蓝舌病病毒灭活抗原的研究

蓝舌病是危害养羊业最严重的一种世界性传染病。其病原为蓝舌病病毒,属于呼肠弧病毒科环状病毒属。截止目前该病毒发现22个血清型。这种多型性对诊断和防制本病带来一定的困难。经过多年的研究,许多国家在本病的诊断方面取得了显著成绩。多种血清学诊断方法研制成功,群特异性(group-specificity) 方法(琼脂扩散试验、改良补体结合试验、免疫荧光方法、酶联免疫吸附方法)和型特异性(type—specificity)方法(中和试验、红血球凝集抑制试验等)在生产中得到推广应用。但上述方法中有时使用活的病毒,对无蓝舌病的国家是一种潜在性的危险。为此,开展了病毒免疫活性的灭活方法的研究。本文介绍了几种灭活方法对比实验内容,并研制成一种可供诊断用的灭活病毒,为制     

猪水泡病和科赛奇B_5病毒的多肽成份与抗原差异的关系

自从Graves氏观察到一种感染人的肠道病毒科赛奇B_5(CB_5)的抗血清能中和猪水泡病病毒(SVDV),猪病毒也能感染人以来,人们就不断推测着两种病毒之间的关系和CB_5病毒在猪病病因学中可能起的作用。进一步的工作表明中和实验能区别两种病毒,也表明CB_5病毒存在着相当大的抗原性渐变。RNA杂交实验证实了这些抗原关系,英国SVDV分离物的RNA和原型(Faulkner)CB_5的BNA之间大约有50％的同源性,在原型CB_5     

非洲猪瘟病毒免提取核酸荧光定量PCR检测方法的建立

根据非洲猪瘟病毒(ASFV)保守的VP72基因序列,设计特异性引物和探针,经过优化反应体系中各组分及反应条件,建立了直接检测样品中ASFV的荧光定量PCR方法,并分析该方法的特异性和敏感性。结果显示,该直扩荧光定量PCR方法只对ASFV有特异性扩增,对其他几种相似疾病病原的灭活抗原,如猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒、猪圆环病毒、口蹄疫病毒、印第安纳型水泡性口炎病毒、新泽西型水泡性口炎病毒、猪流行性腹泻病毒等检测均呈阴性。敏感性试验结果显示,对10倍梯度稀释的非洲猪瘟病毒灭活抗原的检测敏感性可达1×10~(-6),与OIE推荐的传统的荧光PCR的检测敏感性相当。3个ASFV稀释度样品的组内和组间重复的变异系数均小于5%。该方法无须提取核酸,可在60 min内完成对样品的检测,检测快速、灵敏,结果准确,结合便携式荧光PCR仪,为野外或现场的非洲猪瘟病毒快速检测提供了一种切实可行的方法。     

甘草酸二钾体外抗鸡传染性法氏囊炎病毒的作用机制

利用鸡胚成纤维细胞(CEF)体外培养系统,通过观察细胞病变(CPE)和用MTT法测定细胞活力这两种方法来评价甘草酸二钾体外抑制鸡传染性法氏囊炎病毒(IBDV)对CEF的感染作用,并通过甘草酸二钾对病毒复制、吸附的阻断作用测定试验及直接灭活病毒测定试验,初步探讨了甘草酸二钾的抗病毒机制。结果显示,甘草酸二钾在安全浓度范围内对病毒感染细胞的抑制率达到70%以上,EC50为663.2±268.4μg/mL,SI>4.52;在阻断病毒复制、直接灭活病毒的试验中,甘草酸二钾显示了较强的抗病毒能力,但在阻断病毒吸附试验中却没有作用,推测其抗病毒机制可能是干扰了病毒的复制和直接使病毒灭活。提示,甘草酸二钾能够作为预防及治疗传染性法氏囊炎的药物或先导化合物。     

口蹄疫血清中和试验和琼脂凝胶沉降反应试验术式——日本国农林省家畜卫生试验场采用的方法

一、血清中和试验 (一)项目和试验方法 1.试验用细胞株:采用BHK-21或IB-RS-2细胞。 2.细胞培养:将含细胞数 3×10~5cell/毫升的细胞悬浮液0.5毫升,置培养试管(13毫米φ×100毫米)中,静置培养2～3天,使其形成90～100％的细胞单层。 3.试验用病毒株:采用对上述细胞株已经充分适应驯化的O、A、亚洲Ⅰ型毒株。 4.病毒液的配制:用稀释液配制含毒量200TCID_(50)/0.1毫升的病毒液。 5.被检血清:置56℃30分钟加温灭活后,用稀释液等量混合。     

