三株传染性法氏囊病病毒超强毒株全基因组的克隆与序列分析

为了获得本实验室3株(HuB-1、HeB10XS02、SD10LY01)传染性法氏囊病病毒(IBDV)分离毒株的全基因组序列,并了解其序列特征,首先测定了这3株毒株对SPF鸡的致死率,然后利用融合PCR技术扩增获得全基因组序列,对其进行遗传进化分析。结果显示,3株毒株对SPF鸡的致死率均在60%以上,为IBDV超强毒株(vvIBDV)。遗传进化分析表明,3株分离毒株的A节段均位于超强毒分支。IBDV的B节段分为明显的3个亚群,其中HuB-1、SD10LY01的B节段属于第Ⅲ亚群,HeB10XS02的B节段则属于第Ⅱ亚群。第Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ亚群之间在VP1蛋白上存在17个保守氨基酸差异位点,其中第145~147位氨基酸形成独特的"三联体"基序,不同亚群具有不同的基序。本研究结果为更好地了解vvIBDV基因组特征以及致病性分子基础的研究提供了重要理论依据。     

猪流行性腹泻病毒YZ2016全基因组测序与稳定性分析

2016年我国江苏扬州某规模化养猪场暴发严重腹泻,本实验室通过RT-PCR确定其病原为猪流行性腹泻病毒(PEDV)。将阳性样品接种Vero细胞,盲传5代后出现典型病变,并通过RT-PCR及间接免疫荧光试验确定成功分离到PEDV毒株,命名为PEDVYZ2016。采用分段重叠法对分离株基因组扩增测序,获得其全长序列。遗传进化分析显示PEDV YZ2016与近年流行毒株亲缘关系较近,与经典毒株亲缘关系较远。PEDV YZ2016与BJ-2011-1、LZW全基因组核苷酸序列一致性可达99. 2%,与BJ-2011-1、OKN-1/JPN/2013 S基因推导氨基酸序列一致性可达98.5%。此外,分离株S基因发生多处点突变,导致其抗原表位及糖基化位点均发生部分改变。同时,序列比对分析显示不同代次的S、ORF3、N基因核苷酸突变率均极低。结果表明,本研究分离的PEDV YZ2016株属流行变异毒株,且在传代过程中遗传稳定性良好。     

广西地区2004-2010年猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5及ORF7基因的遗传变异分析

为了解广西地区猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)流行毒株的分子遗传进化情况,对2004-2010年间广西的PRRSV阳性病料进行了ORF5、ORF7基因扩增和序列分析。结果显示,所获得的毒株均属于美洲型毒株,其ORF5基因间的氨基酸序列同源性为89.6%～99.5%,与VR-2332、Ch-1a、JXA1株的氨基酸序列同源性分别为84.6%～91%、89.6%～95.5%和93%～99%,而与LV的同源性为54.7%～56.7%;ORF7基因间的氨基酸序列同源性为87.1%～99.2%,与VR-2332、Ch-1a、JXA1株的氨基酸序列同源性分别为91.1%～96%、91.9%～96%和89.5%～99.2%,而与LV的同源性为55.6%～58.1%。基于ORF5和ORF7基因核苷酸序列绘制的遗传进化树,可将所有PRRSV分离株分为4个亚群,广西地区的毒株分布在以CH-1a为代表的Ⅱ亚群、以HB-1为代表的Ⅲ亚群和以JXA1为代表的Ⅳ亚群,以Ⅳ亚群为主。表明当前广西PRRSV流行毒株以美洲型Ⅳ亚群为优势基因亚群,并且各毒株间的ORF5和ORF7基因序列存在一定差异,但没有明显的地域特征。     

