免疫印渍技术诊断耕牛血吸虫病

酶联免疫印渍技术(下称EITB)是近几年发展起来的新技术,它结合了SDS-PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)的高分辨力和酶联免疫反应的高敏感性和特异性,已成为生物化学、免疫化学和分子生物学等研究领域中的一项十分有用的分析手段。这几年该技术已被应用于分析寄生虫抗原及寄生虫病的免疫诊断。本文应用SDS-PAGE分析了血吸虫尾蚴、成虫、虫卵抗原及肝片吸虫成虫抗原,并对EITB在耕牛血吸虫病免疫诊断上的应用价值作了初步的探索。     

预防动物传染病的新型疫苗

随着生物学的深入研究,出现了许多新型学科(分子遗传学,分子免疫学,分子微生物学,分子生物化学)和新技术(DNA重组,生物活性大分子的人工合成,淋巴细胞杂交瘤)。以微生物为实验对象,从分子水平进行了探索性和实用性研究,这为研制新型疫苗提供了理论和技术。 (一)基因工程苗 重组DNA技术的出现是生物科学中的一场革命,它为人类进一步认识遗传物质的组成及表达的调控、工业化生产各种生物制品展示了光辉灿烂的前景。从细菌或病毒的DNA有意义链上用限制性核酸内切酶切下带有粘性末端的目的基因,用连接酶把具有遗传标志的质粒和目的基因连为一体,     

原位反转录PCR技术的应用

针对已有资料中对于以DNA为靶基因序列的原位 PCR介绍较多,而对于原位反转录PCR的介绍很少,但在实际研究工作中有很多检测的靶基因是 RNA(病毒的或基因组的 RNA)的实际情况,就原位反转录PCR技术的基本原理、影响试验结果的关键因素和步骤,如组织细胞的固定、引物和探针的选择、蛋白酶及DNA酶消化、假阳性及假阴性的产生等进行了概述,旨在通过探讨上述问题,对该技术的实际应用有所指导。     

A群猪轮状病毒G5型OSU株VP7基因的克隆及其重组杆状病毒的鉴定

利用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增出A群猪轮状病毒(PRV)G5型OSU株长度约为1.0kb的基因片段,将其克隆到pMD 18-T载体上进行测序鉴定,证明为该PRV的VP7蛋白基因,与已发表的该PRV VP7基因序列的同源性为99.8%.将该基因黏端克隆至表达载体PblueBAChisC质粒中,酶切及PCR鉴定表明获得了PRV-VP7蛋白基因与PblueBAChisC质粒的阳性重组子.纯化该重组质粒并与线性杆状病毒DNA分子Bac-N-Blue共转染昆虫细胞sf9,5 d后收获重组病毒.通过对重组杆状病毒DNA分子的酶切及PCR鉴定,确定PRV-VP7基因已正确插入.将经3次蚀斑筛选纯化后的该重组杆状病毒接种于sf9细胞大量增殖后,获得了重组杆状病毒PRV-VP7蛋白的真核表达.     

ELISA诊断猪旋毛虫病条件的研究

七十年代酶标技术广泛用于人、畜寄生虫病诊断。1976年Ruitenbers等用旋毛虫幼虫制备的粗抗原,以酶标技术生前检测猪旋毛虫(人工感染)病,获得比荧光抗体技术测得更为满意的结果。本文用酶标间接法(ELISA)。以自己研制的碱性磷酸酶(Alkaline Phosphrase、AKP)标记兔抗猪IgG,磷酸苯二钠为底物,对旋毛虫病猪和阴性猪进行检测,同时对抗原、抗体、pH、温度和时间进行了探讨。     

RAPD技术及其在动物医学中的应用

PCR是 1985年兴起的一项基因体外扩增技术。十多年来在生命科学研究领域发挥了前所未有的作用。 1990年Williams等[1] 在PCR技术的基础上建立了一种新的揭示基因组多态性的方法 ,即随机扩增多态性DNA (RAPD)技术。虽然RAPD技术诞生的时间短 ,但由于它具有快速灵敏、程序简便等优点 ,所以在短时间内就被广泛应用。1　RAPD技术的原理及分子机制1.1　RAPD技术的原理RAPD技术是建立在PCR技术的基础上。它利用一系列 (通常数百个 )不同的随机排列碱基序列的寡核苷酸单链 (一般为 10碱基聚合体 )为引物 ,对所研究的基因组DNA进行P…     

