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乳牛子宫内膜抗菌肽BNBD5基因的克隆及其原核表达 总被引:1,自引:1,他引:0
为研发防治乳牛子宫内膜炎的抗菌肽生物制剂,根据已发表的牛抗菌肽基因序列设计了1对引物,用试剂盒提取乳牛新鲜子宫内膜总RNA,经RT-PCR扩增,将克隆的抗菌肽BNBD5基因全长编码区的cDNA连接到原核表达载体pET30a中,经IPTG诱导原核表达,通过Western-blot检测融合蛋白BNBD5的表达水平.结果表明,RT-PCR扩增出的cDNA片段长138 bp,编码45个氨基酸的多肽,多肽中合6个保守半胱氨酸残基.用Blast程序进行检索比较显示,克隆出了牛防御素家族成员BNBD5基因,并成功构建了pET30a-BNBD5载体,经IPTG诱导,pET30a-BNBD5原核表达产物的相对分子质量约为10 ku,与预期的融合蛋白大小一致,证实构建的重组质粒能够在大肠杆菌中表达. 相似文献
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抗菌肽Dermadistinctin-K的原核表达及生物活性鉴定 总被引:1,自引:0,他引:1
为了获得抗菌肽Dermadistinctin-K并鉴定其生物活性,依据GenBank中的氨基酸序列,使用化学合成和PCR相结合的方法获得了完整的Dermadistinctin-K基因序列;使用表达载体pET-32a(+)构建工程菌;用IPTG诱导融合蛋白表达并优化其表达条件,在IPTG终浓度0.1mmol/L下诱导5h表达量最大;最后用His-tag protein Purification kit纯化了融合蛋白,使用肠激酶酶切获得目的蛋白,并进行生物活性鉴定。分析结果表明,抗菌肽Dermadistinctin-K具有抗菌活性和一定的耐热性,其生物活性与pH值密切相关。 相似文献
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为了解牦牛舌抗菌肽(LAP)基因序列的特征及其在生殖系统中的表达情况,采用RT-PCR法从牦牛睾丸、附睾组织中扩增LAP基因,重组到pMD19-TSimple载体中,进行了测序和序列分析,并应用RT-PCR检测了雌性牦牛生殖系统(卵巢、输卵管、子宫、阴道等组织)中LAPmRNA的表达。结果显示,克隆的LAP基因包含一195bp的完整开放阅读框(ORF),与牛LAP基因相似性达97.9%,该ORF编码的64个氨基酸含有β-防御素特征性结构,即6个在特定位置上的保守半胱氨酸残基;LAP在牦牛生殖系统上皮组织中均有表达。推测LAP在牦牛生殖系统的先天免疫中具有重要作用。 相似文献
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抗菌肽Dermadistinctin串联表达载体的构建及表达产物抗菌活性的鉴定 总被引:1,自引:0,他引:1
根据GenBank中Dermadistinctin K(DDK)和Dermadistinctin L(DDL)的氨基酸序列,选择大肠杆菌偏嗜性密码子,采用SOE法合成了DDK和DDL基因.在DDK及DDL基因序列中引入肠激酶裂解位点,并将其依次克隆入pET-32a(+)质粒,构建了串联体融合表达载体P-DDK,并将其转入Rosetta(DE3)中进行融合表达;表达产物在终浓度为0.1 mmol/L IPTG诱导4 h后可达到最大表达量.对重组蛋白DDK进行镍离子亲和层析柱纯化以及肠激酶裂解之后,对酶切产物进行了抑菌活性分析.分析结果表明,抗菌肽DDK与DDL的混合物对金黄色葡萄球菌(Cowan Ⅰ)、大肠杆菌DH5α、致病性大肠杆菌O_1、猪霍乱沙门氏菌、多杀性巴氏杆菌均具有一定的抑菌活性. 相似文献
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为探讨干细胞转录因子与穿膜肽融合表达蛋白对水牛体细胞诱导重编程的可行性,作者对影响水牛cMyc基因穿膜肽融合蛋白表达的因素进行了探索。应用双酶切定向克隆的方法,将水牛cMyc基因CDS(1 350bp)连接到pET-HA2-TAT载体中,构建成pET-cMyc-TAT载体,经酶切、PCR和测序验证,载体构建正确。将pET-cMyc-TAT载体转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导目的蛋白表达,同时探索了其表达形式、诱导表达IPTG最优浓度和最优时间以及蛋白纯化咪唑洗脱的最佳浓度。结果表明,融合蛋白cMyc-TAT在37℃以包涵体的形式大量表达,IPTG终浓度0.001mmol/L,诱导5h为最佳诱导条件,纯化蛋白最佳咪唑洗脱浓度为145.76mmol/L,纯化蛋白经过Western-blot验证具有抗原性。研究结果为建立转录因子穿膜肽融合蛋白诱导水牛iPS细胞技术体系奠定了基础。 相似文献
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根据大肠杆菌的密码子偏好性,将编码AvBD2成熟肽的基因原片段Na-AvBD2优化为片段Op-AvBD2,将2条片段分别转化至大肠杆菌中重组表达,表达产物经GST树脂纯化后,对二者的表达水平和抗菌活性进行了比较。结果,融合蛋白rOp-AvBD2的表达量比rNa-AvBD2高2倍。而两者对大肠杆菌(CM-CC44102)、金黄色葡萄球菌(ATCC25923)、鸡白痢沙门氏菌(CVCC533)和粪肠球菌(ATCC29212)的抑菌活性及对鸡白痢沙门氏菌(CVCC533)和粪肠球菌(ATCC29212)菌体超微结构的破坏程度无显著差异。结果提示AvBD2在预防和治疗细菌感染中具有替代抗生素的潜在应用价值,而密码子优化将成为通过基因工程生产AvBDs的可行途径。 相似文献
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