赛鸽新城疫病毒南京分离株的生物学特性及其F和HN基因的分析

从南京市某赛鸽公棚发病鸽脑组织中分离到1株鸽新城疫病毒,命名为Pi/NJ/CH/4416/2016(简称ND4416)。各项生物学特性试验结果表明,该分离株为鸽新城疫强毒,对鸽具有高致病性,对鸡的致病性相对较低。经RT-PCR扩增、测序得到分离株的F基因和HN基因序列。F基因分析表明,其裂解位点的氨基酸序列为~(112)R-R-Q-K-R-F117,是典型的强毒株共有序列。F、HN基因遗传进化分析发现,本次分离株的基因型为Class II,VIb亚型,且与目前国内流行株属于同一遗传分支,这些毒株与比利时流行株PPMV-1/Belgium/11-09620/2011(JX901124.1)的亲缘关系相近,推测近年国内流行毒株可能来源于比利时。本次分离毒株与弱毒疫苗株La Sota(AF077761.1)的遗传距离较远。生物信息学分析显示,该鸽源分离株HN蛋白第491~500位的一个线性抗原表位发生了改变,血清学试验也显示本毒株与La Sota疫苗株的抗原性差异明显,在一定程度上说明该鸽源毒株已经发生了抗原性变异。     

蛋鸡J亚群禽白血病病毒HB09JY03株的分离鉴定及其全基因组序列分析

利用DF-1细胞系、ELISA群特异性抗原检测以及亚群特异性间接免疫荧光法,从湖北省某鸡场送检的海兰褐蛋鸡病料中分离鉴定出1株J亚群禽白血病病毒(ALV-J),命名为HB09JY03。为了解其分子特征,对其进行了全基因组测序,并与其他毒株进行了比较。结果表明,HB09JY03分离株的gag和pol基因非常保守,与各参考毒株的同源性为97.5%～99.0%;env基因的同源性为88.4%～97.5%;其3′UTR出现部分rTM区段缺失现象。与参考毒株相比,HB09JY03分离株与HPRS-103株的亲缘关系较近,可作为我国蛋鸡ALV-J株生物学特性和致病机制研究的良好材料。     

福建地方鸡B亚群禽白血病病毒的分离鉴定

在对福建某地方鸡群进行禽白血病流行病学调查的基础上,对疑似病例进行p27抗原检测,取阳性血清接种DF-1细胞分离病毒。采用PCR及间接免疫荧光试验鉴定其亚群并对其gp85基因进行序列分析。结果显示,分离株FJ15HT0的B亚群特异性PCR检测呈阳性;IFA显示感染该毒株的DF1细胞中可检测到p27抗原,而未检测到J亚群特异性囊膜蛋白的表达;对该毒株gp85序列进行分析,发现与多株ALV-B参考毒株氨基酸序列的同源性为91.6%~98.8%,其中与GX10LS01株同源性最高为98.8%,与A、C、D、E亚群同源性在69.4%~84.2%,与J亚群同源性仅为36%~38%。该研究首次分离并鉴定河田鸡群中ALV-B,为后续的研究奠定了基础。     

J亚群禽白血病病毒Hrb-1和JL-2株囊膜基因的克隆及遗传分析

采用特异性检测J亚群禽白血病病毒的RT PCR方法 ,自哈尔滨市及吉林省患病鸡群中分离鉴定出 2株J亚群禽白血病病毒 ,分别命名为Hrb 1和JL 2。 2株病毒经SPF鸡胚成纤维细胞增殖 ,获取其前病毒DNA。采用依据原型毒株HPRS 10 3cDNA序列设计并合成的 1对引物 ,进行PCR扩增 ,得到了JL 2和Hrb 1的囊膜基因。分别构建了重组质粒 pMD18 T JL2 /env和pMD18 T Hrb 1/env。在对 2株病毒囊膜基因进行序列测定的基础上 ,将囊膜基因中 gp85和 gp37的核苷酸序列及其推导氨基酸序列与国际上不同的参照毒株以及国内部分分离株进行了比较分析 ,结果表明 ,JL 2和Hrb 1分别与美国病毒株adol hc 1和UD3有着较大的亲缘关系。     

