细粒棘球绦虫排泄分泌抗原研究——六钩蚴排泄分泌抗原及原头节可溶性粗抗原的SDS-PAGE

本文应用十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)首次对细粒棘球绦虫六钩蚴排泄分泌(ES)抗原的多肽组分进行了分析并同时对牦牛源棘球蚴原头节可溶性粗抗原的多肽组分进行了分析。应用10％凝胶,采用垂直板型电泳、考马斯亮蓝R-250染色进行SDS-PAGE的结果表明,六钩蚴ES抗原至少由14种多肽组分组成,分子量范围270～17.5KD,其中主要组分6种。原头节可溶性粗抗原至少由25种多肽组分组成,分子量范围230～17KD,其中主要组分13种。本项研究为功能性抗原的进一步分析、分离奠定了基础。     

奶牛流产衣原体OmpA抗原间接ELISA检测方法的建立

以奶牛流产衣原体外膜蛋白A(OmpA)作为抗原,筛选最佳反应条件,建立了奶牛衣原体病间接ELISA检测方法。结果显示,OmpA的最佳包被浓度为1∶320;血清最佳稀释度为1∶40;酶标二抗的最佳工作浓度为1∶2000;抗原的最适包被条件为37℃1h加4℃过夜;ELISA的阴性、阳性临界值为0.391。用本方法和衣原体间接血凝试验检测奶牛血清田间样品206份,两者的符合率为95.3%。本试验建立的OmpA-ELISA方法具有良好的特异性、敏感性和稳定性,可为牛衣原体病的诊断及流行病学调查提供有效工具。     

猪源鹦鹉热衣原体外膜主蛋白编码基因的克隆和序列测定

运用PCR技术扩增3株猪源鹦鹉热衣原体的外膜主蛋白(MOMP)编码基因,将扩增产物连接到pMD 18-T载体克隆,经酶切鉴定、PCR鉴定并分析其序列,3菌株的MOMP核苷酸序列的同源性为98.4%～99.0%,氨基酸序列的同源性为97.5%～98.1%,他们之间的差异很小,属于同一血清型.与国外发表的GPIC株及Mn株的MOMP比较,核苷酸序列的同源性分别为79.5%～80.4%和70.9%～71.3%.氨基酸序列的同源性分别为84.2%～84.7%和80.2%～80.5%.同时发现3菌株与GPIC株具有相似的基因可变区,而与Mn株的差异较大.     

细菌外膜蛋白的结构与功能

细菌外膜是典型、非对称性的磷脂双层结构，由脂质双层、微孔蛋白、脂蛋白、脂多糖组成，其主要成分为外膜蛋白（ＯＭＰ） 。现就ＯＭＰ 的结构、生理功能、免疫原性和致病作用机制进行论述     

禽传染性支气管炎病毒纤突蛋白的研究进展

禽传染性支气管炎病毒(IBV)是一种冠状病毒,其含有三种主要的蛋白结构成分:核衣壳(N)、膜蛋白(M)和纤突蛋白(S)。N蛋白的分子量约为50KD,M蛋白的分子量约为30KD。S蛋白是一种由S_1和S_2组成的寡聚蛋白,S_1和S_2均为糖多肽,其分子量分别为90KD和84KD,而用酶移去寡糖后的S_1和S_2的分子量则分别为64KD和61KD。     

