不同发育期大通牦牛组织线粒体COX基因的分析

采用绝对定量荧光PCR(Real-Time PCR),对妊娠4月、出生1日、1月、3月和6月龄不同发育期的青海大通牦牛组织中线粒体COX-Ⅰ及COX-Ⅱ的mRNA表达量进行分析。结果显示,不同发育期牦牛大脑、心肌、骨骼肌、肝组织线粒体COX-ⅡmRNA表达量均高于COX-ⅠmRNA表达量;COX-ⅡmRNA表达量与COX-Ⅰ相比较稳定。妊娠4月龄大脑组织线粒体COX-Ⅰ、ⅡmRNA表达量均显著高于其他年龄组(P0.05);1日龄心肌组织线粒体COX-Ⅰ、ⅡmRNA表达量均显著高于其他年龄组(P0.05);1月龄骨骼肌组织线粒体COX-Ⅰ、ⅡmRNA表达量均显著高于其他年龄组(P0.05);6月龄肝组织线粒体COX-ⅠmRNA表达量最高,差异显著(P0.05);而肝组织线粒体中COX-ⅡmRNA表达量在各个年龄段差异不显著(P0.05)。结果表明,大通牦牛生长发育阶段妊娠4月龄胎儿大脑组织、出生1日龄心肌组织及1月龄骨骼肌组织COX亚基mRNA转录水平均表现为上调表达,这与组织器官处于快速发育阶段及与其发挥重要的功能有直接关系。     

不同剂量小鹅瘟VP3基因疫苗在雏鹅体内的表达时相和分布规律

将小鹅瘟基因疫苗(pcDNA-GPV-VP3)分别以每只200、100和50μg肌肉注射免疫30日龄四川白鹅,以生理盐水和空载体质粒pcDNA3.1(+)为对照,于免疫接种后第12h、1d、3d、7d、21d、35d、63d和105d采集各组织器官,用免疫组织化学方法检测pcDNA-GPV-VP3在雏鹅各组织器官中的表达和分布.结果显示,各剂量免疫组第1d在免疫部位肌肉,第3d在心肌中均能检测到pcDNA-GPV-VP3的表达产物,第7d的表达量最大,表达可持续至第63d;第3d时各剂量免疫组均能在各肠段的肠腺、肠绒毛的杯状细胞和肌细胞中检测到pcDNA-GPV-VP3的表达产物,第7d的表达量最多,表达可持续至第35d;肝、肺、肾、脾、胰腺、脑、腔上囊、胸腺中未见表达;不同剂量的pcDNA-GPV-VP3免疫雏鹅后各组织器官中表达产物的量和持续时间的总体规律为200μg100μg50μg,但非等比例递增.研究证实,pcDNA-GPV-VP3免疫雏鹅后能在免疫部位肌肉、心肌、小肠肠腺和肠绒毛的杯状细胞、肌细胞内表达.     

高能低蛋白日粮对蛋鸡肝载脂蛋白A Ⅰ基因mRNA表达的影响

将60只300日龄的蛋鸡随机分成试验组和对照组,每组各30只,分别采用高能低蛋白日粮和正常日粮进行饲养试验,试验期为60 d,于试验的第1、30、60 d随机选取试验组和对照组鸡各6只,应用半定量RT-PCR方法检测了其肝组织中apo A Ⅰ mRNA的表达情况.结果显示,试验组第30 d和第60 d蛋鸡肝中apo A Ⅰ mRNA对β-actin mRNA的相对丰度均显著低于同日龄的对照组,特别是在试验第60 d差异达到显著水平(P<0.05).在试验组内比较也可以发现,随着试验期的延长,肝中apo A Ⅰ mRNA的表达量低于前一个试验点,且第60 d时较第30 d时差异显著(P<0.05).表明,高产蛋鸡饲喂高能低蛋白饲料一段时间后可导致蛋鸡肝apo A Ⅰ mRNA的表达量下降.     