四种常用消毒剂对H5N6亚型禽流感病毒灭活效果的研究

为了比较常用消毒剂对H5N6亚型禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)的杀灭效果,依照《消毒技术规范》,评估聚维酮碘溶液、过硫酸氢钾复合物粉、戊二醛癸甲溴铵溶液、稀戊二醛溶液这4种消毒剂在不同浓度下分别与H5N6亚型AIV作用10、30和60 min的灭活效果。结果显示,0.5%(m/V)聚维酮碘溶液作用10 min,0.2%(m/V)过硫酸氢钾复合物粉溶液作用10 min,0.2%(V/V)戊二醛癸甲溴铵溶液作用30 min或0.5%(V/V)稀戊二醛溶液作用10 min,均可将H5N6亚型AIV完全灭活。与推荐使用浓度相比,稀戊二醛溶液、聚维酮碘、戊二醛癸甲溴铵溶液均可以有效灭活H5N6亚型AIV,而过硫酸氢钾复合物粉不能有效灭活H5N6亚型AIV。本研究为H5N6亚型AIV消毒标准的建立提供了参考。     

重组免疫融合肽Tα1-BP5对鸭坦布苏病毒灭活疫苗的免疫增强作用

为研究重组融合肽Tα1-BP5(rTα1-BP5)对鸭坦布苏病毒灭活疫苗的免疫增强作用,本试验以rTα1-BP5联合鸭坦布苏病毒灭活疫苗免疫雏鸭,检测免疫后鸭的Ig G抗体、细胞因子(IL-4和IFN-γ)的分泌水平、淋巴细胞增殖水平和血清病毒中和抗体效价,并通过攻毒试验评价其对雏鸭的免疫保护作用。结果显示,rTα1-BP5能够增强机体免疫后Ig G抗体和细胞因子的分泌水平,增强淋巴细胞的增殖水平,提升血清病毒中和抗体效价。结果表明,rTα1-BP5能够增强机体细胞和体液免疫应答水平;动物免疫保护试验结果显示,rTα1-BP5配合鸭坦布苏病毒灭活疫苗免疫雏鸭后增强了对肝的免疫保护作用。本研究为鸭坦布苏病毒灭活疫苗的新型佐剂研究开发奠定了基础。     

科赛奇B_5型病毒的变异及其在猪水泡病病因学中可能起到的作用

科赛奇B_5型病毒(CB_5)和引起猪水泡病的病毒(SVDV)在血清学方面关系紧密。Graves氏曾用中和实验证明了病毒间有明显的交叉反应,并且它们的关系也被补体结合实验和免疫扩散实验所证实。在免疫扩散实验中,当两株病毒向SVDV所感染的猪的痊愈血清或者从科赛奇B_5感染康复的病人获得的血清扩散时产生了一致的一条沉淀线。此外,在同源反应中形成的刺线可以区别两病毒株或其各自的血清。     

猫杯状病毒的分离鉴定及其对理化因素抵抗力的研究

采集南京某宠物医院处置的疑似患猫杯状病毒病的家猫的鼻咽拭子,将其处理液接种于CRFK细胞,进行连续传代培养,出现特征性细胞病变。通过对该分离株进行形态学观察、PCR鉴定、间接免疫荧光试验,证明该分离株为猫杯状病毒(FCV),遂将其命名为FB-NJ-13。用RT-PCR分段扩增病毒基因组并将序列提交至GenBank(登录号:KM111557)。序列分析显示,该毒株与国内外参考毒株核苷酸序列的同源性在76.2%~79.6%之间。同时研究了该病毒对温度、酸碱、有机溶剂、干燥和紫外线照射等理化因素的抵抗力。结果显示,50℃30min或70℃5min即可灭活该病毒;该病毒在pH值为3的酸性环境中和pH值为10的碱性环境中不稳定;它对乙醚和氯仿不敏感;紫外线照射2.0h以上,可将该病毒有效灭活。上述研究结果为揭示我国FCV的分子生物学特征和遗传进化规律提供了重要的科学依据。     

犬冠状病毒压力灭活苗的制备与应用研究

使用静水压高压灭活的方法制备犬冠状病毒(CCV)蜂胶佐剂灭活苗,将此灭活苗免疫接种易感犬,同时以CCV甲醛灭活苗作对比试验.结果表明,CCV压力灭活苗安全可靠,其诱导试验犬产生中和抗体的能力明显高于该病毒的甲醛灭活苗,临床应用证明该灭活苗可以控制犬冠状病毒性肠炎的发生与流行.     

