貂源肺炎克雷伯氏菌的分离及毒力和耐药性的分析

为探讨采自山东省部分地区的10株貂源肺炎克雷伯氏菌(Kp)的毒力和耐药性,本研究从疑似肺炎发病水貂的肺中分离出10株革兰阴性菌,经PCR及Vitek全自动细菌鉴定仪鉴定为肺炎克雷伯氏菌。对10株肺炎克雷伯氏菌进行人工感染及毒力试验、药敏试验、耐药基因检测及接合转移试验。结果显示,10株肺炎克雷伯氏菌攻毒后小鼠全部死亡,肺、肝、脾和肾均有不同程度的出血。分离株中大部分肺炎克雷伯氏菌对临床常用药物表现出多重耐药,其中对氨基糖苷类、青霉素类、三代头孢菌素类、喹诺酮类及磺胺类抗生素的耐药性较高,但对阿莫西林/克拉维酸、亚胺培南及多黏菌素等抗生素敏感。耐药基因TEM、SHV和CTX-M的检出率分别为100%、70%和80%,以TEM基因检出率最高。     

肺炎克雷伯菌TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立

为建立肺炎克雷伯菌TaqMan荧光定量PCR检测方法,根据肺炎克雷伯菌16SrRNA基因的保守序列设计特异性引物和TaqMan探针,通过反应条件优化和特异性、敏感性、重复性试验以及临床样品的检测,建立了肺炎克雷伯菌TaqMan荧光定量PCR。结果显示,该方法与猪肺炎支原体、猪鼻支原体、臭鼻克雷伯菌、鼻硬结克雷伯菌、多杀性巴氏杆菌、链球菌、葡萄球菌、大肠杆菌、沙门菌、肠球菌、乳杆菌、解淀粉芽胞杆菌、猪丹毒杆菌、奇异变形杆菌和化脓隐秘杆菌共15种细菌无交叉反应;标准品浓度在2.29×109~2.29×104 copies/μL范围内具有良好的线性关系,最低可检测到2.29×102 copies/μL的标准品阳性质粒;批内和批间变异系数均小于3%。临床样品的检测结果表明,该方法具有敏感性高、特异性好、稳定性强和检测快速的优点,可用于肺炎克雷伯菌感染的早期诊断、样品的快速检测以及肺炎克雷伯菌的定量分析。     

211菌对猪致病性大肠埃希氏菌的体外抑制作用

将产乳酸、能生成芽胞的211菌对猪的9株致病性大肠埃希氏菌进行抑制试验.结果表明,培养24～72 h,211菌对9株大肠埃希氏菌均能产生抑制作用,抑菌长度0～3.25 cm;最佳抑菌时间为24～48 h;72 h后抑菌区有不同程度的所缩小,O141和O9菌株抑菌区消失.     

牛源肺炎克雷伯氏菌的分离鉴定及遗传进化分析

为了对兰州市榆中县某奶牛场犊牛疑似肺炎克雷伯氏菌感染病例进行确诊,本研究采集病死犊牛的脏器组织并从中分离到1株革兰阴性短杆菌,进而对分离菌进行了生化鉴定、16S r RN A鉴定及khe基因鉴定,在此基础上,完成了分离菌的致病性试验、耐药性分析及主要毒力基因的遗传进化分析。结果显示,除H2S试验外,分离菌生化特性均符合肺炎克雷伯氏菌的生化反应特性,其16S r RNA及khe基因序列与G enB ank中肺炎克雷伯氏菌株之间的同源性均高达99%,因此,可将分离菌确定为肺炎克雷伯氏菌,并将其命名为YZ2015。动物试验及耐药性试验结果表明,分离菌具有较强的致病性和多重耐药性。遗传进化分析表明,分离菌的fim H、mrk D及wab G基因与肺炎克雷伯氏菌其他菌株具有很高的同源性,其核酸序列相似性高达95%以上。     

家兔源性大肠杆菌和肺炎克雷伯氏菌的分离鉴定及药敏试验

兔大肠杆菌和克雷伯氏菌都可引起仔兔腹泻、死亡等疾病,二者混合感染后对仔兔危害极大。为了确定引起仔兔腹泻、死亡的病原,本研究对河南省某兔场断奶前后病死仔兔进行剖检。通过采集腹泻、死亡仔兔肝脏、肺脏、脾脏、盲肠、肠系膜进行病原菌分离培养、形态观察、PCR鉴定,最终鉴定该病死仔兔为大肠杆菌与肺炎克雷伯氏菌混合感染。经药敏实验发现,分离得到的大肠杆菌和肺炎克雷伯氏菌同时对庆大霉素、头孢氨苄、头孢唑啉、头孢哌酮、头孢拉定等五种药物敏感,对其他药物有不同程度的耐药性。上述研究结果为兔大肠杆菌和肺炎克雷伯氏菌混合感染的分离鉴定以及科学指导用药提供了参考。     

