应用PCR检测成年鸭体内鸭瘟强毒的分布

鸭瘟病毒 (DPV)强毒经人工接种和同居感染 10 0日龄鸭后 ,应用聚合酶链反应 (PCR)检测病毒在鸭体内各组织器官的动态分布。试验结果表明 ,DPV强毒经肌肉注射进入鸭体后 6h可在肝、脾、血液和粪便中检测到DPVDNA ;DPV强毒经肌肉注射到鸭体后各受检样品被检测到DPVDNA的先后顺序为 :肝、脾、血液和直肠粪便 (6h)→肺、脑和腿肌 (12h)→肾和胸肌 (2 4h) ;同居鸭于混群后 4 8h在肝、肺、血液和直肠粪便中检出DPVDNA ;DPV强毒经同居感染鸭后各受检样品检测到DPVDNA的先后顺序为 :肝、肺、血液和直肠粪便 (48h)→脾和脑 (72h)→胸肌和腿肌 (96h)→肾 (12 0h)。     

鸡体内鹅源新城疫病毒抗原的免疫组织化学检测

为研究鹅新城疫(ND)的发病机理,用3株鹅新城疫病毒强毒株分别人工感染25日龄雏鸡,以单克隆抗体介导的免疫组化(IHC)法检测攻毒鸡体内NDV抗原的分布及定位,研究了鹅新城疫病毒(NDV)对鸡的组织嗜性.结果显示,在试验鸡多种组织器官中均能检测到NDV抗原,病毒抗原主要定位于淋巴细胞、网状细胞、巨噬细胞、肝细胞及各种上皮细胞的胞浆内.结果表明,鹅NDV强毒株对鸡是一种泛嗜性病毒.     

鹅细小病毒强毒PCR检测方法的建立

参照GenBank中登录的鹅细小病毒 (GPV)B株的全基因序列 ,针对GPV的VP3保守基因设计了 1对引物 ,建立了GPV的PCR检测方法。采用该方法检测GPV能够扩增出预期大小约 4 41bp的特异性片段 ,而对鸭瘟病毒 (DPV)、鹅源致病性大肠埃希氏菌 (E .coli)O8和O1、雏鹅新型病毒性肠炎病毒 (NGVEV)呈阴性反应。该法检测GPV核酸的灵敏度可达 0 .4 7pg ;对GPV强毒皮下注射感染雏鹅各器官的检测结果表明 ,感染后 8h即可从心、肝病料中检出病毒DNA ,感染后 2 4h可从延髓、胸腺、胰腺、十二指肠、空肠、盲肠、腔上囊、心、肝、脾、肺、肾、血液、小脑、直肠、肌肉、粪便中检出GPVDNA ,感染 4 8h后可从骨髓中检出病毒DNA ,感染 312h后仍能从十二指肠、空肠、盲肠、心、肝、肾、粪便中检出病毒DNA。病毒分离阳性的可疑病料PCR检测为阳性 ,对临床送检病料的检测结果表明 ,PCR的敏感性显著高于病毒分离。     

鸭瘟病毒疫苗株在免疫SPF鸭体内的生长动力学检测

为了研究鸭瘟病毒疫苗株在免疫SPF鸭脑、胸腺、脾、肾、肝、法氏囊中的动态分布规律,根据GenBank中鸭瘟病毒的UL6基因设计引物RTF和RTR,采用SYBR GreenⅠ实时荧光定量方法,建立了特异性强、敏感性高、重复性好的标准曲线。利用建立的标准曲线对采集组织中鸭瘟病毒DNA的拷贝数进行定量。结果显示,免疫后在脑、胸腺、肝、肾、脾、法氏囊均能检测到鸭瘟病毒DNA,且免疫后第1天至第3周,肝、脑、肾中病毒DNA的拷贝数较其他受检组织中鸭瘟病毒DNA的拷贝数高。免疫后至第9周,鸭瘟病毒DNA检出不稳定。试验结束时,除肾、法氏囊外,其他组织中病毒DNA的拷贝数均下降至1×105copies以下。表明鸭瘟病毒疫苗株对SPF鸭组织具有泛嗜性,其主要分布于SPF鸭脑、肝、肾中。     

鸭源新城疫强毒株对番鸭细胞因子及Toll样受体mRNA表达的影响

为研究人工感染鸭源新城疫强毒株(Md/CH/LGD/1/2005)诱导番鸭细胞因子及Toll样受体基因的表达情况,选用80只15日龄SPF番鸭,随机分为攻毒组和对照组,每组各40只,攻毒组以滴鼻点眼的方式接种1×107.0EID50鸭源基因Ⅶ型新城疫病毒(NDV)Md/CH/LGD/1/2005,对照组接种灭菌的磷酸盐缓冲液。分别在攻毒后36 h、72 h、7 d和25 d剖杀10只番鸭,采集每只番鸭的骨髓、脾、盲肠扁桃体、哈德氏腺和法氏囊样品,通过Real-time RT-PCR方法检测组织中NDV载量、细胞因子和Toll样受体基因的表达。结果显示,除哈德氏腺外,其余各组织中病毒含量在攻毒后72 h达到最高,对照组各组织中均未检测到病毒含量。与对照组相比,经NDV感染后,IL-1β在攻毒36 h的法氏囊和攻毒7 d的哈德氏腺中表达量显著上调(P<0.05);IL-2、IL-6、IL-18和IL-20在攻毒7 d的脾内表达显著上调(P<0.05)。TLR3、TLR15和TLR21均在法氏囊内高表达(P<0.05),且表达趋势相同,对NDV感染的应答可能具有协同效应。TLR5在骨髓、脾、盲肠扁桃体和法氏囊内显著上调(P<0.05);TLR7在攻毒7 d的骨髓和法氏囊内表达上调(P<0.05)。结果表明,感染NDV后番鸭可能通过TLR相关的信号转导通路诱导宿主免疫抗性基因的表达,调控机体的抗病毒免疫应答反应。     