牦牛MBL2基因mRNA及相关miRNAs在不同组织中的表达分析

甘露糖结合凝集素(mannose binding lectin,MBL)是一种钙离子依赖的糖结合蛋白,是天然免疫的重要组成部分。本研究旨在探究牦牛MBL2基因mRNA组织表达谱及可能靶定它的miRNAs组织表达谱。本研究首先应用RT-PCR技术分析牦牛MBL2基因mRNA在牦牛肝、脾、肺、肾、后腿骨骼肌、卵巢、小肠、颌下淋巴结、大肠、肠系膜淋巴结这10种组织里的表达谱,其次使用Targetscan和miRBase软件针对可能靶定MBL2基因的miRNAs进行预测,最后利用RT-PCR技术分析可能靶定MBL2基因的miRNAs在牦牛所检测10种组织中的表达谱。试验结果显示,MBL2基因mRNA在所检测的牦牛组织中仅在肝中表达,表达水平极显著高于脾、肺、肾、后腿骨骼肌、卵巢、小肠、颌下淋巴结、大肠、肠系膜淋巴结组织(P0.01);预测到可能靶定牦牛MBL2基因的miRNAs共有37个,从中选择了8个进行组织表达谱分析,发现bta-miR-143、 bta-miR-193a、 bta-miR-345-5p、 bta-miR-2385-3p、 bta-miR-2432、 bta-miR-2285p、 bta-miR-2284t-5p、bta-miR-126-5p在各组织中均有表达,与MBL2基因的mRNA在牦牛肝中共表达。综上所述,牦牛MBL2基因可能主要由肝表达,预测筛选的8个miRNAs可能在肝中通过靶定MBL2基因发挥调节作用,但它们之间是否存在真实的靶向关系及其靶向调节的生物学效应都有待于进一步深入研究。     

高铜诱导肉鸡肌胃和腺胃发生自噬与凋亡

为了探讨高铜对肉鸡肌胃和腺胃发生自噬与凋亡的影响,本试验选用240羽1日龄AA白羽肉鸡作为试验动物,并随机分为4组,分别饲喂含铜11 mg/kg(对照组)、110 mg/kg(高铜Ⅰ组)、220 mg/kg(高铜Ⅱ组)和330 mg/kg(高铜Ⅲ组)的日粮,并于49日龄采集肌胃和腺胃,制作组织切片观察组织学变化,采用实时荧光定量PCR检测自噬和凋亡相关基因的mRNA表达,免疫印迹检测LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和Caspase3的蛋白表达。结果显示,高铜可引起肌胃中肌纤维稀疏,腺胃中的腺细胞发生脱落以及空泡变性。另外,高铜可显著上调肌胃和腺胃中自噬相关基因Beclin1、Atg5、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ和凋亡相关基因Bax、Bak1、p53、Cyt C和Caspase3的表达,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和Caspase3的蛋白表达水平也显著升高,而mTOR和Bcl2的mRNA转录水平则显著下调。此外,腺胃和肌胃中p62的mRNA转录水平呈现先降低后升高的趋势。结果表明,高铜可诱导肉鸡的肌胃和腺胃发生自噬和凋亡。     

鹅细小病毒VP3基因疫苗两种不同免疫方式对细胞免疫的影响

将构建的鹅细小病毒(GPV)VP3基因疫苗(pcDNA-GPV-VP3)转染鹅胚成纤维细胞(GEF),每隔12 h检测VP3蛋白的表达情况,同时以不同剂量分别通过基因枪轰击和肌肉注射免疫28日龄健康雏鹅,于免疫后第3、7、14、21、28、35、49、63、77和105 d采血,进行淋巴细胞增殖试验(MTT法)。结果,转染后第24 h即可在GEF中检测到GPV VP3蛋白,第60 h表达量达到高峰。试验组鹅外周血T淋巴细胞D490 nm值在免疫后第35 d达到最大。肌肉注射组和基因枪组免疫后第14~63 d、第7~63 d的D490 nm值分别与PBS对照组差异极显著;肌肉注射组及基因枪组免疫后第21~49 d的D490 nm值显著高于弱毒疫苗对照组;肌肉注射组及基因枪组免疫后第14~63 d的D490 nm值极显著高于空质粒对照组。表明,基因枪轰击和肌肉注射pcDNA-GPV-VP3均能诱导雏鹅产生良好的细胞免疫应答。     