三株鸡马立克氏病病毒流行毒株基因组重复区的序列测定及分析

对国内3株马立克氏病病毒血清1型(Marek’s disease virus type 1,MDV-1)流行毒株的基因组重复区进行序列测定及分析,并与GenBank中登录的MDV-1参考毒株序列进行比较。结果显示,3株毒株的基因组重复区序列具有较高同源性,在进化上属于一独立分支。3株毒株的长重复区长度约为12kb,预测的开放阅读框(ORF)分别为43、40、43个;短重复区约为12kb,预测的ORF分别为27、25、26个。3株毒株的多个ORF中存在它们特有的共性氨基酸突变,是国内MDV-1流行毒株的特有的遗传性特征。该研究为我国MDV的流行、遗传变异及防控研究提供了材料。     

猪伪狂犬病病毒gC基因的克隆及其部分生物学特性的分析

采用PCR方法扩增出12株伪狂犬病病毒(PRV)的gC基因全序列,并测序,使用生物学软件对这12株PRV gC基因序列和GenBank上登录的6条gC基因序列进行了生物信息学分析和预测.结果显示,PRV gC基因开放阅读框的核苷酸长度为1437～1464 bp,编码478～487个氨基酸.在遗传进化关系上,四川省流行的PRV毒株与日本、欧洲、美洲分离株的亲缘关系较近,而与我国其他地区的分离株亲缘关系较远.这些毒株的蛋白疏水性、抗原表位和高级结构等具有相似性,但也存在一些变化和差异.表明,PRV gC基因具有较高的保守性,但可能存在抗原漂移现象.     

J亚群禽白血病病毒SCAU-0901株的分离鉴定

在组织病理学观察的基础上,经接种DF-1细胞系、ELISA抗原检测、聚合酶链式反应(PCR)以及亚群特异性免疫荧光试验(IFA),从送检的疑似禽白血病感染的麻黄肉种鸡中分离并鉴定出1株J亚群禽白血病病毒(ALV-J),命名为SCAU-0901.利用特异性引物分别扩增出长度为545 bp和2.2×103bp的目的片段,并对目的片段进行了克隆测序.序列分析发现,SCAU-0901株的gp85基因与国内外各ALV-J毒株相应核苷酸序列的相似性为86.1%～95.1%,其中与BJ0303株的相似性最高(95.1%),与ADOL-7501株的相似性最低(86.1%).系统遗传进化分析表明,SCAU-0901株的gp85基因片段与BJ0303株的亲缘关系最近.     

3种基因型鸡传染性支气管炎病毒免疫对tl/CH/LDT3/03株的保护性

以鸡传染性支气管炎病毒(IBV)S1基因比较为基础,分析了IBV tl/CH/LDT3/03型毒株与中国其他流行IBV毒株之间的关系,选择5株代表3种基因型的毒株进行动物免疫攻毒试验,以发病率、死亡率、抗体产生及在不同脏器中的病毒检出率作为指标来评价异种毒株对tl/CH/LDT3/03株的保护性。结果显示,同种致弱毒株对tl/CH/LDT3/03强毒株具有良好的保护性,而异种毒株对tl/CH/LDT3/03强毒株的保护性低。     

鸡传染性支气管炎病毒HH06分离株的鉴定及其S1基因的分子特征

从黑龙江省哈尔滨市某鸡场疑似鸡传染性支气管炎的发病蛋鸡肾组织病料中分离到1株病毒,命名为HH06。该分离毒株经SPF鸡胚传代、血凝试验、负染电镜检查以及动物回归试验,证实为IBV。用RT-PCR扩增得到了HH06株S1基因片段,经测序,并与国内外IBV参考毒株的相应基因进行序列比较分析。结果表明,HH06株S1基因由1 620个核苷酸组成,推导的多肽由540个氨基酸残基组成,推导的氨基酸裂解位点序列为5个连续碱性氨基酸HRRRR。HH06株S1基因序列与除LX4外的其他参考株相应基因的核苷酸及氨基酸序列同源性均较低,亲缘关系均较远。初步证实HH06株为不同于IBV疫苗株的一个新毒株。     