应用PCR-RFLP分析鉴别广西鸡毒霉形体

针对鸡毒霉形体 (MG) 16S和 2 3SrRNA基因间的高变区序列设计合成了 1对引物 ,对MG菌株进行了PCR扩增 ,获得了 1条 899bp的DNA片段 ,而其他禽病病原DNA无扩增。扩增产物经用限制性内切酶AfaⅠ和DraⅠ进行酶切片段长度多态性分析 ,表明各MG菌株酶切图谱间均存在差异。     

鸡柔嫩艾美球虫子孢子表面抗原基因λMzp5-7在Hela细胞中的表达

将已构建的柔嫩艾美球虫(Eimeria tenella)子孢子表面抗原pMD-Mzp5-7基因片段定向亚克隆到核酸疫苗载体pVAX1上,构建了真核表达载体pVAX-Mzp5-7,酶切鉴定正确后,用脂质体介导的转染法转染Hela细胞,进行了体外表达;并用裸DNA质粒经肌肉接种鸡体内表达。经Western-blotting及RT-PCR鉴定,表明该基因在Hela细胞及鸡体内均获得表达,并有一定的反应原性。     

奶牛乙型肝炎病毒的研究

迄今为止,在多种节肢动物体内或脊椎动物体内已查出了乙肝病毒表面抗原(HBsAg)。1984～1986年,我们分别用RPHA和ELISA法对某场200头奶牛进行了乙肝病毒表面抗原(HBsAg)、e抗原(HBeAg)和e抗体(HBeAb)的测定,已证实在奶牛血清中存有上述三种成份。为证实在奶牛血清中存有类人乙肝病毒,我们又采用免疫酶技术(ELISA)和免疫电镜技术(IEM)作了测示和观察,其结果如下。 材料与方法     

限制性内切酶分析技术在细菌诊断中的应用

(一)细菌限制性内切酶分析原理 限制性内切酶是细菌产生的一类防范外测DDNA酶,它可以识别DNA上的特异位点,并从该点将DNA分子切断,各种限制酶的识别位点不同,对不同DNA分子可以切出大小及数目不同的片段,如果大小相同的两个DNA分子,其酶切片断相同,则可以判断它们完全或几乎相同,如两种或更多种限制酶均切出相同的片段,则     

鸡传染性喉气管炎病毒gB基因的扩增及酶切分析

以从内蒙古区分离的 2株传染性喉气管炎病毒 (ILTV)株的DNA为模板 ,用设计好的 1对引物对这 2株毒株的 gB基因进行了PCR扩增 ,并对扩增产物分别用BglⅡ、PstⅠ、HindⅢ限制性内切酶酶切分析。结果表明 ,2个分离株均能特异性地扩增出该病毒 gB基因片段 ,片段大小完全一致 ,为 2 .6kb ;扩增产物的酶切图谱与参考株完全一致。     

胸膜肺炎放线杆菌体内表达基因的筛选

利用体内诱导抗原技术对胸膜肺炎放线杆菌(APP)体内表达的基因进行了初步筛选.将收集到的5份感染了APP1型的猪血清混合,分别用体外培养的APP1和大肠杆菌BL21(DE3)的全菌及全菌裂解物进行吸附,用ELISA方法检测吸附效果,经吸附后血清D450nm分别由原来的0.927和0.239降低为0.196和0.078.同时,将APP1基因组DNA以Bsp143 Ⅰ进行酶切,回收500～2000 bp的片段,与pET30a/b/c载体连接,构建了APP1基因组质粒表达文库,库容量(CFU)为2.0×105.用吸附后的血清通过菌落原位免疫杂交筛选该基因组表达文库,从3 000个菌落中获得了12个阳性克隆.     

酶标记免疫吸附试验

酶标记技术是在标记抗体(荧光标记、同位素标记)试验和组织化学基础上发展起来的一种新技术。1966年Nakane和Avra-meas等首先应用酶标记的抗体和细胞抗原发生反应,再用细胞化学染色法显示出病毒抗原在细胞内的位置。其后,Miles和Hales首先在免疫测定中用酶代替同位素。直到1971年Van Weeman和Schuurs,以及En-gvall和Perlman才分别详细地介绍了酶免     

