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猪轮状病毒双抗体夹心ELISA检测方法的建立 总被引:1,自引:0,他引:1
用差速离心法纯化的猪轮状病毒(RV)分别免疫仔猪和兔,制备了猪抗RV和兔抗RV超免疫血清,并用层析方法进行了纯化,建立了检测RV的双抗体夹心ELISA方法.结果表明,该双抗体夹心ELISA的最佳反应条件为:猪抗RV IgG包被浓度为4 μg/mL,兔抗RV IgG最佳工作浓度为3.5μg/mL,样品反应时间为90 min,酶标抗体工作浓度为1:8 000,以D<,450nm≥10.161作为阳性判定标准.该ELISA的重复性变异系数小于10 %,最低检测限为1.25μg/mL,并与猪瘟病毒、猪伪狂犬病病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、猪大肠杆菌和沙门菌等病原无交叉反应,该ELISA试剂在室温和4℃条件下至少可保存4个月.用该ELISA方法和RV金标检测卡检测70份临床粪便样品,结果显示,ELISA的阳性检出率为22.9%,而金标检测卡的阳性检出率为20.0%.表明,建立的双抗体夹心ELISA方法具有特异性好、灵敏性高和重复性好等优点,可用于RV的快速检测. 相似文献
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用ABC—ELISA对弓形虫实验感染不同时期的猪血清特异性IgG进行了检测,并和常规ELISA予以比较。结果,实验感染后第1周的15份血清、第2周的13份血清和第3周的10份血清,用ABC—ELISA检出IgG的阳性率分别为46.67%、61.53%和100%,而常规ELISA检出IgG的阳性率分别为20%、61.53%和100%;ABC—ELISA检测IgG的平均滴度为1:3666,常规ELISA检测IgG的平均滴度为1:1333;前者比后者灵敏2.75倍。另外,还和猪瘟、猪丹毒、猪肺疫、猪喘气病、猪布氏杆菌病和猪旋毛虫病的阳性血清进行了对照检测,结果均无交叉反应。证明:ABC—ELISA是检测弓形虫抗体的特异而又灵敏的方法。从而为弓形虫单克隆抗体的检测提供了良好手段。 相似文献
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应用抗弓形虫单克隆体(McAb)致敏绵羊红细胞建立的反向间接血凝诊断法(RIHA)和间接血凝诊断方法(IHA),对人工感染弓形虫的兔、羊血清进行了循环抗原(CAg)和抗体(Ab)检测。结果表明,弓形虫弱毒(QHO)株和强毒(RH)株感染的兔和羊血清,用RIHA检出CAg的时间在感染后1~2天,平均4天;IHA检出Ab的时间在感染后8~16天,平均12天。用毒力不同的弓形虫感染后,CAg检出时间有一定差异:QHO株感染的兔平均5.3天,羊平均6.25天;RH株感染的兔平均2.3天,羊为1天。兔、羊CAg的阳性检出率均为100%。兔、羊血清CAg于感染后23~66天先后消失,而Ab滴度长期维持在一定高度(1:64~1:4096)。证明RIHA方法对不同毒力弓形虫感染的动物血清CAg可以达到早期诊断的目的。为弓形虫病急性期和早期现症感染提供了可靠的诊断方法和手段。 相似文献
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近年来,国内有关家畜弓形体病以及家畜弓形体抗体调查的研究报道甚多,但多涉及猪、牛和羊,有关马属动物的感染情况则未见报道。我们应用间接红细胞凝集反应(IHA)检查了四川省18个县(市)马、骡血清中的弓形体抗体,现将情况报告于下。 相似文献
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以差速离心法结合蔗糖密度梯度离心法提纯的PRRSVSC2株作为包被抗原,建立了检测猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)抗体的间接ELISA法。该法的最适抗原包被浓度为5μg/mL,最佳酶标兔抗猪抗体稀释度为1∶5000,对猪抗PRRSV的IgG检测灵敏度达到0.1μg/mL。该法只与PRRS阳性猪血清呈现阳性反应,而与PRRS阴性猪血清和猪伪狂犬病、猪乙型脑炎、猪瘟、猪细小病毒病阳性血清呈现阴性反应。应用该法检测PRRSVORF5基因疫苗免疫猪后的抗体消长规律表明,疫苗免疫猪后第7d抗体水平迅速上升,第75d达到高峰,然后缓慢下降,至第135d时仍然极显著(P<0.01)高于空载体对照和空白对照。试验结果表明,该法具有良好的特异性和敏感性,可用于PRRS流行病学调查和PRRSV基因疫苗免疫后抗体水平检测。 相似文献
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《中国兽医科学》2017,(6)
