河北省鸡源大肠杆菌CTX-M型ESBLs基因的流行特征研究

旨在从分子水平阐明河北地区鸡源大肠杆菌CTX-M型超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)基因流行特征,探究大肠杆菌耐药性传播途径,为制定科学的防控措施奠定基础。从河北地区病鸡肝中分离大肠杆菌,通过选择性培养基培养特性观察、细菌生化试验、16S rRNA方法鉴定分离菌株;采用K-B法测定细菌的药物敏感性;通过PCR技术检测第3代头孢菌素耐药菌株中CTX-M基因(bla_(CTX-M-1)、bla_(CTX-M-2)、bla_(CTX-M-8)和blaCTX-M-9)和整合子整合酶基因(Int1、Int2和Int3)的流行情况,比对基因序列,分析携带CTX-M基因亚型的情况。参照McMLST网站数据库提供的7对管家基因序列进行MLST分型,探索不同ST型菌株中CTX-M基因亚型的流行情况。经分离鉴定试验,共检测出56株大肠杆菌,其中41株(73.21%)大肠杆菌对第3代头孢菌素类抗生素耐药,且对碳青霉烯类抗生素呈高度敏感。第3代头孢菌素耐药菌株中携带blaCTX-M-9(48.78%)、blaCTX-M-1(43.90%)和blaCTX-M-8(24.39%),未检出blaCTX-M-2。从CTX-M-9群共检出CTX-M-65(n=10)、CTX-M-14 (n=8)和CTX-M-27 (n=2)这3种基因亚型;CTX-M-55 (n=15)型在CTX-M-1群中的检出率最高,其次为CTX-M-123(n=2)和CTX-M-64(n=1);36株携带blaCTX-M大肠杆菌同时携带Ⅰ型整合子的Int1基因。MLST分型结果表明,36株携带CTX-M基因的大肠杆菌共有16种ST型,优势流行型为ST85 (n=6)和ST243 (n=6)。由此可见,河北地区鸡源大肠杆菌对第3代头孢菌素的耐药率较高,对极少数的抗生素呈高度敏感,且呈现多重耐药型,第3代头孢菌素耐药菌株普遍携带CTX-M型耐药基因,以CTX-M-55、CTX-M-65、CTX-M-14型为主。本研究结果表明,河北地区鸡源大肠杆菌普遍具有耐药性,有丰富的耐药谱型,同时多种耐药基因可存在于同一株细菌中,不同耐药基因的ST型归属特性存在差异。     

猪场环境中大肠杆菌的耐药性检测及其耐药机理

为探讨猪场环境中大肠杆菌的耐药性及其耐药机理,随机选取从规模养猪场环境中分离的31株大肠杆菌,采用药敏纸片法检测其耐药性、PCR法检测其qnrA和aac(6’)-Ib基因存在状况,然后采用高温-SDS法对其中1株分离菌进行耐药质粒消除试验。结果显示,所分离的31株大肠杆菌对青霉素、四环素、洁霉素、红霉素、罗红霉素等抗生素呈现不同程度的耐药性;在所有试验菌株中未检出qnrA基因,而可检出aac(6’)-Ib基因的有8株;通过对含aac(6’)-Ib基因质粒的消除,分离菌株可获得对氨基糖苷类和喹诺酮类抗生素的敏感性。表明猪场环境中的大肠杆菌对临床常用药物产生了广泛的耐药性,而含aac(6’)-Ib基因质粒可介导环境中的大肠杆菌对氨基糖苷类和喹诺酮类抗生素耐药。     

安徽鸡源大肠杆菌整合子-基因盒分布及同源性分析

参照CLSI推荐的微量肉汤稀释法检测了15种抗菌药物对91株鸡源大肠杆菌的最小抑菌浓度(MIC),采用PCR方法检测其整合子-基因盒的分布情况,并用脉冲场凝胶电泳(PFGE)分析大肠杆菌的同源性。结果显示,91株大肠杆菌对15种抗菌药物的耐药率为3.3%~98.9%,且全部为四重耐药以上,多重耐药率为100%。91株大肠杆菌全部携带Ⅰ型整合子,其中70株带有编码耐氨基糖苷类和磺胺类药物的基因盒,分别是dfr A1+tnp A IS26+aad A1(45/70),dfr A12+aad A2(16/70)和dfr A1+aad A1(9/70),未检出Ⅱ型整合子。PFGE分型图谱显示,91株大肠杆菌共产生63个谱型,菌株之间的相似系数为30%~100%,31种谱型的同源性高达90%以上。其中41种带型只包含1株菌,其余22种带型包含菌株数为2~4株。结果表明,安徽合肥地区鸡源大肠杆菌对抗菌药物的耐药性较高,Ⅰ型整合子分布广泛,菌株基因分布呈多态性但同源性较高。     