猪传染性水泡病病毒与科赛奇B_5病毒在猪体交互免疫试验

我国流行的猪传染性水泡病病毒(简称水泡病病毒)具有人类肠道病毒中科赛奇病毒(Coxsackie virus)相类似的特征——能引起新生乳鼠麻痹致死。这曾促使我们通过交互中和实验,证实了我国流行的水泡病病毒与科赛奇B_5病毒之间存在着密切的血清学关系,曾用以上两种病毒分别测定了同一份血清的中和效价,说明它们确实存在着共同的抗原结构。我们还从电镜比较观察中,发现两种病毒颗粒的大小与形态基本相同,病毒在细     

鹅副黏病毒广西分离株生物学特性的研究

采用鸡胚接种和细胞培养的方法 ,从广西武鸣县某鹅场患病鹅脑、肝、脾中分离获得了 2株病毒 ;经RT PCR、HA和HI试验等研究 ,证实其为鹅副黏病毒。经测定 ,分离毒 2 3 7 F3株的ELD50 为 10 - 7.2 5/0 .1mL ,TCID50 为 10 - 6 /0 .1mL ,MDT为 38.8h ,ICPI为 2。将该分离毒 10倍稀释 ,接种鸡胚成纤维细胞 ,4 0h后出现细胞病变 ,证实该分离毒为强毒株。病毒能凝集鸡、番鸭、鸽、猪、山羊、兔、豚鼠、黄鳝及人O型红细胞。 5 6℃ 10min、6 0℃ 10min、pH 4溶液处理 1h均不能使该病毒灭活 ,而 5 0mL/L氯仿处理 10min、6 0℃水浴 30min能灭活该病毒。人工感染的 11日龄雏鸡全部发病和死亡 ;感染的 10日龄雏鹅 6 0 %发病 ,发病鹅全部死亡 ;感染的 30日龄肉鸽发病率达 83.3%(5 /6 ) ,死亡率 10 0 %。对 1日龄肉鸭无致病性     

畜禽环境消毒剂强力消毒灵的消毒效果试验

通过与百菌消－３０、菌毒敌对比，进行了强力消毒灵对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、蜡样芽胞杆菌、禽巴氏杆菌、丝状霉形体山羊亚种的抑菌效果试验、对细菌的阻止发育率试验、低温条件下的抑菌试验，对鸡瘟病毒、猪瘟病毒、猪水泡病病毒的灭活试验，对实验动物的安全性试验及中试产品的推广应用，证明强力消毒灵是一种速效、广谱、安全，且能在较低温条件下，在带畜（禽）条件下应用的高效环境消毒剂。     

非洲猪瘟病毒荧光RPA快速检测方法的建立及初步应用

本研究根据非洲猪瘟病毒(ASFV)基因组中序列保守稳定的B646L基因设计特异性引物和探针,建立了敏感、特异、高效的ASFV核酸RPA快速检测法。结果显示,该方法特异性强,能准确检测ASFV核酸,与猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征(PRRSV)、猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2)、口蹄疫病毒(FMDV)、猪A型塞内卡病毒(SVA)等灭活病毒核酸无交叉反应;敏感性高,本试验中最低可检测到2×101copies/uL;检测时间短,15 min即可完成反应;重复性好。采用ASFV灭活抗原和猪血液制备模拟临床猪血样品,能检出灭活抗原的稀释度为1∶12 800,应用该方法对200份进口冻猪产品及供港猪场420份猪抗凝血进行检测,结果均为阴性,与OIE推荐的实时荧光PCR法检测结果相同。本研究建立的RPA快速检测法操作简便,尤其适合ASFV现场快速检测。     

鸽新城疫病毒分离株的部分生物学特性鉴定及疫苗免疫试验

从暴发疑似鸽新城疫的某赛鸽场分离到1株病毒,通过血凝(HA)试验、血凝抑制(HI)试验及鸡胚中和试验初步鉴定为鸽新城疫病毒,进而进行了鸡胚半数感染量(EID50)、鸡胚平均死亡时间(MDT)测定扣对不同动物红细胞的凝集试验,证明该分离株属新城疫强毒力毒株.将该毒株经鸡胚尿囊液增殖后用甲醛灭活,制成油佐剂灭活苗,对鸽免疫后检测其血清抗体水平并进行攻毒试验,结果在免疫后21 d抗体达到高峰,攻毒试验表明油佐剂灭活苗对鸽新城疫病毒感染有较强的保护力.     