牛羊猪“猝死症”防治技术研究——病原诊断

经过１９９５～１９９６年两年的调查研究，现已明确了本病的主要病原：除山东省外，河南、江苏、吉林、四川、青海、甘肃等省均从病死家畜的病料中分离出了魏氏梭菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｗｅｌｃｈｉｉ）；山东省从病死山羊的病料中很规律地分离出肺炎克雷伯氏菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌａｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）和凝结芽胞杆菌（Ｂａｃｉｌａｃｏａｇｕｌａｎｓ）；青海、海南、四川等省除分离到魏氏梭菌外，还从部分“猝死症”死亡牦牛、水牛和黄牛病料中分离出溶血梭菌（Ｃｌ．ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｍ）；江苏、四川、河南和甘肃等省还从病死家畜病料中分离到腐败梭菌（Ｃｌ．ｓｅｐｔｉｃｕｍ）。病原调查结果为这类病的预防免疫提供了依据     

亚成体大熊猫细菌性败血病病因及病性研究

对１只死亡的亚成体大熊猫的临床剖检、病理组织学观察及微生物学检验，表明该大熊猫是因大肠埃希氏菌和肺炎克雷伯氏杆菌混合感染致死。２种菌对小白鼠的半数致死量分别为２．７６×１０８和４．０５×１０８个菌。其中大肠埃希氏菌的免疫原性较低。死亡大熊猫甲状腺功能低下。     

实验动物毛发状芽胞杆菌病

1917年,日本Waltzing小鼠爆发了一次致命的腹泻,在病鼠脏器坏死组织边缘的活细胞中发现革兰氏阴性芽胞杆菌,Tyzzer命名该菌为毛发状芽胞杆菌(Bacillus Piliformis),文献上也称为Tyzzer氏菌,并确定其病原。由此菌引起的实验动物感染,称为Tyzzer氏病。综述作者1972年夏季在医用同位素和防腐剂急性毒性试验时,在我国昆明种小鼠中先后二次发现本病的发生,由病理学检查证实,并于1976年作了报告,称为毛发状芽胞杆菌病(参见黄念君等:药品与生物制品,2:139～143,1976)。 毛发状芽胞杆菌是实验动物的一种急性致死性流行性腹泻疾病,全球性分布,在小鼠中比较常见,传播广泛,常常干扰实验工作的进行,影响实验结果,如肿瘤移植、化学物质致癌试验、甲状腺切除的免疫     

鼠伤寒沙门氏菌和福氏志贺氏菌流行株耐药质粒的研究

对分离到的９株鼠伤寒沙门氏菌和５株福氏志贺氏菌进行药敏试验、质粒提取和电泳分析，各菌株均分离出２～４条质粒带。将含有３．２７×１０４，３．０１×１０４和６．０１×１０４ｂｐ的质粒转化给大肠埃希氏菌ＨＢ１０１，使ＨＢ１０１获得了相应菌株的部分耐药性，用转化有３．２７×１０４ｂｐ的ＨＢ１０１注射小白鼠，１５ｄ后用相应的原始鼠伤寒沙门氏菌强毒株攻击，结果使小白鼠获得了保护；用含有３．２７×１０４ｂｐ质粒的ＨＢ１０１灌服免疫豚鼠，１５ｄ后用相应的强毒鼠伤寒沙门氏菌攻击，结果免疫豚鼠获得保护，对照鼠死亡。说明３．２７×１０４ｂｐ的质粒中携带有原始鼠伤寒菌的保护性抗原基因。菌株间质粒电泳图谱和转化菌株的耐药试验表明，菌株的不同耐药性基因由不同分子质量的质粒所携带，不同菌株中携带质粒的数量和大小不同，在临床上表现为菌株间的耐药性不同。     