闽西地区猪源大肠杆菌耐药基因bla_(CTX-M-9G)的流行性分析

为了解闽西地区猪源大肠杆菌耐药基因blaCTX-M-9G流行性以及对β-内酰胺类药物的耐药情况,以期为本地区抗菌药的合理应用提供依据。从闽西地区规模化猪场采集腹泻仔猪肛门拭子分离大肠杆菌,对分离株进行β-内酰胺类药物敏感性测定及耐药基因检测。结果显示,共分离大肠杆菌213株;分离株对氨苄西林、阿莫西林/克拉维酸、头孢噻呋和头孢噻肟表现出较高的耐药率,分别为46.9%、44.1%、28.6%和23.9%;经耐药基因检测,bla_(CTX-M-9G)基因检出率为17.4%(37/213),在bla_(CTX-M-9G)阳性菌中还检测出qnrA(5.4%)、qnrB(37.8%)、qnrS(73.0%)、oqxA(70.3%)、oqxB(75.7%)及qepA(18.9%)等PMQR耐药基因,其中83.8%含有三种以上耐药基因,以携带blaCTX-M-9G+qnr S+oqx A+oqx B基因型最为流行,检出率为32.4%。闽西地区猪源大肠杆菌对β-内酰胺类药物表现出一定的耐药性,bla_(CTX-M-9G)耐药基因携带率较高,并且耐药基因bla_(CTX-M-9G)阳性菌中PMQR基因的携带率较高。     

广东地区副猪嗜血杆菌的耐药性调查及遗传相关性分析

对广东地区分离的副猪嗜血杆菌进行耐药性调查以及遗传相关性分析,以获得临床分离株的耐药性特征和耐药菌的传播扩散机制。采用微量肉汤稀释法测定了95株副猪嗜血杆菌对临床常用的18种抗菌药物的敏感性。用PC R方法检测6类抗生素耐药基因的携带情况,并运用脉冲场凝胶电泳(PFG E)对携带相关耐药基因的菌株进行遗传相关性分析。结果表明,所有测试菌株对头孢噻呋和头孢噻肟均表现出较好的敏感性;对左氧氟沙星、红霉素、氟苯尼考和青霉素敏感性下降,耐药率分别为3.2%、5.3%、7.4%和13.7%。同时也检测到较高的耐药水平,对甲氧苄啶+磺胺甲噁唑、恩诺沙星和头孢克洛的耐药率分别为83.2%、46.3%和36.8%;对四环素(23.2%)、氨苄西林(22.1%)、庆大霉素(21.1%)和环丙沙星(20.0%)表现为中等水平的耐药。在95株菌中,26株菌(27.4%)携带有耐药基因,共检出5种耐药基因,检出率依次为tet(B)(21.1%)、aph(3′)-Ⅰ(9.5%)、sul2(9.5%)、aad A 1(8.4%)和blaROB-1(6.3%),其中15株菌同时携带有2个以上的耐药基因。在这些耐药基因阳性菌中,PFGE分析结果显示出遗传背景的多样性,同时,也观察到小范围的克隆。     