表达鹅细小病毒VP3基因的重组腺病毒的构建及其免疫原性分析

为构建表达鹅细小病毒(GPV)VP3基因的重组腺病毒,并检测其对雏鹅的免疫效果,将GPV VP3基因克隆至腺病毒表达系统穿梭质粒,构建了重组穿梭质粒pacAd-VP3;将经PacⅠ酶切线性化的重组穿梭质粒与骨架质粒共转染HEK293AD细胞,得到重组腺病毒rAd-VP3。采用RT-PCR、Western-blot和间接免疫荧光试验鉴定GPV VP3基因在真核细胞中的表达,用rAd-VP3免疫1月龄雏鹅,检测血清抗GPV蛋白抗体水平。结果显示,重组腺病毒rAd-VP3能感染HEK293AD和GEF细胞并表达GPV VP3蛋白,增殖至第6代重组病毒的效价可达108.23 TCID50/0.1mL;rAd-VP3能诱导雏鹅产生抗GPV特异抗体,免疫后第28天血清中抗GPV VP3蛋白抗体仍维持较高水平。结果表明,rAd-VP3具有良好的免疫原性,可作为一种安全有效的病毒活载体疫苗用于鹅细小病毒病的免疫预防。     

LHR在牦牛肾和卵巢中表达情况的研究

为了探讨牦牛肾中黄体生成素受体(LHR)的表达情况,分析肾中LHR与卵巢中LHR表达的相似性,选取青海省健康的3头2岁龄雌性牦牛,根据黄牛LHR基因序列5′端和3′端的保守性设计特异性引物,利用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测牦牛肾和卵巢组织中LHR基因的表达量,并运用免疫组织化学法对LHR蛋白在牦牛肾和卵巢组织中表达情况进行定位研究。RT-qPCR结果显示,牦牛肾组织中LHR mRNA的相对表达量是卵巢的79.75倍。免疫组织化学结果显示,LHR在牦牛肾组织的近曲小管和远曲小管呈阳性反应,在卵巢组织中卵泡颗粒层呈明显的阳性反应;LHR在牦牛肾和卵巢中的表达量之间差异极显著(P0.01)。结果表明,牦牛的肾组织与卵巢组织一样,均具有表达LHR的特性,提示肾可通过调节LHR参与牦牛的繁殖性能。     

鹅传染性囊病的诊疗

虎林市桦树村李某饲养５００只鹅暴发急性传染病，用抗生素、磺胺类药物治疗无效，经综合诊断为鹅传染性囊病。发病情况　该户从市家禽公司购进２日龄雏鹅５００只，１５日龄前在室内饲养，１５日龄后在村边小河放牧，放牧１周后开始逐渐发病，到３５日龄时全部发病，死亡２４８只。临诊症状　病初一些鹅采食减少，羽毛蓬乱，眼角有分泌物，精神萎顿，怕冷集堆，蹲缩不愿走动；排白色水样稀粪，并混有较多的尿酸盐，肛门周围被粪便污染；后期病鹅脱水、消瘦，体温下降衰竭死亡。病理变化　病鹅被毛蓬乱，皮肤干燥，肌肉脱水，胸肌和腿肌有多…     