用振荡血凝试验检测兔瘟病毒

兔瘟病毒对人的红细胞具有很强的凝集作用,血凝效价可达到很高的滴度。我们在进行兔瘟病毒的凝集试验中,发现凝集反应在振荡情况下完成时,不同时间内红细胞可被凝集成微粒、颗粒直至团块,凝集物在液体中进行各种不同形式的特殊运动。而且凝集反应的程度与病毒含量的多少有很大关系。根据这一现象我们设计和建立了一种新的血凝试验方法——振荡血凝试验(VHA)。VHA能对兔瘟病毒进行检测,5分钟即可获得定量结果,判定客观,操作简便,特异性强,敏感性高,是一种快速诊断兔瘟的有效方法。     

犬细小病毒JS12株VP2基因的分子特征及其在大肠杆菌中的表达

从犬细小病毒病免疫预防失败病犬体内分离到1株犬细小病毒(CPV),命名为CPV-JS12株。病毒可凝集猪的红细胞,对乙醚不敏感,pH3不能灭活病毒,pH10可使病毒失去感染性,56℃作用60min病毒仍有活性,80℃作用30min可灭活病毒。序列分析时CPV-JS12为CPV-2a亚型,VP2基因全长1755nt,编码584aa,与国外CPV毒株VP2基因的核苷酸序列和氨基酸序列的同源性分别在98.9%~99.6%和98.3%~99.7%之间,与国内和周边地区毒株VP2基因的核苷酸序列和氨基酸序列的同源性分别在99.0%~99.7%和97.9%~99.7%之间;16个中国分离株处在不同组,CPV-JS12株与韩国毒株DH426处在同一分支上,亲缘关系较近。对CPV-JS12与免疫毒株VP2蛋白的立体结构分析比较,发现有9处氨基酸残基变异,其中6处位于衣壳蛋白表面,5处位于抗原表位区。将VP2基因在大肠杆菌中表达,重组VP2蛋白的分子质量为67.0ku,主要以包涵体的形式存在;Western-blot分析中重组VP2蛋白可与CPV阳性血清发生特异性反应。以纯化的重组VP2蛋白为抗原建立的CPV抗体间接ELISA检测方法具有良好的特异性。     

乌骨鸡体内鸡肾型传染性支气管炎病毒的分离鉴定

从具有鸡肾型传染性支气管炎（ＮＩＢ）临床病变特征的乌骨鸡体内分离到一株病毒。该病毒经鸡胚盲传６代后，可引起４０％以上鸡胚死亡，并出现典型的侏儒胚；人工感染雏鸡表现为肾肿大和尿酸盐沉积；能干扰新城疫ＬａＳｏｔａ株在鸡胚中的繁殖；病毒对氯仿和乙醚敏感，５６℃水浴３０分钟被灭活，耐ｐＨ３和ｐＨ１１；不能直接凝集红细胞，但经１．５％胰酶处理后能凝集鸡红细胞（１：５１２），这种血凝活性可被传染性支气管炎病毒（ＩＢＶ）澳大利亚Ｔ株阳性血清所抑制；电镜下可见直径约９０ｎｍ、大小一致的圆型病毒颗粒，表面有稀疏的纤突，长约２０ｎｍ，与冠状病毒形态相似。综合以上特性，证明所分离病毒为鸡肾型传染性支气管炎病毒（ＮＩＢＶ）。     

麻雀体内传染性法氏囊病病毒的分离鉴定及理化特性研究

从传染性法氏囊病（ＩＢＤ）阳性麻雀体内分离到了一株病毒，用传染性法氏囊病病毒（ＩＢＤＶ）单克隆抗体夹心ＥＬＩＳＡ试验和ＤＩＧ－标记ＩＢＤＶｃＤＮＡ探针斑点杂交试验证明该病毒为ＩＢＤＶ。病毒可适应于鸡胚和鸡胚成纤维细胞，产生细胞病变效应（ＣＰＥ）。病毒血清型鉴定为Ⅰ型，病毒代谢抑制试验证明其基因组为ＲＮＡ，病毒核酸的电泳图谱呈两条特征带。病毒对乙醚不敏感，ｐＨ２．０不能灭活病毒，ｐＨ１２可使病毒失去感染性，５６℃作用３小时病毒仍有活性，７０℃１小时可灭活病毒。以上结果表明从麻雀体内分离到的ＩＢＤＶ理化性质比较稳定，与目前鸡场流行的ＩＢＤＶ极为相似，可能与鸡ＩＢＤＶ同源，提示麻雀可能在ＩＢＤ流行病学中起主要作用。     

树突状细胞对灭活口蹄疫病毒的泛素化作用

通过制备BALB/c小鼠单核细胞源树突状细胞(DC),构建了树突状细胞与灭活口蹄疫病毒(FMDV)的体外作用系统,考察树突状细胞对灭活FMDV的泛素化作用。收获荷载灭活FMDV后不同时间的树突状细胞,制备树突状细胞裂解液,用SDS-PAGE和Western-blot分析灭活FMDV抗原是否被泛素化。结果发现,在将灭活FMDV荷载于树突状细胞后的第0.5、3、6、10和20 h均可检测到分子质量约为75ku的FMDV蛋白,并且被FK2抗体标记的泛素化蛋白含量明显多于FK1抗体标记的泛素化蛋白含量。说明灭活FMDV被树突状细胞加工提呈的过程包括泛素化作用,并且泛素化蛋白主要在溶酶体内被降解。