食品动物源沙门菌fosA_3基因的流行及传播特征

为研究质粒介导的磷霉素耐药基因fosA_3在食品动物源沙门菌中的流行状况及传播特征,采用PCR方法对本实验室保存的288株动物源沙门菌进行磷霉素耐药基因fosA_3、fosA和fosC2的检测,用琼脂稀释法测定阳性菌株对17种抗生素的敏感性,PCR检测其他相关耐药基因,玻片凝集法确定其血清型。采用脉冲场凝胶电泳(PFG E)和多位点序列分型(M LST)分析菌株间的亲缘关系。采用接合转移/转化、复制子分型、S1-PFGE和Southern杂交等对fosA_3的水平传播和质粒特征进行分析。结果显示,共筛选得到6株(2.1%)fosA_3阳性沙门菌,没有检测到fosA和fosC2。6株fosA_3阳性菌均表现出多重耐药,且同时携带blaCTX-M-9G(均为blaCTX-M-14)基因和floR基因,血清型检测均为印第安纳型。6株菌均为MLST(ST)17型,PFGE结果显示其图谱相似。质粒分析结果显示,fosA_3能通过IncN或IncA/C型质粒与blaCTX-M基因发生共同转移。本研究首次从国内不同地区采集的鸡粪便拭子样本中分离得到的沙门菌中检测到fosA_3基因,菌株的克隆传播和fosA_3与blaCTX-M随质粒的水平传播都加速了耐药性的散播,对公共卫生构成潜在威胁。     

牛乳源金黄色葡萄球菌生物被膜形成与耐药性的研究

为探讨金黄色葡萄球菌生物被膜形成与耐药性之间的关系,本研究对分离于宁夏地区牛乳腺炎的50株金黄色葡萄球菌进行药敏试验,采用刚果红琼脂法检测金黄色葡萄球菌的生物被膜形成能力,同时用PCR方法对菌株的生物被膜相关基因进行检测。结果显示,金黄色葡萄球菌耐药情况严重,普遍存在多重耐药现象;受试菌株有36株菌(72%)为生物被膜阳性菌株,有14株菌(28%)为生物被膜阴性菌株;受试菌株生物被膜相关基因的检出率分别为icaA(96%)、sarA(76%)、fnbA(100%)、fnbB(100%);生物被膜阳性菌株对大多数抗菌药物的耐药率高于生物被膜阴性菌株,但二者只对克林霉素的耐药率具有统计学意义(P0.05)。本研究结果表明,金黄色葡萄球菌生物被膜的形成机制复杂,生物被膜的形成在金黄色葡萄球菌的耐药性方面起到了一定的促进作用。     

关中奶山羊铜绿假单胞菌的分离鉴定及其耐药性与毒力基因的检测

为对关中奶山羊乳房炎的防控提供参考,本研究采集陕西省某养殖场的奶山羊肛拭子和环境拭子共70份,并对其进行了乳房炎致病性铜绿假单胞菌的分离鉴定、耐药性检测、耐药基因鉴定和毒力基因鉴定。最终自采集的样品中共分离到26株铜绿假单胞菌,毒力基因检测显示分离的菌株携带有包括lasB、exoU和exoY在内的14种毒力基因;耐药性检测显示,分离的铜绿假单胞菌对壮观霉素和磺胺类药物高度耐药,对头孢他啶、多西环素、庆大霉素和氨苄西林等药物也具有一定程度耐药;耐药基因鉴定显示,分离的铜绿假单胞菌携带有包括氨基糖苷类药物耐药基因、超广谱β-内酰胺类药物耐药基因、碳青霉烯酶基因和氟喹诺酮类药物耐药基因在内的13种耐药基因。结果表明,铜绿假单胞菌在关中奶山羊肠道和圈舍环境中广泛存在,且相应菌株具备较强的耐药性,在养殖生产中应加强对环境的消杀工作以降低乳房炎的发病风险。     

广东省猪源葡萄球菌耐药性分析及多重耐药基因cfr的流行现状

为了解2013-2017年间广东省猪源葡萄球菌的耐药情况及多重耐药基因cfr的流行现状,采集生猪养殖场和交易市场猪鼻腔拭子分离葡萄球菌,采用琼脂稀释法测定分离菌株对14种抗菌药物的敏感性,并用PCR检测mecA和cfr基因的携带情况。结果显示,在采集的4099份样品中分离到葡萄球菌1485株,其中金黄色葡萄球菌173株。猪源葡萄球菌对红霉素、四环素、泰妙菌素、克林霉素、沃尼妙林和氟苯尼考耐药严重,耐药率分别为91.0%、90.2%、87.7%、84.6%、84.6%及82.0%,对利福平和利奈唑胺相对敏感,未发现万古霉素耐药菌株;庆大霉素、四环素、红霉素和环丙沙星的耐药率呈现逐年上升的趋势。在1485株葡萄球菌中,mecA和cfr的检出率分别为39.9%和12.3%。cfr阳性菌株常携带多种耐药基因,cfr基因的遗传背景也呈现多样化。结果表明,广东省猪源葡萄球菌的耐药情况严重,cfr的检出率高,应加强养殖业中抗菌药物的规范和合理使用,减缓耐药性的产生和传播。     