胰岛素受体mRNA在新生犊牛组织中的表达

应用半定量RT-PCR方法检测了新生犊牛中枢神经系统和外周组织中胰岛素受体(in-sulin receptor,InsR)基因的表达。结果表明,InsR基因在肝、皮下脂肪、半腱肌、胰、肾皮质、脾、心、肺、下丘脑、肠系膜淋巴结、主动脉、十二指肠、结肠、垂体、大脑皮质、小脑皮质中都有表达。其中,肝、半腱肌、下丘脑、胰、主动脉、垂体中InsR基因的表达量显著多于其他组织(P<0.05)。InsR基因在各组织中的广泛分布表明胰岛素在体内具有广泛的生理功能。     

鸡肠相关性淋巴组织中IFN-γ和IL-2 mRNA表达的动态变化

通过实时荧光定量PCR方法,检测鸡在胚胎时期和出壳后初期肠道相关性淋巴组织(GALT)中IFN-γ基因和IL-2基因mRNA的表达水平,从而了解鸡GALT免疫功能的建立情况并反映鸡在此阶段的免疫状态。结果显示,胚胎20日龄和出壳后1日龄各肠段GALT中均有少量IL-2mRNA和IFN-γmRNA的表达。盲肠扁桃体、直肠和食管扁桃体中IL-2基因的表达水平在出壳后4日龄时显著升高(P<0.05),而在7日龄时又略有下降。除食管扁桃体外,各肠段GALT中IFN-γmRNA的表达水平在4日龄时显著升高(P<0.05),而空肠、回肠和直肠中其表达水平在7日龄时又显著下降(P<0.05)。各肠段在第2周内IL-2基因和IFN-γ基因表达水平迅速升高,并在14日龄时达到最高峰,之后各日龄都趋于稳定。另外,各日龄同一肠段IFN-γ基因的表达水平要明显高于IL-2基因的表达水平。证实,鸡GALT在出壳后4日龄就初步具有细胞免疫功能,直至第2周尤其是14日龄时其功能基本达到成熟水平。     

小鹅瘟病毒与大肠埃希氏菌混合感染的诊治

辽宁省庄河市青堆镇王某饲养本地雏鹅10 0 0只,饲养至2 2日龄时开始发病,每日死亡30～4 0只,1周内死亡2 6 0余只。临床症状　病鹅精神沉郁,缩颈离群,食欲废绝,鼻液增多,严重下痢,排黄白色混有气泡的稀便。个别病鹅出现神经症状,颈部扭转或后仰,全身抽搐或瘫痪,病程2～3d。剖检变化　全身肌肉暗红,胸腔和腹腔积有淡黄色液体;肺发生肝变;肝肿大,表面有灰白色坏死灶,胆囊肿大;肾肿大;肠黏膜肿胀、充血、出血,小肠内形成典型的香肠状凝固物。病原学检查病料采取与处理　无菌采取病、死雏鹅的肝、脾、肾等脏器,加生理盐水制成10 0 g/L的悬浮液,…     

氨肽酶N mRNA在雏鸡不同组织中的表达情况

为揭示鸡氨肽酶N(cAPN)含量差异与传染性支气管炎病毒(IBV)组织嗜性之间的关系,以看家基因鸡β-actin为内参基因,与cAPN目的基因在相同体系中扩增,以cAPN-pMD18-T标准质粒扩增曲线为标准,计算内参基因及目的基因各自的表达量,并将二者的比值作为相对定量依据,比较不同日龄雏鸡各组织cAPN含量的不同.结果显示,随着日龄增加,肝、脾、法氏囊、回肠、肾等组织中的cAPN表达量相对稳定,肺、腺胃、空肠等组织中的cAPN表达量呈现持续下降趋势,而十二指肠中的cAPN表达量持续上升,但盲肠、空肠中的cAPN表达量规律性不强且波动较大.表明cAPN的表达与IBV亲嗜组织存在着密切的相关性,同时也侧面反映了IBV组织嗜性的差异在一定程度上取决于机体不同组织器官cAPN的含量差异.     

