柔嫩艾美球虫裂殖子的分离纯化

采用标准分样筛过滤、离心洗涤、差速离心和DEAE 5 2纤维素柱层析法对球虫裂殖子进行了纯化 ,并对不同填充高度的DEAE 5 2纤维素层析柱的纯化效果进行了比较。结果表明 ,采用填充高度为 14cm的层析柱分离纯化效果较好 ,操作程序较简单 ,从 30只鸡的盲肠黏膜中纯化裂殖子 1.85× 10 7个 ,平均每只鸡获得裂殖子 6 .17× 10 5个 ,所获得的裂殖子杂质极少 ,其纯度适用于mRNA差异显示等分子生物学研究。     

巨型艾美球虫在免疫鸡体内发育的组织学观察

巨型艾美球虫（Ｅｉｍｅｒｉａｍａｘｉｍａ）在非免疫鸡体内有３代裂殖生殖，在其第１代和第２代裂殖生殖阶段，虫体寄生的空肠组织发生粘液变性；在裂殖生殖后期和配子生殖阶段，空肠绒毛组织变化明显，包括粘膜上皮细胞大量脱落，固有层淋巴细胞浸润等，有时出现大量上皮间淋巴细胞（ＩＥＬ）。试验鸡经巨型艾美球虫攻击后，在其子孢子侵入、移行阶段就受到抑制。随着时间推移，第１代、第２代和第３代裂殖生殖受到日益加重的抑制，最终使虫体没有进入到有性生殖阶段。对免疫鸡攻虫后第１ｄ可见空肠固有层淋巴细胞浸润、ＩＥＬ增多、肠腺上皮细胞增生等反应。研究结果表明，免疫反应的靶阶段虫体包括子孢子及裂殖生殖各阶段的虫体；空肠固有层淋巴细胞、ＩＥＬ可能参与了抗巨型艾美球虫感染的保护性免疫。     

地克珠利对柔嫩艾美耳球虫SAG4表达的影响

建立地克珠利抗柔嫩艾美耳球虫感染鸡动物模型,收集获得柔嫩艾美耳球虫第2代裂殖子,采用PCR扩增柔嫩艾美耳球虫第2代裂殖子SAG4基因不含N端信号肽的编码序列,构建p ET-28a-SAG4表达质粒,转化至BL21(DE3)感受态细胞,用IPTG诱导表达融合蛋白,镍亲和层析柱法纯化蛋白,通过免疫BALB/c小鼠制备SAG4抗血清。用Real-time PCR检测SAG4 m RNA的表达,用Western-blot和免疫荧光技术检测SAG4蛋白的表达情况。结果显示,p ET-28a-SAG4表达的重组蛋白为可溶性蛋白,地克珠利显著降低了柔嫩艾美耳球虫第2代裂殖子SAG4基因m RNA和蛋白的表达。这提示SAG4基因可能与地克珠利抗球虫作用相关,这将为地克珠利抗球虫作用机理的阐述提供理论依据。     

中药"球康"对柔嫩艾美球虫超微结构的影响

利用透射电镜对中药"球康"作用下柔嫩艾美球虫超微结构的变化进行了观察.结果发现,在"球康"作用下,球虫裂殖子形态结构发生明显变化,表现为哑铃形、畸形和不规则形状,裂殖子的顶体肿胀变圆;裂殖子外膜破损,外膜与细胞质分离,出现大的空腔.球虫微线消失,内部出现环状结构;线粒体内出现空泡和致密的电子团块;球虫死亡,完全失去超微结构,仅留下许多支链淀粉颗粒.推测中药"球康"抗球虫的作用机理可能是,通过破坏虫体结构的完整性,抑制虫体物质代谢及能量代谢等生理机能,从而杀死球虫或者抑制球虫的生长和繁殖.     

脆弱艾美耳球虫、波氏艾美耳球虫和堆型艾美耳球虫在培养细胞里的发育

在培养细胞里培养了鸡艾美耳球虫、波氏艾美耳球虫和堆型艾美耳球虫,观察了它们的生长形态和培养条件。已获得的结果摘要如下。 (一)脆弱艾美耳球虫在用孢子体接种的细胞培养中发育成卵囊,波氏艾美耳球虫发育到成熟的第二代裂殖体。没有发现处于生长期的堆型艾美耳球虫。 (二)在培养脆弱艾美耳球虫第二世代裂殖体时,只有少数裂殖子侵入培养细胞,不过没观察到进一步的发育。 (三)裂殖体区分为三种形态学类型。第一种类型的裂殖体跟在活体里发现的形态一样。第二种类型裂殖体的细胞质分裂成大小不一的团块。每一团块包含一个或较多的细胞核。第三种类型裂殖体同细胞里的孢子体相似,尽管它们在量度上比后者明显大些。它们有一个折光体,一个大细胞核和丰满的细胞质。 (四)在裂殖子形成过程中看到三种不同的方法。裂殖子是由第一种类型的裂殖体,第二种类型裂殖体的球形体和第三种类型裂殖体的球状物的表面分裂而形成的。 (五)在试管里培养脆弱艾美耳球虫的最适条件在于应用鸡肾细胞和含有0.2％酵母浸出物的No.199培养基,并置40℃培养。当应用鸡胚成纤维细胞和把培养物保存在Eagle's最小必需量培养基里并在40℃孵育波氏艾美耳球虫时取得了满意的结果。     