腺胃病变型鸡传染性支气管炎病毒D971毒株S1基因的序列测定与分析

采用RT PCR方法扩增了鸡传染性支气管炎病毒D971毒株预期的 163 6bp的S1全基因DNA片段 ;以Sanger’s双脱氧末端终止法测定出其核苷酸序列 ,推导出了氨基酸序列 ,并用有关软件构建了S1基因进化树。结果表明 ,IBV D971毒株与国内外AF14 0 3 5 2 (山东农业大学 )、AF15 4841(山东农业大学 )、AF193 43 2 (青岛动物检疫所 )、AY0 43 3 12 (中国农业大学 )、AF3 975 2 8(四川农业大学 )、AY0 43 2 2 1(浙江农业大学 )、AF3 5 2 3 12 (浙江农业大学 )、U2 95 2 2 (澳大利亚 )和M2 1883 (英国 )毒株的核苷酸同源性分别为 99%、99%、95 %、94%、87%、86%、88%、82 %和 80 % ,氨基酸序列同源性依次分别为 93 %、93 %、87%、86%、83 %、83 %、82 %和 80 %。     

Ⅰa型和Ⅱ型牛源无乳链球菌sip基因的遗传进化分析

为分析8株Ⅰa型和10株Ⅱ型牛源无乳链球菌的sip基因特征和遗传进化关系,采用PCR方法扩增目的基因并克隆入pGEM-T Easy载体后测序,进行了同源性分析和构建了遗传进化树。结果显示,18株菌株的sip基因全长均为1 305bp,无基因缺失。8株Ⅰa型菌株之间的sip基因核苷酸同源性和推导的氨基酸同源性分别为99.8%～100%和99.5%～100%;而10株Ⅱ型菌株之间的sip基因核苷酸同源性和推导的氨基酸同源性均为100%。18株菌株与其他不同来源、不同血清型参考菌株相应序列的核苷酸同源性和氨基酸同源性分别为97.8%～100%和96.8%～99.8%。sip基因的遗传进化树分析显示18株菌株处于2个不同的大分支上,其中Ⅱ型菌株处于同一分支上,与中国菌株Mf32和美国菌株GB01068、GB01089的亲缘关系最近,而Ⅰa型菌株处于另一个分支上,与中国菌株Ly2和美国菌株GB00549的亲缘关系最近。说明8株Ⅰa型菌株和10株Ⅱ型菌株分别来源于不同的菌株,但它们的sip基因同源性很高,而且与参考菌株的sip基因相比,目前仍属于保守基因。     

鸡传染性支气管炎病毒SY毒株生物学特性及其S1基因分子遗传变异分析

通过生物学特性研究 ,验证了分离自沈阳地区的SY毒株确实为 1株鸡传染性支气管炎病毒。病毒中和试验表明 ,SY血清型不同于参考毒株T、H52 、M41及国内其他流行株如HD、XB、DB等 ;S1基因序列分析表明 ,SY核苷酸序列及推导的氨基酸序列与参考毒株Beau、M41、H12 0 、N1 62、Gray、6/ 82和Ark99等毒株的同源率都低于 80 % ,进化关系与各参考毒株也相距甚远 ,糖基化位点出现 3个新位点 ,氨基酸疏水性区域也存在差异。     

嗜肾型鸡传染性支气管炎W93株活疫苗的研究及其S1基因的克隆与序列测定

利用鸡胚分离法由发生肾病变型传染性支气管炎 (IB)的病鸡分离到嗜肾型传染性支气管炎病毒 (NIBV)W株 ;再通过SPF鸡胚连续传代 ,获得了NIBV疫苗毒株W93;继而借助RT PCR法扩增了其S1基因 ,并测定了S1基因的核苷酸序列 ,分析了与相关毒株间的同源性。结果显示 ,W93株在鸡胚中的病毒产量达 10 7.8EID50 /0 .1mL ,适用于所有日龄的雏鸡 ;W93S1基因的核苷酸序列与马萨诸塞型的M4 1株、H52 株和H12 0 株的同源性很高 ,分别为 96 .9%、96 .8%和 97.1%。表明 ,W93可作为制备IB弱毒疫苗的毒株     