应用PCR检测成年鸭体内鸭瘟强毒的分布

鸭瘟病毒 (DPV)强毒经人工接种和同居感染 10 0日龄鸭后 ,应用聚合酶链反应 (PCR)检测病毒在鸭体内各组织器官的动态分布。试验结果表明 ,DPV强毒经肌肉注射进入鸭体后 6h可在肝、脾、血液和粪便中检测到DPVDNA ;DPV强毒经肌肉注射到鸭体后各受检样品被检测到DPVDNA的先后顺序为 :肝、脾、血液和直肠粪便 (6h)→肺、脑和腿肌 (12h)→肾和胸肌 (2 4h) ;同居鸭于混群后 4 8h在肝、肺、血液和直肠粪便中检出DPVDNA ;DPV强毒经同居感染鸭后各受检样品检测到DPVDNA的先后顺序为 :肝、肺、血液和直肠粪便 (48h)→脾和脑 (72h)→胸肌和腿肌 (96h)→肾 (12 0h)。     

黄羽肉鸡胰蛋白酶原的原核表达及其在体内分布的研究

本试验对胰蛋白酶原(trypsinogen,TRY)进行原核表达并对其诱导条件、纯化条件进行优化,将纯化后的目的蛋白免疫新西兰白兔,制备兔抗TRY多克隆抗体。利用免疫组织化学法、PCR技术和荧光定量PCR技术分析TRY在不同日龄雌雄黄羽肉鸡体内的分布情况。结果显示,诱导表达重组蛋白的最佳诱导条件为37℃200 r/min,0.8 mmol/L IPTG,诱导时间为24 h;亲和层析法纯化蛋白以160 mmol/L的咪唑洗脱效果最好;TRY基因在黄羽肉鸡体内的组织分布具有广泛性,但雌雄黄羽肉鸡各组织的TRY表达量存在差异;TRY基因从1日龄即随着黄羽肉鸡的生长发育表达量也随之增加,在14日龄时,其表达量极显著提高;胰腺组织TRY基因具有性别差异性,在14、35和56日龄,雄性黄羽肉鸡的表达量高于雌性的表达量,差异显著(P0.05)。上述研究结果可为进一步研究肉鸡胰蛋白酶原结构与功能、肠道消化功能的早期发育过程提供参考。     

胰岛素样生长因子及其受体mRNAs在绵羊生殖系统中的表达和分布

为检测胰岛素样生长因子(IGFs)及其受体(IGFR)mRNAs在绵羊发情周期早期卵巢、子宫和输卵管中的表达,探讨绵羊胚胎早期发育过程中其发育环境——生殖道中生长因子的表达、分泌及其作用,取绵羊发情周期早期卵巢、子宫和输卵管,经固定、切片、免疫染色,观察IGFs mRNAs的表达和分布情况。同时用RT-PCR技术研究了各组织中IGF-Ⅰ、IGF-Ⅱ、IGF-ⅠR、IGF-ⅡR mRNAs的表达情况。结果表明,IGFs mRNAs在绵羊发情周期早期的卵巢、子宫和输卵管中都有表达,4种因子表达模式相似:在卵巢中,IGFs主要定位于卵泡颗粒细胞,间质细胞亦有少量表达。在输卵管中,上皮细胞免疫染色呈阳性;在子宫中,腺细胞及上皮细胞的阳性信号强于固有层。RT-PCR检测表明IGFs mRNAs在3种组织中均有表达。     

高铜诱导大鼠卵巢自噬发生

为探讨高铜对大鼠卵巢的影响,将24只20日龄大鼠随机分成4个不同浓度CuCl2饲料饲喂组:对照组(15 mg/kg)、高铜Ⅰ组(30 mg/kg)、高铜Ⅱ组(60 mg/kg)和高铜Ⅲ组(120 mg/kg),连续饲喂6个月。观察卵巢病理变化,检测血浆和卵巢铜含量、抗氧化指标(SOD活性、MDA含量、T-AOC水平)、自噬相关基因(LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Atg-5、Beclin-1)表达和自噬蛋白LC3-Ⅱ定位表达。结果显示,随着饲料铜含量增高,卵巢中铜含量呈升高趋势,高铜组大鼠卵巢出现卵泡闭锁和颗粒细胞扩散;卵巢组织中MDA含量、T-AOC水平和SOD活力均明显升高(P0.05);卵巢中自噬相关基因LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Atg-5和Beclin-1的表达显著上调(P0.05),自噬蛋白LC3-Ⅱ的组织分布也显著增加(P0.05)。结果表明,高铜可导致雌性大鼠卵巢发生氧化损伤和自噬,自噬增加可能是氧化损伤诱导的,而过多自噬则加重铜对卵巢的损伤。     