地克珠利对柔嫩艾美耳球虫丝氨酸/苏氨酸磷酸酶5表达的影响

建立地克珠利抗柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)感染鸡动物模型,收集获得E. tenella第2代裂殖子,通过PCR扩增E. tenella第2代裂殖子丝氨酸/苏氨酸磷酸酶5(serine/threonine protein phosphatase type 5,Et PP5)基因编码序列,构建pET-28a-Et PP5表达质粒,转化至BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达融合蛋白,镍亲和层析柱法纯化表达蛋白并免疫BABL/c小鼠制备Et PP5抗血清。采用免疫荧光和Western-blot技术检测第2代裂殖子Et PP5蛋白的表达。结果显示,30℃时,用1 mmol/L的IPTG诱导pET-28a-Et PP5表达的融合蛋白大多以包涵体形式存在。Et PP5主要分布在E. tenella第2代裂殖子的细胞质中,细胞核也有少量分布。经地克珠利处理后,E. tenella第2代裂殖子Et PP5蛋白表达降低了47.65%(P0.01)。提示,地克珠利可能通过作用Et PP5发挥抗球虫作用,这为地克珠利抗球虫作用机理的阐述提供了理论依据。     

鸡毒害艾美耳球虫小热休克蛋白基因EnsHsp20的克隆表达与蛋白定位

克隆、表达毒害艾美耳球虫小热休克蛋白基因EnsHsp20,检测其天然蛋白及其在虫体内的亚细胞定位。以毒害艾美耳球虫子孢子的总RNA为模板,用RT-PCR扩增EnsHsp20基因后,连接至pGEM-T Easy载体;测序后构建pET28a(+)-EnsHsp20表达载体,转化至大肠杆菌BL21(DE3);经双酶切和测序鉴定后,将重组菌诱导表达;表达产物经Western-blot鉴定、纯化与复性后,免疫BALB/c小鼠,制备小鼠抗rEnsHsp20多克隆抗体;利用多克隆抗体,分别用Western-blot和间接免疫荧光试验检测子孢子和第2代裂殖子中EnsHsp20的天然蛋白及其定位;最后,应用qRT-PCR分析EnsHsp20基因在未孢子化卵囊、子孢子和第2代裂殖子中的转录水平。结果显示,该基因全长549 bp,编码183个氨基酸,预测分子质量为20.3 ku;重组蛋白主要以包涵体形式存在,可以被6×His标签单抗和鸡抗毒害艾美耳球虫、抗柔嫩艾美耳球虫、抗堆型艾美耳球虫和抗巨型艾美耳球虫的阳性血清识别;在第2代裂殖子中检测到EnsHsp20的天然蛋白,分子质量约为36 ku;EnsHsp2...     

柔嫩艾美耳球虫穿孔素样蛋白基因的原核表达与亚细胞定位

为了研究柔嫩艾美耳球虫(E. tenella)穿孔素样蛋白(Et PLP)在球虫感染中与宿主相互作用关系,首次成功获得EtPLP1(1 932 bp)和EtPLP2(4 215 bp)2个目的基因。通过表达纯化得到2个大小分别为37和67ku的目的蛋白,Western-blot结果显示其反应原性良好。通过免疫荧光技术,观察到EtPLP1定位在子孢子顶端。m RNA转录水平检测结果显示,EtPLP1在子孢子阶段的表达量最高,其次是第1代裂殖子阶段,EtPLP2m RNA水平在第1代裂殖子阶段表达量最高,其次是第2代裂殖子阶段;它们在其他阶段表达量极低或不表达。结果表明EtPLP1和EtPLP2可能参与虫体入侵与逸出宿主细胞,为EtPLPs蛋白功能研究奠定了基础。     

