绵羊夏柏特线虫和叶氏夏柏特线虫线粒体nad5基因和cytb基因的序列分析

本研究的目的是通过对绵羊夏柏特线虫和叶氏夏柏特线虫线粒体细胞色素b基因(cytb)部分序列(pcytb)和烟酰胺嘌呤二核苷酸(NADH)脱氢酶亚单位5基因(nad5)部分序列(pnad5)的克隆和遗传变异分析,首次为在分子水平上区分绵羊夏柏特线虫和叶氏夏柏特线虫提供理论依据。采用PCR方法分别克隆了6条绵羊夏柏特线虫陕西分离株和9条叶氏夏柏特线虫青海分离株的pcytb和pnad5。将测序结果应用ClustalX 1.81程序进行比对,然后用PAUP 4.0程序中的MP法将pcytb和pnad5串联后构建系统发育树。结果显示,获得的pnad5和pcytb序列的长度分别为388bp和659bp,其变异率在绵羊夏柏特线虫分离株中分别为0.3%~1.3%和0.2%~2.6%,在叶氏夏柏特线虫分离株中分别为0~1.8%和0.2%~1.2%,较为保守。但pnad5和pcytb序列在两种间差异率较大,分别为14.7%~16.0%和15.0%~17.3%。用pcytb和pnad5串联后的序列进行的种系发育分析表明,绵羊夏柏特线虫和叶氏夏柏特线虫分别位于2个分支,支持叶氏夏柏特线虫为独立种;pcytb和pnad5序列可作为夏柏特线虫种间鉴定的遗传标记。     

少孢节丛孢菌Aoz1基因的生物信息学分析及原核表达条件的优化

为获悉少孢节丛孢菌内蒙古株Aoz1基因的详细信息,以研究捕食线虫性真菌对线虫的作用机制,本试验以捕食线虫性真菌的代表种——少孢节丛孢菌内蒙古株为研究对象,首先扩增其胞外丝氨酸蛋白酶的基因编码序列,并进行生物信息学分析,然后将其构建至原核表达载体pET-32a中,再转化至Transetta(DE3)表达感受态细胞中,进行表达条件的优化以及表达产物的纯化。结果表明,少孢节丛孢菌内蒙古株丝氨酸蛋白酶Aoz1基因与已发表的丝氨酸蛋白酶Aoz1基因的同源性为99%,其蛋白具备螺旋结构;在原核系统中进行表达,其最适IPTG诱导浓度为1.5 mmol/L,最佳诱导时间为8 h,确定了重组蛋白的最佳表达条件,并获得了重组蛋白。对该酶基因的分析,为后续有关蛋白酶和捕食线虫性真菌杀灭寄生性线虫机理方面的研究提供了参考资料。     

旋毛形线虫分类的研究进展

概述了旋毛形线虫属种分类研究的现状及虫体杂交试验、同工酶酶谱分析、分子生物学及分子遗传学试验等旋毛虫分类方法的研究进展,指出目前国际上已将毛形属分为8个隔离种(即T.spiralis, T1;T.nativa, T2;T.britovi, T3;T.pseudospiralis, T4;T. murrelli, T5;T.nelsoni, T7;T.papuae,T10T.zimbabwensis,T11)和3个分类地位尚未确定的基因型(即T6、T8和T9).     

细颈线虫线粒体cox1基因的扩增及遗传进化分析

为分析奥拉奇细颈线虫和扁刺细颈线虫线粒体cox1基因部分序列(pcox1)的遗传变异情况,对采集的22个细颈线虫样品的pcox1序列进行了扩增和序列分析。结果显示,两种细颈线虫pcox1片段的长度均为400bp;奥拉奇细颈线虫和扁刺细颈线虫pcox1序列的种内差异分别为0.25%~4.00%和0~1.50%,种间差异为9.00%~12.75%;通过重构遗传进化关系分析发现,奥拉奇细颈线虫和扁刺细颈线虫位于2个独立的分支上,可有效区分两种细颈线虫。结果表明,pcox1可作为奥拉奇细颈线虫和扁刺细颈线虫遗传进化的理想分子标记。     