硒对慢性氟中毒鸡免疫组织中Cu-Zn-SOD活性及其mRNA表达的影响

为探讨硒对慢性氟中毒鸡免疫组织中Cu-Zn-SOD活性及其mRNA表达的影响,将8日龄海蓝褐雏鸡随机分为3组正常对照组,高氟组,硒拮抗组.分别于分组饲养后第30、60、90 d检测血清和免疫组织中MDA含量、Cu-Zn-SOD活性以及免疫组织中Cu-Zn-SOD mRNA的表达水平.结果,血清及免疫组织中硒拮抗组较高氟组MDA含量降低,试验中后期Cu-Zn-SOD活性较高氟组高,免疫组织中硒拮抗组Cu-Zn-SOD mRNA表达水平明显高于高氟组的水平.结果显示,氟可诱发鸡免疫组织氧化损伤,降低Cu-Zn-SOD活性及其mRNA表达水平;硒可提高Cu-Zn-SOD活性及其mRNA的表达水平,干预免疫细胞脂质过氧化反应,进而减轻氟所致的免疫损伤.     

胰岛素样生长因子Ⅰ和胰高血糖素样肽Ⅰ对体外培养的脂肪细胞HSL mRNA表达的影响

为阐明胰岛素样生长因子Ⅰ(IGF-Ⅰ)、胰高血糖素样肽Ⅰ(GLP-Ⅰ)在乳牛脂肪代谢过程中的调控作用,应用荧光定量PCR法检测IGF-Ⅰ、GLP-Ⅰ对体外培养的脂肪细胞激素敏感脂肪酶(HSL)mRNA丰度的影响。结果显示,随着IGF-Ⅰ、GLP-Ⅰ添加浓度的升高,脂肪细胞HSL mRNA表达逐渐下降。结果表明,IGF-Ⅰ、GLP-Ⅰ直接调控脂肪细胞HSL mRNA的表达。     

长期铜暴露诱导大鼠睾丸发生自噬的研究

铜暴露可损害雄性动物生殖系统。本试验将20只20日龄雄性大鼠随机分为4组,每组5只,分别饲喂含不同铜含量的饲料:对照组(15 mg/kg)、高铜Ⅰ组(30 mg/kg)、高铜Ⅱ组(60 mg/kg)和高铜Ⅲ组(120 mg/kg),连续饲喂6个月,采集大鼠睾丸组织,以探讨长期高铜暴露对大鼠睾丸的影响。进行HE染色以观察睾丸组织形态学变化,使用qRT-PCR检测睾丸自噬相关基因LC3Ⅰ、LC3Ⅱ、ATG5、Beclin1、p62的表达,使用Western-blot法检测睾丸自噬相关蛋白LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、ATG5、Beclin1的表达。试验结果显示,与对照组相比,大鼠体重、睾丸重量及睾丸系数无显著差异;随着饲料铜含量升高,睾丸组织损伤加剧;高铜组自噬相关基因LC3Ⅰ、LC3Ⅱ、Beclin1和p62的mRNA表达水平显著上调(P0.05),而ATG5 mRNA表达水平呈上调趋势,但无显著差异(P0.05),自噬相关蛋白LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、ATG5、Beclin1的表达水平显著上调(P0.05)。试验结果表明,长期高铜暴露可诱导雄性大鼠睾丸组织病理学损伤及自噬发生。