多重耐药基因cfr在食品动物源大肠杆菌中流行特点的调查

为调查多重耐药基因cfr在我国多个地区食品动物源大肠杆菌中的流行情况及耐药现状,对2014年从广东、山东、江苏等11个省份分离得到的4 702株大肠杆菌,采用PCR和测序方法验证cfr阳性菌株,并通过临床常用药物敏感性测定、脉冲场凝胶电泳分型(PFG E)和Southern杂交定位等方法,确定分离株的耐药表型和cfr基因在大肠杆菌中的传播方式。结果显示,共检出cfr阳性菌株9株,检出率为0.19%。药敏试验结果显示,9株cfr阳性菌株对氯霉素、氟苯尼考、氨苄西林、四环素、多西环素均耐药,对亚胺培南均表现为敏感,对庆大霉素、新霉素耐药率在60%以上,对其他药物耐药率介于10%~50%之间。PFGE结果显示,有2株来自同一养殖场的菌株谱型相似,表明存在克隆传播。Southern杂交结果显示,cfr基因定位于大小为70~400 kb之间的质粒上。上述调查结果表明,多重耐药基因cfr在食品动物源源大肠杆菌中的检出率较低,但在广东地区较为流行。     

iss基因与鸡大肠杆菌致病力的关系

为探讨iss基因的存在及其核苷酸序列的差异与鸡大肠杆菌致病力的关系,分别采用普通PCR及套式PCR方法检测iss基因在21株鸡大肠杆菌菌株中的分布,并进行序列测定,分析菌株携带iss基因的情况及不同毒力的菌株间iss基因序列的差异。结果显示,经套式PCR检测21株鸡大肠杆菌均携带iss基因,而普通PCR检测显示仅有13株携带iss基因;16株菌株iss基因与国外禽大肠杆菌iss基因参考序列同源性为100%;其余5株中,E1与参考序列同源性为93.5%,E33、O78与参考序列同源性为99.4%,E4、E21与参考序列同源性为99.7%。推测,iss基因可能在不同来源、不同毒力、不同血清型的鸡大肠杆菌中都普遍存在,仅是拷贝数高低不同,而不是目前普遍认为的"有或无"的关系,并且iss基因序列是高度保守的。iss基因与鸡大肠杆菌致病力的相关性可能与它所定位的质粒拷贝数有关,与iss基因的序列差异无关。     

中草药消除大肠埃希氏菌耐药性及耐药质粒的研究

在系统鉴定和药敏试验的基础上,对9株大肠埃希氏菌多重耐药菌株进行耐药基因定位,结果表明有4株菌株的氨苄青霉素耐药基因位于质粒上.通过对中草药煎煮、水蒸气蒸馏等方法提取其有效成分,对耐药大肠埃希氏菌进行耐药性消除试验,结果发现大蒜油等对大肠埃希氏菌氨苄青霉素耐药性有消除作用;鱼腥草、紫草等对大肠埃希氏菌庆大霉素耐药性及耐药质粒有消除作用,消除率分别为2.98%和4.20%.     

禽沙门菌分离株耐药性及Ⅰ类整合子的检测

为了分析禽沙门菌临床分禽株出现多重耐药的原因,采用Kirby-Bauer纸片扩散法对61株禽沙门菌分离株进行药敏试验筛选,通过PCR方法检测59株多重耐药沙门菌的Ⅰ类整合子的5’-CS端、3’-CS端和可变区基因并进行测序分析。药敏试验结果显示,所分离的禽沙门菌对青霉素、苯唑西林、利福平和万古霉素的耐药率均达到了100%,但对美福仙、诺氟沙星、阿米卡星、卡那霉素、氯霉素、氟苯尼考相对敏感;96.72%沙门菌能耐受6种及其以上抗菌药物,说明沙门菌的多重耐药性比例高。通过PCR及测序发现,5株禽沙门菌(8.5%)中检测到Ⅰ类整合子基因盒,包括4株雏沙门菌和1株肠炎沙门菌。序列分析结果显示,Ⅰ类整合子基因盒的核苷酸同源性达到100%;通过NCBI的BLAST分析发现,Ⅰ类整合子基因盒内含有dfr17和aad A5基因。因此,尽管禽沙门菌分离株的多重耐药性比例高,但是仅有少数菌株的耐药性与Ⅰ类整合子相关。     