国外动物衣原体病的流行近况

动物衣原体病是由鹦鹉衣原体(Chlamydia psittaci)引起人和多种动物的一种传染病。病原可通过病畜禽的排泄物、分泌物及流产胎儿胎衣在动物之间和人与动物之间互相传播,有的动物还可经呼吸道、交配等而传染。 (一)羊的感染 鹦鹉衣原体的羊衣原体株可引起羊的以流产为主的多种疾病。1981年在西苏格兰一群绵羊中有156只母羊发生流产,约占11.4％,Brodie等(1983)认为是由鹦鹉衣原体引起的,流产期间和流产后的血样分析,大多数流产羊有高滴度的鹦鹉衣原体抗体。Martinov(1883)报道,在保加利亚15个地区的3808只绵羊中有1263只发生流产,补体结合试验(CF)所检流产羊中有653只是衣原体引起的,占52％,其抗体滴度为1:32～1:2048。Andreani(1983)对意大利部分省的绵、山羊流产作了流行病学调查,在7个省27群的440只绵羊中,衣原体阳性105只,占23.86％,群患病为23/27;并证明从法国进口的21只绵羊和3只山羊也患有衣原体病。Purohit等(1983)在对印度的绵、山羊衣原体性肺炎的研究     

新疆阿克苏地区山羊衣原体性流产病原诊断的研究

近年来,我区虽年年进行布病免疫,但在考核验收合格县的山羊群中,流产仍然存在。1984～1985年最为严重,乌什县阿合牙乡牧业队有怀孕母羊7000余只,1984年流产率高达80％;洋海乡,1985年山羊流产率为40％。温宿县恰西力克牧场,1984年流产率为55.9％;古力瓦提乡4大队6小队流产率达74％。库车县二八台农场,1985年流产率为67％。为搞清山羊流产病原,对本地区山羊流产胎儿病料进行了分离、鉴定及血清学诊断,其结果:病原体为羊衣原体,与兰州兽医研究所报道的羊流产衣原体相同。     

家畜嗜衣原体TaqMan-MGB荧光定量PCR检测方法的建立

为快速检测家畜嗜衣原体,选取家畜嗜衣原体主要外膜蛋白(MOMP)基因的高度保守区域,设计特异性引物和探针,通过对反应条件的优化,建立家畜嗜衣原体TaqMan-MGB荧光定量PCR检测方法。结果显示,该方法的最低检测限为2.8×10copies/μL,在2.8×102~2.8×106 copies/μL范围内具有良好的线性关系,其标准曲线方程为y=-3.281 5x+41.396,线性相关系数r2=0.999 4,扩增效率为101.7%;该方法可特异性检测家畜嗜衣原体,对肺炎嗜衣原体、沙眼衣原体、鹦鹉热嗜衣原体、流产嗜衣原体等6种动物衣原体无交叉反应,特异性好;其批间重复试验和批内重复试验的变异系数分别为0.170 2%~0.467 2%、0.331 4%~2.796%,重复性良好。采用本试验建立的方法与OIE推荐的方法进行比较,二者的结果表现出良好的符合率。该方法的建立为家畜嗜衣原体的早期检测和流行病学调查提供了有效的检测手段。     

PRRSV和PCV2共感染对猪肺泡巨噬细胞CD80-CD86 mRNA转录的影响

用猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)与猪圆环病毒2型(PCV2)共感染40日龄健康大白仔猪,利用实时荧光定量PCR技术对共感染仔猪肺泡巨噬细胞(PAM)共刺激分子CD80-CD86的mRNA转录水平进行了定量分析。结果表明,在感染后第3 d和第7 d CD80与CD86 mRNA转录显著下调(P<0.05),感染后第14 d CD86 mRNA转录水平仍低于未感染对照组。尽管CD80 mRNA转录水平在第14 d和第28 d高于对照组,CD86 mRNA转录水平在第28 d高于对照组,两者在第42 d均高于对照组,但无显著差异。证实,PRRSV和PCV2共感染可导致猪肺泡巨噬细胞的共刺激分子CD80-CD86基因转录在感染早期明显受到抑制,PAM的抗原呈递能力受到影响。     