山羊血琼脂和血清琼脂培养细菌的效果试验

在兽医微生物检验用血液琼脂或血清琼脂培养基的制备中，多采用牛、马、绵羊或兔血。笔者曾用山羊血或血清琼脂培养基培养巴氏杆菌，取得了满意的培养效果。为了判定山羊血在培养基中的应用价值，又以大肠埃希氏菌、多杀性巴氏杆菌和葡萄球菌为试验菌，进行了试验。１　试验材料１．１　试验菌　大肠埃希氏菌、多杀性巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌，均由山东农业大学动物科技学院中心实验室提供。１．２　营养琼脂　上海试剂厂生产，批号９６０７０２；新鲜猪胃和鲜牛肉由茌平县肉联厂提供。１．３　羊血　选健康山羊和绵羊，无菌操作自颈静脉采…     

免疫乳与血中抗轮状病毒和大肠埃希氏菌抗体的比较研究

以引起婴儿腹泻的轮状病毒和大肠埃希氏菌为免疫原给妊娠后期乳牛免疫,定期采乳和血,分别用试管凝集反应和反向间接血凝抑制试验检测抗大肠埃希氏菌和轮状病毒抗体,比较血和乳中抗体相互关系.结果表明,乳牛在免疫前只能在初乳中检出抗体;免疫后在初乳和近2个月常乳中均能检测到抗体,两者呈平行关系,仅乳中抗体效价比血中抗体效价低2个滴度.     

微生态制剂—XA1503菌粉的研制和应用

从5株不同的蜡状芽胞杆菌中筛选出XA1503菌株,并与市售“止痢灵”菌种DM423蜡状芽胞杆菌进行了毒性和安全性试验的比较,证明XA1503菌株是一株十分安全无害的菌。用XA1503菌株制成的菌粉,经实验室和临床试验结果表明,它是一种有效的微生态制剂,用于畜禽肠道疾病的预防和治疗,特别是仔猪、犊牛、羔羊、仔犬的腹泻、鸡白痢有明显效果。     

银黑狐空肠弯曲菌和致病性大肠埃希氏菌带菌状况的研究

对２２６只银黑狐粪便拭子进行空肠弯曲菌检查，共检出带菌狐１４只，其中成年公狐（４０只）、成年母狐（１２１只）、母仔狐（４０只）和公仔狐（２５只）分别检出３，８，２和１只，检出率依次为７．５％，６．６％，５．０％和４．０％，平均检出率为６．２％。对１８９只银黑狐粪便进行致病性大肠埃希氏菌检查，检出带菌狐３１只，其中成年公狐（１３只）、成年母狐（１２２只）、母仔狐（５１只）和公仔狐（３只），分别检出４，１８，８和１只，检出率依次为３０．８％，１４．８％，１５．７％和３３．３％，平均检出率为１６．４％；共检出致病性大肠埃希氏菌３４株，代表１５个血清型。对６９只银黑狐粪便检查，未检出Ａ～Ｆ群沙门氏菌及Ａ群Ⅰ、Ａ群Ⅱ、Ｂ群和Ｄ群的志贺氏菌。对一起３日龄仔狐死亡原因调查，证实是由肠道致病性大肠埃希氏菌Ｏ１１４Ｋ９０所致。     

蛋鸡克雷伯氏菌的分离鉴定及其疫苗制备

通过对临床采集的蛋鸡病料进行镜检、细菌分离培养、生化特性和致病性分析 ,分离出了克雷伯氏菌 ;同时制备了氢氧化铝灭活疫苗 ,并对疫苗的安全性、保护性及免疫性进行了检测。结果表明 ,利用当地发病鸡群分离的克雷伯氏菌制备的灭活疫苗性能良好、使用安全可靠。     

耶氏菌的增菌与保菌方法研究

将耶氏菌（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）接种于改良ＰＢＳ、普通蛋白胨水和生理盐水中，置４℃冰箱内定期观察。结果耶氏菌在这三种培养基中既能增菌又能长期保菌，无论纯菌还是现场猪粪标本中的耶氏菌均能在改良ＰＢＳ中存活５年以上，且菌株不发生变异。证明ＰＢＳ是一种增菌与保菌的理想培养基。     

貂源铜绿假单孢菌的分离鉴定及其致病性研究

为确定山东威海某养殖场发病水貂的病原菌,从发病水貂肺中分离并纯化细菌,根据其形态特征、培养特性、生化试验结果及PCR鉴定,确定其为铜绿假单孢菌。致病性试验中,将8.0×1010CFU/mL的菌液10倍系列稀释后,感染60日龄健康昆明系小鼠,半数致死量和最小致死量分别为1.4×107 CFU/mL和8.0×106 CFU/mL。剖检死亡小鼠可见皮下和肺出血,并能从死亡小鼠的肺中分离出与感染菌株形态特征完全一致的菌落。药敏试验结果显示,该分离菌株对庆大霉素、环丙沙星、诺氟沙星、头孢哌酮等较为敏感,而对青霉素、链霉素不敏感。系统发育分析结果表明,该分离菌株与从小麦中分离的铜绿假单孢菌的亲缘关系最近,据此怀疑该发病水貂有可能是食用了污染的饲料引起的。     