56株食源性单增李斯特菌耐药性测定及耐药基因的检测

为调查新疆部分食源性单增李斯特菌的药物敏感性和相关耐药基因的携带现况,采用微量肉汤稀释法(MIC)和K-B琼脂扩散法对56株单增李斯特菌进行18种抗菌药物敏感性试验。通过PCR方法进行12种相关耐药基因检测,并对耐药基因进行测序分析。结果表明,28.6%(16/56)的菌株微量肉汤稀释法检测耐药,而K-B琼脂扩散法检测19.6%(11/56)菌株耐药。56株单增李斯特菌均对青霉素、氨苄西林、亚胺培能、庆大霉素、万古霉素、左氧氟沙星、利福平敏感,对四环素、复方新诺明、链霉素、强力霉素、卡那霉素耐药。微量肉汤稀释法检测发现,菌株对四环素、复方新诺明、链霉素耐药率较高,分别为12.5%(7/56)、10.7%(6/56)、10.7%(6/56),多重耐药菌株占7.1%(4/56)。在18株表型耐药菌株中,61.1%(11/18)的菌株携带相应的耐药基因,四环素类耐药基因以tetM为主,红霉素耐药基因为ermB,氯霉素素耐药基因为cat。而在38株非耐药表型菌株中,氨基糖苷类耐药基因aac(6')-Ib-cr和红霉素耐药基因ermB的检出率分别高达57.9%和39.5%。扩增片段核苷酸序列与参考序列同源性为95%～100%。新疆食源性单增李斯特菌出现耐药,且耐药表型与耐药基因不完全符合,应引起关注。     

耐环丙沙星患病动物源沙门菌的多重耐药分子特征

采用13株耐环丙沙星食品动物源沙门菌进行喹诺酮类作用靶位基因及质粒介导耐药基因的扩增测序、有机溶剂耐受试验、HeLa细胞侵袭试验,探讨其多重耐药的分子特征。结果显示,菌株均携带质粒介导的喹诺酮耐药基因,7株对环丙沙星敏感性降低或低水平耐药(最小抑菌浓度0.125～4μg/mL),靶位基因无突变或gyrA单位点突变及外排泵活性增强;5株对环丙沙星高水平耐药(最小抑菌浓度32～128μg/mL),均在gyrA和parC发生双位点突变及外排泵活性增强,其中4株携带β内酰胺酶blaCTX-M基因。对环丙沙星高水平耐药的沙门菌的侵袭力显著高于敏感菌株。表明患病食品动物源沙门菌中,无论外排能力增强与否,gyrA单位点突变或质粒介导的喹诺酮耐药基因阳性,仅导致沙门菌对环丙沙星的低水平耐药;而外排泵机制联同染色体靶位基因突变可导致菌株对环丙沙星的高水平耐药,往往同时携带blaCTX-M基因;临床分离沙门菌随着对环丙沙星耐药程度的增加侵袭力增强。     

猕猴肠侵袭型大肠杆菌的分离鉴定及其毒力因子基因的检测

2010年5月从四川省某猕猴养殖场急性腹泻猕猴肠道内分离出4株致病性大肠杆菌,并对其进行了16SrDNA扩增、生化反应、血清型鉴定、药敏试验以及毒力因子基因的分子生物学检测。结果显示,该菌株血清型为O28;药敏试验证实该菌对多种抗生素具有抗性,并且呈现多重耐药性;攻毒试验证实该菌能够导致小白鼠大量死亡;多重PCR成功检测出侵袭性大肠杆菌的Einv毒力基因。确定该病原菌为肠侵袭型大肠杆菌,而且毒力很强。     

牛源非脱羧勒克菌的分离鉴定及其耐药基因的检测

为诊断导致乳牛死亡的病原菌,于病死牛腹腔积液中分离得到1株具有致病性的优势菌株。经16S r DNA检测鉴定为非脱羧勒克菌。动物回归试验中,病牛肺、心外膜、喉头病理变化明显。以15种抗生素进行药敏试验,该非脱羧勒克菌对大环内酯和氨基糖苷类药物均呈显著耐药。耐药基因检测中大环内酯类耐药基因与氨基糖苷耐药基因均呈显性表达。     