凡隆气单胞菌在人工感染斑点叉尾鮰体内的动态分布

为研究凡隆气单胞菌在人工感染斑点叉尾鮰体内的动态分布规律及其致病机理,用凡隆气单胞菌(8×107 CFU/mL)分别以浸泡和腹腔注射的方式感染斑点叉尾鮰,于接种后第1、2、6、12、24、48、72和96小时剖杀采样,制备石蜡切片,HE染色,镜检,并采用亲和免疫组织化学方法检测凡隆气单胞菌在斑点叉尾鮰体内的动态分布。结果显示,浸泡组在接种后第2小时,首先在鳃检测到阳性信号,6h后从脾和肾中检测到阳性信号,随后在肝和脑中也有少量阳性信号被检出;腹腔注射组在接种后第2小时即从脾和肾中检测到阳性信号,随后肝中也检测到阳性信号,而鳃中没有检测到阳性信号。两种感染方式阳性信号在各组织器官内的分布相似,主要出现在肾、脾和肝的吞噬细胞内、血管内、坏死区域、细胞间质区域以及少量实质细胞内,引起多器官的充血、出血、全身性炎症及变性和坏死,并随着感染时间的延长,检出量逐渐增多,肌肉、心脏、肠和眼球组织中没有检测到阳性信号。结果表明,凡隆气单胞菌感染途径多样化,自然环境中可通过鳃进入斑点叉尾鮰机体,肝、肾、脾是主要的感染靶器官,靶器官的损伤是造成斑点叉尾鮰死亡的重要原因之一。     

人工感染仔猪猪生殖与呼吸综合征病毒的核酸分布规律

根据猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)美洲株ATCC VR-2332保守区ORF6和ORF7的基因序列,设计了1条37 bp的寡核苷酸探针,末端用生物素标记.应用原位杂交方法对人工感染PRRSV SC-1株的28日龄仔猪进行了病毒核酸分布规律的研究.结果显示,感染后7～28 d于肝、脾、肺、肾、扁桃体、胸腺、肺门淋巴结、肠和大脑检测到阳性杂交信号,其中肺门淋巴结的阳性信号一直较强,脾的阳性信号逐渐增强,肺的阳性信号较弱,心脏未见阳性杂交信号.     

新城疫V_4株疫苗的研究——口服、滴鼻与同居感染免疫试验

本试验用V_4株、V_4株和克隆-30株联合苗对高母源抗体的雏鸡进行了 口服、滴鼻与同居感染免疫试验。结果口服或滴鼻免疫后一周即可产生坚强的免疫力,并可持续到第9周。同居感染鸡分别与口服、滴鼻免疫鸡在同一隔离器中饲养,同居后3周血清HI抗体效价开始上升,与免疫鸡抗体水平无明显差异,并具有同免疫鸡一样的保护力。     

鹦鹉副黏病毒的分离与鉴定

采集疑似自然感染新城疫病毒(NDV)的病死鹦鹉的肝、脾和胰腺,应用SPF鸡胚分离到1株病毒(YW-PMV),根据F基因片段测序结果,该病毒属于Ⅶh类,含有强毒株特征的蛋白酶识别序列RRRKRF,能凝集鸽红细胞,并能被新城疫阳性血清抑制,而不能被减蛋综合征(EDS)、禽流感H5、H7、H9血清抑制;电镜观察见到形态不规则、囊膜表面具有密集纤突的病毒粒子,直径100~200 nm。部分生物学特性表明,分离毒能致死鸡胚和番鸭胚,最小致死量和平均致死时间(MDT)分别为46.8 h和53 h;病毒接种鸡胚成纤维细胞和番鸭胚成纤维细胞均能引起细胞病变,并能被抗ND阳性血清中和;应用NDV荧光RT-PCR检测,该分离毒核酸为NDV阳性。上述结果初步表明该分离毒为鹦鹉副黏病毒强毒株。     

新城疫病毒调控宿主YB-1蛋白的初步研究

为了揭示YB-1蛋白在新城疫病毒(NDV)感染中的作用,对NDV感染细胞中YB-1表达水平以及亚细胞定位的变化进行了初步探索。利用RT-PCR技术,从鸡胚成纤维细胞中扩增了鸡源YB-1蛋白基因,序列分析结果显示其与其他物种YB-1有较高的相似性,与人YB-1的核苷酸和氨基酸相似性分别为88.3%和78.9%。随后利用间接免疫荧光技术检测了感染NDV强毒株Herts/33的He La和DF-1细胞中内源性YB-1蛋白的亚细胞定位变化,用q RT-PCR方法检测了YB-1 m RNA表达水平,通过Western-blot检测了YB-1蛋白水平的时相变化。结果显示,He La细胞中YB-1主要存在于细胞质,而禽源DF-1细胞YB-1集中在细胞核内;感染NDV后,两种细胞中的YB-1蛋白均在细胞质内呈现颗粒化聚集,同时在NDV感染后期He La细胞中YB-1蛋白出现少量降解。该研究初步揭示了NDV感染过程中YB-1蛋白的迁移现象,推测与NDV的复制过程相关,其具体的作用机制以及对NDV复制的影响尚待更深入的研究。