大熊猫嗜水气单胞菌和克雷白氏菌的分离鉴定

从腹泻的大熊猫粪便中分离到 2株细菌 ,用BiologMicroStation细菌自动生化鉴定工作系统鉴定为嗜水气单胞菌 (Aeromonashydrophila)DNA 1群和肺炎克雷白氏菌肺炎亚种 (KlebsiellapneumoniaeSSpneumoniae)。试验表明 ,2菌对小白鼠有极强的致病性 ,对菌必治和百菌除敏感。     

猪源肺炎克雷伯菌的分离鉴定及其耐药性分析

通过菌落形态观察、生化试验及16S rDNA基因序列测定对分离菌株进行鉴定,共获得7株猪源肺炎克雷伯菌,将其命名为Kp1~Kp7。致病性试验结果表明,7株分离菌株对小鼠均具有较强的致病性。药敏试验结果显示,分离菌株的耐药表型差异性较大,对强力霉素、大观霉素及阿米卡星的耐药性较强。对分离菌株整合子的检测表明,仅能从Kp1检测到消毒剂-磺胺基因(qac EΔ1-sul1)、整合酶基因(IntⅠ)以及基因盒。本研究为肺炎克雷伯菌引起的疾病选择合理的抗菌药物提供了一定的科学依据,并为进一步研究其耐药机制奠定了基础。     

铜绿假单胞菌flgE和oprL基因联合DNA疫苗的免疫效果

为测试铜绿假单胞菌flgE和oprL基因的联合DNA疫苗在小鼠体内的免疫效果,本试验分别构建铜绿假单胞菌flgE和oprL基因的DNA疫苗pflgE和pOPRL,并制备了联合DNA疫苗pflgE+pOPRL,同时设灭活疫苗作为阳性对照,pcDNA3.1(+)空载体和PBS分别作为阴性对照,免疫BALB/c小鼠,间接ELISA检测免疫后小鼠血清特异性抗体水平,MTT法检测免疫小鼠脾淋巴细胞增殖情况(SI值),双抗夹心ELISA测定脾淋巴细胞分泌的IFN-γ和IL-2的水平,通过攻毒试验并计算各疫苗的保护率。间接ELISA结果显示,以铜绿假单胞菌裂解液为包被抗原检测pflgE+pOPRL组小鼠的抗体水平显著高于pflgE组和pOPRL组(P0.05),但以菌毛蛋白和外膜蛋白为包被抗原时pflgE+pOPRL组小鼠的抗体水平则分别低于pflgE组(P0.05)和pOPRL组(P0.05)。pflgE+pOPRL组的SI值及IFN-γ和IL-2的分泌水平与灭活疫苗组相当,且显著高于两种单价DNA疫苗组(P0.05)。攻毒试验结果显示,各疫苗均可为小鼠提供一定的保护力,其中灭活疫苗保护率最高(83.3%),联合DNA疫苗的保护率为72.2%,pflgE和pOPRL疫苗则较低,分别为55.6%和50%。结论,以铜绿假单胞菌flgE和oprL基因构建的DNA疫苗,尤其是二价组合DNA疫苗,具有一定的应用前景。     

黑叶猴源肺炎克雷伯菌的分离鉴定及药敏试验

从急性死亡的黑叶猴(Trachypithecus francoisi)肺中分离到1株革兰阴性杆菌,并对分离菌株进行形态学、培养特性和生化特性的鉴定,结果符合肺炎克雷伯菌的特征。根据GenBank上的肺炎克雷伯菌的16S rRNA序列设计引物,对分离菌株进行16S rRNA扩增,获得片段大小约为1 433 bp的特异性片段,将扩增片段进行序列测定后登录NCBI进行Blast分析。结果显示,与登录号为GU128173的肺炎克雷伯菌AUH-BG208株核苷酸序列相似性最高,为99%。同时对分离株进行药敏试验,结果显示,该分离菌株对头孢类、氨基甙类、喹诺酮类等抗生素高度敏感,而对四环素、林可霉素等抗生素产生耐药性。