼠 ,取脾细胞与SP2 / 0骨髓瘤细胞融合 ,经间接ELISA筛选 ,有限稀释法 3次克隆 ,获得了 2株稳定分泌DEV单克隆抗体的杂交瘤细胞株 1B6和 2G8。经鉴定 ,2株单克隆抗体分别为IgM和IgG1 亚类 ,腹水ELISA效价均达到 1∶1 0 7以上。以 2G8单抗腹水为材料 ,采用间接免疫荧光抗体技术对DEV标准毒感染的鸭胚成纤维细胞进行检测 ,结果表明 ,用该抗体可特异性检出接毒后 6h感染细胞中的DEV ,且感染后 4 8h免疫荧光强度最高 ,该单抗与细胞成分和鸭肝炎病毒无交叉反应。将杂交瘤细胞冻存 3和 6个月 ,复苏后仍能稳定分泌单克隆抗体     

抗禽脑脊髓炎病毒单克隆抗体的制备及鉴定

利用提纯的禽脑脊髓炎病毒(AEV)VR株CEF适应毒制备抗原,免疫BALB/c小鼠,应用杂交瘤技术以间接ELISA筛选获得1株分泌抗AEV(VR)单克隆抗体的杂交瘤细胞.对制备的细胞上清及腹水进行单克隆抗体特性鉴定,经染色体计数、免疫球蛋白类及亚类测定、特异性试验、稳定性试验、SDS-PAGE电泳,表明该杂交瘤细胞染色体数目介于90-110条,该单克隆抗体亚类为IgG2a,分子质量为142 ku,ELISA测定细胞上清效价为11×104,腹水效价为11×106,与其它病原无交叉反应,抗体分泌稳定.     

丝状霉形体山羊亚种血清抗体间接ELISA检测方法的建立

利用丝状霉形体山羊亚种标准株PG3制备抗原,经纯化后作为包被抗原建立了间接ELISA方法,用于检测丝状霉形体山羊亚种血清抗体。经方阵滴定确定最佳抗原包被浓度为1.09μg/mL,血清样品最佳稀释度为1∶64,兔抗羊IgG辣根过氧化物酶结合物的最佳稀释度为1∶40 000,抗原抗体最佳结合时间为1 h。判定标准为样品D490 nm值与标准阴性血清D490 nm值之比(P/N)≥3为阳性,≤2.5为阴性,介于二者之间的为可疑。重复性和稳定性试验证明,建立的间接ELISA的稳定性和重复性良好,与间接血凝试验相比,其敏感性较高。     

抗新城疫单克隆抗体的制备与特异性分析

以蔗糖反透析浓缩及ＳｅｐｈａｄｅｘＧ 200层析纯化Ｆ48Ｅ8和ＬａＳｏｔａ新城疫病毒(ＮＤＶ),取纯化的病毒液免疫接种ＢＡＬＢ ｃ小鼠,将小鼠脾细胞与ＮＳ 1骨髓瘤细胞融合,经次黄嘌呤、氨基喋呤和胸苷(ＨＡＴ)培养基选择,间接ＥＬＩＳＡ检测,有限稀释法克隆,筛选出了3株杂交瘤细胞,依次命名为1Ｄ4、1Ｄ5、16Ｇ12。3株杂交瘤细胞的染色体数为80～100,并能稳定传代,其产生的单克隆抗体重链属于ＩｇＧ1,轻链属于κ链;ＥＬＩＳＡ检测时仅与ＮＤＶ发生特异性反应,而与其他常见禽类病毒抗原不出现交叉反应,应用这些单克隆抗体对ＮＤＶ分离株进行了分群研究。