生物芯片及其在疾病诊断中的应用

1991年Fodor等[1] 提出DNA芯片的概念后 ,近年来以DNA为代表的生物芯片 (biochip)技术得到了迅猛的发展。目前 ,已有多种不同功用的生物芯片问世 ,这将为生命科学的研究、疾病诊断和治疗、新药的开发、司法鉴定、食品卫生监督和航天航空等领域带来一场革命[2 ] ,特别是在遗传病、肿瘤病、感染性疾病及其他一些疑难疾病的诊断中取得重大突破。1　生物芯片简介生物芯片技术是将生物分子 (寡聚核苷酸、cDNA、基因组DNA、多肽、抗原、抗体等 )固定于硅片、玻璃片、塑料片、凝胶和尼龙膜等固相介质上形成的生物分子点阵 ,在待分析样品中的…     

产蛋下降综合征病毒PCR检测方法的建立

根据已报道的腺病毒DNA序列 ,设计合成了 1对核苷酸引物 ,引物间隔约 63 0bp。用该引物对EDS76病毒内蒙古分离株 (N3 ,N4 )和参考株 (AV 1 2 7)核酸进行聚合酶链式反应 (PCR)。结果 ,均扩增出了约 63 0bp的特异性DNA片段。所建立的PCR方法可检出 1 0 0pg的样品模板。结果表明 ,此PCR方法是检测EDS76病毒的一种简便快速、特异性强和灵敏度高的方法     

采用二温式聚合酶链反应扩增鸡喉气管炎病毒TK基因的研究

建立了检测鸡喉气管炎病毒(ILTV)的二温式聚合酶链反应(二温式PCR),根据已报道的ILTV TK基因的序列,设计并合成了1对引物,用二温式PCR对5株不同ILTV DNA进行扩增.该对引物对5株ILTV DNA均扩增出与预期大小相一致的647 bp的扩增产物,而对新城疫病毒(NDV)、传染性支气管炎病毒(IBV)、禽呼肠孤病毒(ARV)、禽沙门氏菌、鸡毒霉形体和禽巴氏杆菌等6种禽病病原体的扩增,结果全部为阴性.该二温式PCR可检测到1fg的ILTVDNA模板,其敏感性比常规三温式PCR高1万倍.     

多聚酶链反应技术的发展现状

多聚酶链反应(Polymerase Chain Reac-tion,PCR),又称为无细胞分子克隆系统或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增法,是近年来发展的一种体外基因扩增技术。该技术可将特异的基因序列扩增几百万倍,从而大大提高基因的分析检测能力,因此已被广泛用于生物学的各个领域。由于实际需要,促进了PCR的不断完善和发展,已衍生出多种多样的PCR,如反向PCR、锚定PCR、     

猪生殖与呼吸综合征病毒ORF6片段的cDNA克隆及鉴定

根据已发表的PRRSV基因组序列,设计并合成了1对特异扩增ATCC VR-2332株的ORF6基因的引物.以ATCC VR-2332基因组为模板,通过RT-PCR扩增出586 bp的cDNA产物.将该cDNA片段经T-A连接插入pGEM-Teasy载体中,用重组质粒转化大肠埃希氏菌JM109,获得重组质粒转化菌.对重组质粒DNA进行PCR及酶切鉴定,证明插入的DNA片段与PCR扩增的DNA片段大小相符.对整个ORF6进行序列分析,将测序结果与已发表的ATCCVR-2332序列相比较,证实插入片段为PRRSV VR-2332的ORF6片段的cDNA.     

猪瘟酶标抗体和荧光抗体诊断猪瘟的比较试验

荧光抗体技术始子四十年代,在1969年和1970年间,法国巴斯德研究所专门就荧光抗体技术在兽医上的应用召开过两次国际性会议。目前荧光抗体技术已广泛用于细菌、病毒、原虫的鉴定,传染病的快速诊断,肿瘤抗原的研究等。继荧光抗体之后,在六十年代,医学工作者即开始用酶代替荧光素标记抗体,作生物组织抗原的鉴定和定位,从而创造了酶标记抗体新技术。近年来,国内亦开展了这方面的研究。笔者应用猪瘟酶标抗体和荧光抗体诊断猪瘟作了对比试验,现将其结果介绍如下。     

细菌分型的分子生物学技术研究进展

回顾了传统细菌分型方法的重要作用,并重点介绍了近年发展得比较成熟的脉冲凝胶电泳(PF-GE)、低频限制性切割位点聚合酶链式反应(IRS-PCR)、随意扩增多态性DNA(RAPD)、扩增片段长度多态性(AFLP)、多位点酶电泳(MLEE)和多位点测序分型(MLST)等6种用于细菌分型的分子生物学技术的原理、特点以及应用情况,指出了其他细菌分型技术,如ARDRA、SSCP、DGGE、TGGEI、S等的不足,对基因芯片技术和实时PCR在细菌分型上的应用潜力进行了展望。