广西区2008-2011年猪繁殖与呼吸综合征病毒Nsp2基因的遗传变异分析

为了解广西壮族自治区猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)流行毒株的遗传变异情况,对2008-2011年间来自广西各地的部分PRRSV阳性病料进行Nsp2基因的扩增和测序分析。结果显示,获得的49个毒株均为美洲型,其中46株具有高致病性变异毒株的序列特征,即其Nsp2蛋白缺失第481位和第533～561位aa,其余3株不具有上述缺失,属于PRRSV传统毒株。广西区49个毒株Nsp2基因间核苷酸序列的同源性介于84.8%～99.7%,与VR-2332、CH-1a、HB-1及JXA1株核苷酸序列的同源性分别为80.5%～83.7%、89.7%～92.6%、92.4%～96.3%、92.8%～99.3%,而与LV株核苷酸序列同源性仅为51.0%～53.9%。基于Nsp2基因核苷酸序列所绘制的遗传进化树,可将所有美洲型PRRSV毒株分为4个亚群,广西区的49个毒株有3株分布在以HB-1株为代表的Ⅲ亚群,46株分布在以JXA1株为代表的Ⅳ亚群。表明,当前广西区PRRSV流行毒株均为美洲型毒株,并且以Ⅳ亚群为优势基因亚群,各毒株间的Nsp2基因序列存在一定的差异,但没有明显的地域特征。     

芽胞杆菌的分离鉴定

为了确定实验室筛选的6株芽胞杆菌(Bacillus spp.)的种名,利用形态学、DNA促旋酶A亚单位基因(DNA Gyrase Subunit A,gyr A)和DNA促旋酶B亚单位基因(DNA Gyrase Subunit B,gyr B)序列的单基因系统发育分析和PCR相结合的方法进行鉴定。结果表明,6株芽胞杆菌的单菌落生长特征相似,革兰染色呈阳性,具有芽胞;以gyr A和gyr B基因构建的单基因系统发育树显示6株菌均与贝莱斯芽胞杆菌(Bacillus velezensis)归于同一分支,自展值(Bootstrap)较高;特异性PCR结果也证实它们均为贝莱斯芽胞杆菌阳性。结论,实验室分离的6株芽胞杆菌均属于贝莱斯芽胞杆菌,这为它们的深入研究奠定了基础。     

甘肃犬瘟热病毒流行株N蛋白和H蛋白基因的序列分析

采用RT-PCR方法扩增了3株犬瘟热病毒(CDV)分离株的N、H蛋白基因,将其克隆入pGEM-T Easy载体并进行序列分析。结果表明,获得的N蛋白基因序列与GenBank上登录的其他国家和地区的CDV分离株相应序列的同源性为92.5%～99.9%,获得的H蛋白基因与其他国家和地区的CDV分离株相应序列的同源性为81.7%～100%。由N蛋白基因和H蛋白基因推导的氨基酸序列构建的遗传进化树可知,这3株CDV流行株均处于野毒株的分支上,在N蛋白基因的遗传进化树上,CDV流行株呈现明显的地域性差异,而在H蛋白基因的遗传进化树上,不同国家和地区的CDV分离株之间虽有一定的地域联系,但与N蛋白基因相比,其地域性联系并不明显。说明这3株CDV流行株为野毒株,H蛋白基因的变异水平明显高于N蛋白基因,而N蛋白基因更能显示毒株与地域的关系。     

鸡传染性支气管炎病毒SC株S1基因的序列分析

用RT PCR扩增了鸡传染性支气管炎病毒 (IBV)SC株S1基因 ,连接到 pMD 18 T载体上 ,克隆后进行了核酸序列分析 ,证实SC株S1基因与基因库中收录的国外毒株H12 0和M 4 1的同源性较低 ,分别为 81.1%和 80 .0 % ,而与国内JX990 1株的同源性达到 91.3% ,初步证实国内存在IBV新毒株。