猪戊型肝炎病毒ORF2 C-端主要抗原区的克隆及原核表达

为研究猪戊型肝炎病毒(HEV)ORF2C-端主要抗原区的原核表达产物是否具有抗原性,用PCR技术对猪戊型肝炎病毒ORF2C-端基因进行扩增,经克隆与序列分析,发现该基因片段编码289个氨基酸残基。将该目的片段连接到原核表达载体pET-28a(+)中,转化表达菌BL21(DE3),成功构建了重组质粒pET-HEV-ORF2-C,其重组菌于37℃、0.5mmol/L IPTG诱导表达4h后,菌体裂解物经SDS-PAGE分析,在分子质量约为34ku处出现一新蛋白带,与预期的目的蛋白分子质量相符。质谱鉴定表明,成功地表达了HEV-ORF2C-端蛋白。Western-blot和抗体效价检测分析结果表明该重组蛋白具有良好的抗原性。     

猪流行性腹泻病毒抗原捕获ELISA抗体检测方法的建立与应用

用猪流行性腹泻病毒(PEDV)N蛋白单克隆抗体IgG包被酶标板,以纯化的PEDV作为捕获抗原,建立了PEDV抗原捕获ELISA抗体检测方法。优化后该方法的反应条件为:单克隆抗体包被浓度为2μg/mL,37℃包被2h加4℃过夜;含50g/L脱脂奶粉的磷酸盐缓冲液作为封闭液,37℃封闭3h;捕获抗原的质量浓度为5μg/mL,37℃作用3h;被检猪血清做1∶50稀释,37℃作用1h;山羊抗猪IgG-HRP稀释度为1∶2 000,37℃作用45min;底物最佳作用时间为37℃10min。设定阴阳性血清抗体对照,计算血清样品的S/P值,S/P值≥0.37判为阳性,S/P值0.323判为阴性,介于两者之间为可疑。用建立的ELISA检测猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型、伪狂犬病病毒、猪瘟病毒和口蹄疫病毒等阳性血清,结果均无交叉反应性。该方法的批间和批内变异系数均小于10%。相对国产商品化抗体检测试剂盒,其敏感性、特异性和符合率分别为94.6%、91.3%和93.3%。应用本方法检测山东、浙江和江苏省的308份猪血清样品,结果 PEDV抗体阳性率达89.29%。结果表明,建立的抗原捕获ELISA敏感性、特异性和重复性良好,可用于PEDV抗体检测和流行病学调查。     

猪传染性胃肠炎病毒S基因抗原位点B与C之间片段的克隆与原核表达

将RT-PCR扩增的猪传染性胃肠炎病毒S基因抗原位点B与C之间的目的片段经克隆、双酶切后连接于表达载体,经酶切、PCR和测序鉴定的阳性重组质粒转化BL21(DE3),用IPTG诱导重组菌株表达其融合蛋白.结果显示,目的片段的大小为357bp,序列分析表明,S基因与其他猪传染性胃肠炎病毒相应基因具有很高的同源性;Western-blotting检测表明,分子质量约34ku的融合蛋白具有良好的反应原性.     

基于牛布氏杆菌重组外膜蛋白的混合抗原间接ELISA方法的建立

为建立布鲁菌的快速检测方法,通过引物设计、PCR扩增、表达载体构建、SDS-PAGE和Western-blot分析对牛布鲁菌3种外膜蛋白OMP19、OMP22、OMP28基因进行原核表达,利用亲和层析法纯化3种重组蛋白,将3种重组蛋白混合作为包被抗原,经重复性、灵敏度和特异性试验建立了布鲁菌抗体检测间接ELISA,并对300份牛血清样品进行检测应用,同时使用进口的商品化试剂盒进行平行检测。结果显示,成功构建了p Cold-TF/OMP19、p Cold-TF/OMP22和p Cold-TF/OMP28原核表达载体,诱导后分别表达大小分别为69、74和80 ku的可溶性且具有良好反应原性的重组蛋白r OMP19、r OMP22和r OMP28。基于此3种重组蛋白混合抗原建立的间接ELISA具有良好的重复性和特异性,其灵敏度达1∶1 600。临床样品检测试验结果显示,与进口试剂盒总符合率高达96%(288/300),其中阳性符合率为93.5%(58/62),阴性样品符合率为96.64%(230/238)。将3种重组外膜蛋白联合作为包被抗原进行牛布鲁菌抗体检测,为我国牛布鲁菌病的诊断检测技术相关研究提供了新的思路和参考。     