旨在利用昆虫细胞表达犬流感病毒(CIV)核蛋白(NP),并以此作为抗原建立检测CIV抗体的间接ELISA方法。从CIV感染的MDCK细胞中提取总RNA,用RT-PCR法扩增NP基因,连接到pFastBacHTA载体上,转化含Bacmid的DH10Bac感受态细胞,获得穿梭质粒NP-DH10,穿梭质粒转染sf-9昆虫细胞,获得重组病毒P1-NP。病毒传至第3代后,用Western-blot及IFA鉴定昆虫细胞表达的蛋白与兔抗犬流感病毒NP蛋白多克隆抗体及鼠抗CIV血清发生特异性反应。NP蛋白纯化后作为抗原,建立检测CIV抗体的间接ELISA方法。优化后确定蛋白最佳包被浓度为2 g/mL,血清最佳稀释度为1∶100。用建立的间接ELISA方法和血凝抑制(HI)同时检测136份血清样品,ELISA法检出129份阳性,检出率为94.85%;HI检出120份阳性,检出率为88.23%,二者符合率为93.38%,ELISA检测方法的阳性率高于血凝抑制。结果表明,利用昆虫细胞表达的NP蛋白做为抗原,建立的检测CIV抗体的间接ELISA方法特异性好,重复性高,可用于犬流感的诊断和流行病学调查。 相似文献
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为获取猪源NF-k B受体激活因子配体(RANKL)及其抗体,根据GenBank中猪源RANKL的序列设计引物,将合成的RANKL基因克隆至pMAL-C4x表达载体,转化到大肠杆菌DH5α。经PCR和双酶切鉴定后测序分析,将阳性克隆转化至大肠杆菌BL21后通过IPTG诱导表达。优化表达条件,确定是包涵体表达,蛋白大小为78.1 ku。使用纯化的RANKL为抗原免疫兔制备多克隆抗体。构建重组质粒pCMV-RANKL,表达目的蛋白并使其与多克隆血清反应。经ELISA、Western-blot和IFA鉴定,证实抗RANKL多克隆抗体有良好的抗原特异性,为后续黏膜免疫的研究奠定了基础。 相似文献
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《中国兽医科学》2017,(1)
为建立快速、准确的猪瘟病毒(CSFV)血清抗体检测方法,根据Gen Bank上猪瘟兔化弱毒全基因序列,设计1对引物,扩增E2蛋白主要抗原区基因片段;然后,将其克隆入载体p ET-28a(+),采用大肠杆菌Rosetta(DE3)表达出含E2蛋白主要抗原区的重组蛋白。以纯化的截短E2蛋白为包被抗原,优化间接ELISA反应条件,建立了检测CSFV血清抗体的间接ELISA。经过优化,确定最佳抗原包被浓度为8 g/m L,待检血清稀释倍数为1∶160,酶标二抗稀释倍数为1∶2000。该方法的阳性临界值为0.37,阴性临界值为0.32。批内变异系数在1.58%~3.33%之间,批间变异系数在2.67%~5.35%之间,说明该方法重复性良好。特异性检验中,该方法与猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型、猪流行性腹泻病毒、猪流感病毒、传染性胃肠炎病毒、乙型脑炎病毒、伪狂犬病病毒、猪细小病毒阳性血清均没有交叉反应。用该方法与IDEXX CSFV抗体检测试剂盒对1 101份临床猪血清样品进行符合性检测,结果,该方法的敏感性、特异性、符合率分别为89.07%(603/677)、77.59%(329/424)和84.65%(932/1101)。上述结果表明,该方法可用于临床CSFV血清抗体的检测,为CSFV血清抗体检测试剂盒的研制奠定了基础。 相似文献
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《中国兽医科学》2019,(1)
为建立一种快速检测牛蓝舌病病毒抗体的免疫层析方法,本研究通过胶体金标记蓝舌病病毒VP7蛋白,以兔抗牛IgG作为检测线,抗蓝舌病毒VP7蛋白单克隆抗体作为质控线,采用间接法制备了胶体金免疫层析试纸条。结果显示,该胶体金试纸条在蓝舌病病毒抗体阳性血清稀释度为1∶64时仍可检出;该试纸条与牛结核病、牛布鲁氏菌病、牛病毒性腹泻、牛巴氏杆菌病、牛地方流行性白血病的阳性血清均无交叉反应;与国外商品化试剂盒相比较,该试纸条检测结果与ELISA检测试剂盒(IDEXX)的符合率为92.7%(51/55)。结果表明,本试验初步建立的牛蓝舌病病毒抗体的胶体金免疫层析检测方法具有较好的特异性和稳定性,整个检测过程可在10 min内完成,能够快速检测样品血清,适用于现场快速检测。 相似文献
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利用丝状霉形体山羊亚种标准株PG3制备抗原,经纯化后作为包被抗原建立了间接ELISA方法,用于检测丝状霉形体山羊亚种血清抗体。经方阵滴定确定最佳抗原包被浓度为1.09μg/mL,血清样品最佳稀释度为1∶64,兔抗羊IgG辣根过氧化物酶结合物的最佳稀释度为1∶40 000,抗原抗体最佳结合时间为1 h。判定标准为样品D490 nm值与标准阴性血清D490 nm值之比(P/N)≥3为阳性,≤2.5为阴性,介于二者之间的为可疑。重复性和稳定性试验证明,建立的间接ELISA的稳定性和重复性良好,与间接血凝试验相比,其敏感性较高。 相似文献