单增李斯特菌四环素耐药基因tetM膜接合转移的研究

为探讨猪链球菌能否成为单增李斯特菌四环素耐药基因tetM的水平传播宿主,以携带该基因的单增李斯特菌四环素耐药菌株为供体菌株,猪链球菌的红霉素耐药菌株为受体菌株进行滤膜接合试验。同时对供体菌株进行了转移相关基因int-Tn的PCR检测。结果显示,获得19个接合子,接合转移率为4×10-7。接合子均对四环素耐药,且接合子中均PCR扩增到tetM基因,该基因克隆测序结果与供体菌中tetM基因序列完全一致。同时,从供体菌株中扩增到整合酶编码基因int-Tn。这说明猪链球菌可以成为单增李斯特菌四环素耐药基因tetM的水平传播宿主,并且该基因的水平转移与整合子有密切关系。     

山羊源志贺菌的分离鉴定及其部分生物学特性的研究

对采集自四川部分地区的226份羔羊粪便样本进行志贺菌的分离鉴定,同时对分离菌株进行血清型鉴定,并用PCR检测其携带sat、sen、set A、pic、sig A、ics P、ial、ics A、iut A、ipa H共10个毒力基因的情况;采用灌胃法检测携带毒力基因最多的4株优势血清型菌株培养物对BALB/c小鼠的致病力。经细菌分离鉴定,从226份样本中共分离到54株志贺菌;血清型鉴定结果显示,4株的血清型为福氏志贺菌1a型,11株的血清型为福氏志贺菌1b型,28株的血清型为福氏志贺菌2b型,11株的血清型为福氏志贺菌3b型。54株志贺菌均携带sat、sen、ipa H基因,而set A、pic、sig A、ics P、ial、ics A、iut A基因的阳性携带率分别为73.6%、65.2%、77.8%、82.0%、79.1%、79.1%,每个菌株携带4~10种毒力基因。携带10个毒力基因的4株福氏志贺菌2b型优势血清型菌株均在1.7×108CFU/m L剂量下致死全部试验小鼠,其中福氏志贺菌SWUN553对BALB/c小鼠的LD50为1.04×106CFU;致死小鼠的组织病理学检查显示,心、肝、脾、肺、结肠出现明显的坏死与炎性细胞浸润等病变,提示结肠为该菌入侵的最有可能部位。本研究阐明了山羊源志贺菌的部分生物学特性,为山羊志贺菌病的防控提供了科学依据。     

沙门菌CRISPR与耐药性的关系及生物信息学分析

为研究沙门菌成簇间隔短回文重复序列(CRISPR),对CRISPR进行生物信息学分析,为进一步研究CRISPR功能及其对细菌耐药的影响奠定基础。对合肥市宠物医院分离鉴定的14株沙门菌进行耐药性(24种抗菌药物)和CRISPR检测,分析CRISPR与沙门菌多重耐药的关系。对沙门菌PCR产物进行测序,通过BLAST、RN A二级结构预测、CRISPR Target等生物信息学方法对沙门菌的CRISPR进行生物信息学分析。结果显示,沙门菌均对3种及3种以上药物耐药,有8株菌检测到CRISPR 1,14株菌检测到CRISPR2;CRISPR阳性菌株均为多重耐药菌株,CRISPR序列差异性与耐药性之间没有直接相关性,CRISPR序列与血清型之间有一定相关性。8株CRISPR 1阳性沙门菌重复序列均含1条(9、13号除外)长度为29 bp的重复序列,分为4类,14株沙门菌CRISPR 2的重复序列共有18类,其RNA二级结构都能形成回文结构,但茎环大小有差异。同源性比对发现,CRISPR 1中81.6%的间隔序列与质粒的基因组序列具有同源性,18.4%与噬菌体有同源性;CRISPR 2中80%的间隔序列与质粒具有同源性,16.8%与噬菌体有同源性,3.2%与细菌有同源性。结果表明,携带CRISPR的沙门菌广泛存在,CRISPR可能与沙门菌血清型相关,明确了CRISPR结构的生物学信息。