猪带绦虫cAMP依赖性蛋白激酶催化亚基(PKA-C)基因的鉴定及表达

为鉴定猪带绦虫cAMP依赖性蛋白激酶催化亚基基因(Ts PKA-C),分析其作为诊断抗原的可行性,利用猪带绦虫基因组和转录组数据设计猪带绦虫Ts PKA-C特异引物,以猪带绦虫成虫总RNA为模板,通过RT-PCR扩增Ts PKA-C基因的完整ORF,并通过生物信息学分析进行鉴定。构建p ET-30a(+)-Ts PKA-C重组表达载体,在大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达。纯化的目的蛋白进行SDS-PAGE和Western-blot分析。结果表明,Ts PKA-C的ORF由1 032个核苷酸组成,编码343个氨基酸残基,与细粒棘球蚴和多房棘球蚴氨基酸序列的一致性分别达78.7%和98.0%;Ts PKA-C具有蛋白激酶A的结构域及其催化亚基特征性活性位点,且存在9个潜在的线性B淋巴细胞抗原表位。Ts PKA-C基因的表达产物主要以包涵体形式存在,且可与猪囊尾蚴病阳性血清发生反应,在42 ku处产生特异条带。本研究克隆并鉴定了Ts PKA-C基因,其表达产物可被猪囊尾蚴病阳性血清所识别。     

A型口蹄疫病毒多抗原表位杆状病毒表达载体的构建及表达

为构建A型口蹄疫病毒(FMDV)多抗原表位杆状病毒表达载体,将A型FMDV上5个B细胞表位(VP1140-160aa、VP270-80aa、VP352-67aa、3B29-42aa和3D16-30aa)和4个辅助性T细胞表位(VP1200-213aa、VP420-34aa、3A21-35aa和3D346-370aa)通过人工合成的方法串联起来构建复合多表位基因B。然后将其克隆至杆状病毒表达载体pFastBac HTB。将酶切和测序鉴定正确的阳性重组质粒pFastBac HTB-B转化至大肠杆菌DH10Bac感受态细胞进行蓝白斑筛选。将PCR鉴定正确的重组杆状病毒质粒利用CellfectinⅡReagent转染至Sf9细胞。通过间接免疫荧光试验和Western-blot检测表达情况。结果显示,能够得到与A型FMDV猪抗阳性血清结合的蛋白,大小约为22.3ku,与预期结果相符。结果表明,成功构建了A型FMDV多抗原表位杆状病毒表达载体,并在昆虫细胞中正确表达,为下一步蛋白纯化奠定了基础。     

肝片吸虫诊断抗原提纯方法的研究

用肝片吸虫成虫粗制抗原经葡聚糖凝胶(Sephadex G-200)分离到4个蛋白峰,以间接血凝法(IHA)测定各峰抗原活性,除第Ⅳ峰外,其余各峰均有活性,以Ⅱ、Ⅲ两峰的特异性最强。提纯抗原能检出人工感染10～100个囊蚴14天以上的羊抗体。提纯抗原保存60个月,其效价不变。     

进口澳大利亚狄高雏鸭发生衣原体病

鸭衣原体病是由鹦鹉热衣原体(Chlamydia psittaci)引起的一种接触性传染病。它可感染鸟禽类、哺乳类、节肢类和人。本病对幼鸭的危害性较大,成鸭多为隐性感染。1986年1月18日,经堪江口岸进口一批来自澳大利亚的狄高(Tegel)雏鸭。放在一幢新建并经严格消毒,事先经我们验收合格的栏舍隔离饲养。在隔离检疫期间,常有鸭死亡。经流行病学调查、临床症状观察、病理剖检、血清学和病原学等综合诊断,证明该批进口鸭发生了衣原体病。 (一)发病情况 该批雏鸭抵达堪江口岸时存活5595只,已是2日龄。由于途中脱水严重,大多体弱。抵达目的地后前3天死亡428只,占7.65％。据不完全统计,进口后的第4～60天内又陆续出现病残淘汰和死鸭共400余只,占存活数的8％。在进口42天时,我们再次到现场检疫,发现部份病鸭消瘦,厌食,步态不稳,羽毛松乱,两翅下垂,眼和鼻孔流出浆液性或脓性分泌物,眼部周围羽毛湿润,其下缘常有干涸的痂块;结膜潮红、肿胀、甚至外翻或闭眼;部分见有头肿下痢,排出灰白色、淡绿色稀粪。重者不时抽搐震颤,     