鹅多斑艾美球虫生活史及致病性的研究

给10只10日龄雏鹅分别经口接种2.0×105~6.5×105个多斑艾美球虫(Eimeria stig-mosa)孢子化卵囊,在接种后48~180 h分期剖杀,对多斑艾美球虫的生活史和致病性进行了动态观察。结果,在内生性发育过程中,多斑艾美球虫可能仅有1个世代的裂殖生殖阶段,每个裂殖体含3~5个裂殖子。在感染后第108 h左右,多斑艾美球虫完成裂殖生殖并进入配子生殖阶段。所有内生殖阶段均在肠上皮细胞核内发育。潜隐期为4.5 d,显露期为4 d。25℃下卵囊孢子化时间为36~48 h。多斑艾美球虫主要寄生于空肠、回肠、盲肠和直肠绒毛中部到顶部的上皮细胞中,引起轻微病变。感染鹅仅出现轻度拉稀,未发生死亡。结果表明,多斑艾美球虫对家鹅致病性较小。     

杀球灵与拉沙洛菌素的交叉抗药性试验

杀球灵与拉沙洛菌素的交叉抗药性试验甘德培汪明（中国农业大学动物医学院北京１０００９４）为了研究拉沙洛菌素和杀球灵间是否存在交叉抗药性，作者进行了本试验。１材料与方法１．１虫株柔嫩艾美球虫敏感株由本院寄生虫学教研组保存；柔嫩艾美球虫抗性株，对质量分数为...     

鸡球虫疫苗免疫及保护效果

鸡球虫疫苗免疫及保护效果马衍忠，舒桂良，王海生（天津农学院３００３８１）１９９５年５月１０日至６月１５日作者进行了鸡球虫Ｂ－２型疫苗免疫及保护效果试验，取得了满意效果。１材料与方法１．１试验鸡１日龄健康伊沙褐公雏１００只，由天津祖代鸡场提供。１．２鸡...     

堆型艾美耳球虫的分离纯化和致病性试验

堆型艾美耳球虫的分离纯化和致病性试验黄兵，史天卫，赵其平，吴薛忠，陈兆国（中国农业科学院上海家畜寄生虫病研究所２００２３２）堆型艾美耳球虫（Ｅｉｍｅｒｉａａｃｅｒｖｕｌｉｎａ）是９种鸡球虫中致病力中等的一个种，用不同品种的鸡进行人工感染，其死亡率变化...     

羊泰勒虫中国株裂殖子的蛋白分析

采用SDSPAGE和Westernblotting试验对羊泰勒虫临潭株、隆德株、张家川株和夏河株裂殖子蛋白进行了分析。SDSPAGE结果显示,羊泰勒虫临潭株与隆德株的亲缘关系较近;张家川株与夏河株的亲缘关系也比较近。4个虫株的阳性血清分别与4个株裂殖子蛋白的Westernblotting试验结果表明,4个株虫体的阳性血清与临潭株和张家川株的裂殖子蛋白在38ku处有共同反应。提示38ku蛋白多肽有望成为特异性诊断抗原,为重组疫苗的研究提供依据。     

柔嫩艾美球虫抗药株第二代裂殖子的双向电泳图谱比较

对实验室诱导的柔嫩艾美球虫马杜拉霉素、地克珠利抗药株及其同母源敏感株第二代裂殖子的蛋白质进行双向电泳 ,构建了稳定的双向电泳图谱。经Imagemaster 2DElite软件分析 ,敏感株和抗药株平均可分离 90 0个点 ;以敏感株平均胶作为参考胶 ,抗药株平均胶与之比较 ,得到差异蛋白质斑点 ,其中地克珠利抗药株和马杜拉霉素抗药株各有 4个表达差异点。这些差异表达的蛋白质可能参与了球虫抗药性产生的过程。     

柔嫩艾美球虫pEtK2抗原基因的克隆表达及其表达产物的抗原性分析

应用RT-PCR技术从纯化的柔嫩艾美球虫孢子化卵囊子孢子中克隆了pEtK2抗原基因,并进行了原核表达和抗原性分析,同时用MTT法检测了重组蛋白对球虫耐过鸡淋巴细胞的刺激效果。结果显示,克隆的pEtK2基因全长1464 bp,具有一个完整的开放阅读框,编码487个氨基酸,具有多个T细胞表位。重组蛋白诱导5 h后表达量最多,分子质量约55 ku,占菌体总蛋白的32%。纯化的重组蛋白能够刺激球虫耐过鸡T淋巴细胞增殖,可作为球虫基因工程疫苗或DNA疫苗的候选基因。     

急性犬瘟热伴发寄生性肠炎的病理形态学观察

为从病理学方面调查急性犬瘟热与寄生性肠炎的关系,通过免疫组织化学、苏木精伊红和过碘酸雪夫氏染色等方法,对12例急性犬瘟热伴发腹泻的病例进行了病理组织学研究。结果表明,6例腹泻主要是由球虫引起的,2例由隐孢子虫所致。犬球虫主要存在于病犬的空肠和回肠黏膜的上皮细胞内,在脱落的肠上皮细胞和被破坏的肠绒毛所形成的黏液内,也能检出大量的球虫。最常见的球虫形态为滋养体和裂殖体,滋养体多位于上皮细胞内或细胞间,断面呈不整圆形,核位于中央,被苏木精深染,原生质淡染呈细网状,质膜明显;裂殖体多呈不整圆形,内有香蕉状的裂殖子,位于变性的肠上皮细胞内,含有较多的糖原颗粒,用过碘酸雪夫氏染色时呈红色。隐孢子虫主要位于肠上皮细胞和肠腺上皮细胞的纹状缘,引起微绒毛破坏和细胞脱落。用抗犬瘟热病毒核衣壳蛋白单抗染色检查,小肠黏膜上皮细胞、隐窝的腺上皮细胞、浸润在肠黏膜固有层的淋巴细胞、巨噬细胞和集合淋巴结的树突状细胞均呈强阳性反应。据此认为急性犬瘟热的寄生性腹泻是在犬瘟热病毒引起肠黏膜抵抗力降低的基础上发生的。     

帝克珠利的急性毒性及抗球虫作用峰期试验

帝克珠利的急性毒性及抗球虫作用峰期试验＠姜中其＠方兰勇＠曾卫东＠徐建刚￥浙江农业大学动物科学学院帝克珠利的急性毒性及抗球虫作用峰期试验姜中其方兰勇１）曾卫东徐建刚２）（浙江农业大学动物科学学院杭州３１００２９）Ｄｉｃｌａｚｕｒｉｌ是近年来比利时杨森制药有限...     

牛源环形泰勒虫吐鲁番流行株Ta-t的体内扩繁试验

以被去除脾的昆明小白鼠为实验动物(40只),接种牛源环形泰勒虫吐鲁番流行株Ta-t,进行小鼠体内扩繁试验,并于接种后第8、12、24、48小时以及第3~10天每天经血液涂片检查接种后昆明小白鼠的红细胞染虫率,观察分析其扩繁情况;经昆明小白鼠心脏、眼球采血的方法收集其最高染虫率(15%以上)的血液内裂殖子,并进行冻存,摸索其保存、复苏条件等。结果显示,除脾术后昆明小白鼠均存活,检测其呼吸、脉搏、食欲、精神状态皆良好,说明摘脾手术成功;接种后第48小时可在昆明小白鼠血液里观察到裂殖子,第5~9天每组昆明小白鼠的平均染虫率可达15%~20%(最高峰),第10天后染虫率开始下降,血液涂片中裂殖子数量渐渐减少;经试验发现,在雌雄性昆明小白鼠体内的染虫率差异极显著(P=0.0070.01),去脾昆明小白鼠与未去脾昆明小白鼠的染虫率差异也极显著(P=0.000 20.01),牛源环形泰勒虫在除脾的昆明小白鼠血液内能被置换、增殖。染虫率为15%以上时昆明小白鼠血液里的裂殖子可用冷冻(-80℃)保存,亦可制作玻片裂殖子抗原备用,保存半年以内的裂殖子复苏活性最佳。该试验数据可为建立环形泰勒虫动物模型、教学、科研提供丰富的血液原虫株资源。     

鸡球虫子孢子体外脱囊试验

脆弱艾美尔球虫(E.tenella)卵囊经机械研磨破碎后,将游离出来的孢子囊在试管内用胰酶和胆汁消化,可使子孢子胞囊逸出。 本试验除要寻求胰酶和鸡胆汁的适宜浓度外,鉴于鸡胆汁产量小,不易大量获取。因此用牛羊胆汁代替鸡胆汁加胰酶对球虫孢子囊作了消化试验。 (一)材料与方法     

广东山东和福建三省鸡卡氏住白细胞虫病流行病学调查

通过免疫琼脂扩散试验和血液涂片检查，对广东、山东和福建省的２３个鸡场进行了鸡卡氏住白细胞虫病调查。在抽样检查的４２５只鸡中，３１只鸡血液涂片查出该虫体裂殖子或配子体，２９只鸡血清抗体阳性，总检出率为１４．１％，广东、山东、福建省检出率分别为１０．３％，１２．６％和２４．５％。血液涂片检查结果，青年鸡的检出率（１０．７％）明显高于成年鸡（３．８％）；免疫琼脂扩散试验检测时，成年鸡的阳性率（１０．９％）则显著高于青年鸡（２．８％）。因此，进行鸡卡氏住白细胞虫病调查时，宜采用寄生虫学和血清学相结合的方法。