旋毛虫TsP53抗原基因的原核表达及抗原性分析

应用RT-PCR方法从旋毛虫肌幼虫总RNA中获得TsP53基因片段,限制性酶切后连接到表达质粒pET30a中,转化大肠杆菌DH5α。筛选阳性克隆,经限制性酶切、PCR分析及测序鉴定后,将重组表达质粒pET30a-TsP53转化大肠杆菌BL21(DE3),以IPTG诱导表达。SDS-PAGE分析表达产物,对表达产物纯化后通过间接ELISA鉴定重组蛋白的抗原性。结果显示,成功构建了重组表达质粒pET30a-TsP53,测序结果表明插入片段为1 176 bp,编码391个氨基酸残基,与旋毛虫P53抗原基因序列(U25127)有99%的同源性,开放阅读框正确。含有pET30a-TsP53重组表达质粒的大肠杆菌BL21(DE3)诱导后得到了高效表达,SDS-PAGE显示表达产物分子质量约为50 ku,主要以包涵体形式存在。间接ELISA结果表明,重组抗原可以被旋毛虫感染不同时期的猪血清特异性识别,有望用于旋毛虫病的免疫诊断。     

口蹄疫病毒表面的三个中和抗原位点

我们用5个高效价中和性单克降抗体,从O型(O_1Kaufbeuren)口蹄疫(FMD)病毒中分离出30个突变体,并用7株单克隆抗体对其进行了鉴定。酶联免疫吸附测定(ELlSA)和交叉中和试验揭示了三个互不重叠的抗原位点(Antigenic site),其中两个抗原位点,其内部的抗原基(epitope)有两个或多个相互重叠。三个抗原位点中,有两个立体结构性很强,在病毒亚单位或分离的病毒多肽中测定不到它们的存在。第三个抗原位点的立体性较弱,主要部分是连续的。ELlSA试验表明,与之对应的单克隆抗体与12 S亚单位、分离的VP_1、甚至人工合成的VP_1中141～160号氨基酸寡肽都有一定的结合力。病毒多肽的电聚焦分析虽未能揭示抗原位点的确切位置,但突变体的VP_1电泳变化率很高,说明三个抗原位点可能都与VP_1有关。我们用引物延长序列分析法对10个突变体和3个亲本病毒分离物的VP_1编码区进行了碱基顺序分析。结果发现,只有5个氨基酸发生了突变,而且其中仅148号氨基酸的变化能产生对中和作用的完全抗性。144、154、208号和另一个位置未定(可能在VP_1之外的其他多肽中)的氨基酸的变化仅能产生对中和作用的部分作抗性。因此,我们用突变体确定的这一抗原位点,与以前根据亚单位免疫原性直接确定的位点相当。该位点有一定立体结构依赖性,至少由三个区     

牛白血病病毒结构蛋白及抗原活性分析

对从FLK/BLV带毒细胞系培养上清提纯的病毒粒子经SDS-PAGE分析,发现主要有11种蛋白组分,其分子量分别为12kd、15kd、24kd、28kd、30kd、45kd、52kd、62kd、70kd、83kd、92kd。其中30kd、52kd、62kd、70kd为糖蛋白;Western Bloting实验表明,BLV主要有8种抗原活性组分,分别是P_(15)、P_(24)、P_(28)、gP_(30)、gP_(52)、gP_(62)、gP_(83)和gP_(92)。