奇妙节丛孢的分离及对捻转血矛线虫幼虫和秀丽隐杆线虫捕食过程的观察

本研究从牛羊放牧草地土壤、粪堆、厩舍土壤及林地土壤中分离捕食线虫性真菌奇妙节丛孢菌(Arthrobotrys thaumasia),并进一步了解分离株对线虫的捕食过程。首先,使用诱饵平板技术分离奇妙节丛孢菌;然后,借助扫描电镜对NBS005分离株与绵羊捻转血矛线虫的幼虫及自由生活线虫秀丽隐杆线虫的捕杀动态学及相互作用进行观察。结果显示,在1 532份与牛羊相关的样品中分离出11株奇妙节丛孢菌,检出率为0.71%(11/1 532)。扫描电镜观察显示,加入试验线虫后第6小时,该菌产生捕食结构并开始捕捉试验线虫。其中,二期幼虫(L2)于捕捉后第8小时被真菌刺入角质层,第30小时虫体明显皱缩,提示虫体正处于消化过程,第78小时虫体被消化完全;第三期的感染性幼虫(L3)于捕捉后第12小时被真菌穿透,第42小时虫体表面皱缩,第84小时虫体消化完全;秀丽隐杆线虫于捕捉后第7小时被真菌刺入并明显皱缩,第12小时虫体严重皱缩,第18小时消化完全。以上结果表明,本研究中所分离的真菌属于奇妙节丛孢菌,该菌捕捉以上三种类型的线虫后,真菌对线虫捕食作用的时间随着线虫类型不同而有差异。     

耕牛“烂蹄病”病因学调查——几种镰刀菌代谢产物的毒性实验

此项研究对几种镰刀菌代谢产物的毒性进行了研究:其结果:①从“烂蹄病”病区采取52份耕牛饲草,共检出真菌3197株,主要是曲霉属、镰刀菌属、青霉属、芽枝孢霉属和交链孢霉属等。其中镰刀菌(拟枝孢镰刀菌、半裸镰刀菌和木贼镰刀菌)的污染率与“烂蹄病”发生呈正相关;②从“烂蹄病”病区耕牛饲草上分离的10种53株镰刀菌的玉米培养物用乙醚提取,其中30份提取物使兔的皮肤出现反应。拟枝孢镰刀菌和半裸镰刀菌的玉米培养物及其乙醚、甲醇-水(95 5)提取物引起大白鼠和小白鼠中毒死亡。用其乙醚粗毒素腹腔注射两只健康杂交公山羊,出现了典型“烂蹄病”病征。     

牦牛胃肠道线虫与其幼虫消长规律的研究

本文对青藏高原东部牦牛,采用斯氏法和水浴法分别检查胃肠内容物和粘膜、肠系膜淋巴结、纵膈淋巴结及肺脏气管内的胃肠道线虫和寄生阶段幼虫。同步观察结果:库柏线虫、食道口线虫、毛圆线虫、细颈线虫、仰口线虫、夏柏特线虫和毛首线虫等7属的成虫,2～6月先后出现1次明显的春季高潮。除食道口线虫外,8～12月又先后出现1次秋季高潮。而奥斯特他线虫和毛细线虫两属,春季高潮不明显,秋季高潮明显。上述9属线虫的寄生阶段幼虫,除毛细线虫未能检出外,其余8属先后于8月到翌年3月份出现高潮。总的律规是,8～12月寄生阶段幼虫陆续升高,并先后达到高峰,1～6月随着幼虫荷量的先后下降,成虫荷量先后升高,并形成春季高潮。冷季寄生阶段幼虫在牦牛体内居优势,暖季成虫占优势。     

捻转血矛线虫伊维菌素耐药株P-糖蛋白基因多态性的PCR-RFLP分析

为了解P-糖蛋白基因在捻转血矛线虫伊维菌素耐药株和敏感株间的差异,进一步弄清该基因与伊维菌素耐药性产生的关系,用PCR-RFLP方法分析了捻转血矛线虫伊维菌素耐药株P-糖蛋白基因hcpgp-1的多态性,并对所得序列进行测序。结果表明:捻转血矛线虫伊维菌素敏感株虫体的PCR产物不能被内切酶KpnⅠ切开,而伊维菌素耐药株虫体的PCR产物可被内切酶切开;酶切后统计数据显示,10条敏感虫株全部为敏感纯合子(BB);在所检测的20条伊维菌素耐药性虫株中,抗性纯合子(AA)6个(30%),杂合子(AB)13个(65%),敏感性纯合子(BB)1个(5%)。其中,AB基因型频率最大,为优势基因型,其次为AA型,BB型比例最低。抗性等位基因A为优势基因,其频率为62.5%,敏感等位基因B的频率为37.5%。同源性分析发现,具有抗性的糖蛋白基因hcpgp-1与敏感株的同源性较低,在80.2%～89.3%之间。且发现伊维菌素耐药株hcpgp-1基因序列中,有多处碱基发生了突变。本研究结果为进一步了解P-糖蛋白在捻转血矛线虫伊维菌素耐药性产生中的作用,提供了参考数据。     

少孢节丛孢菌孢子批量培养及通过动物消化道的试验

试验了捕食线虫性真菌———少孢节丛孢菌 (Arthrobotrysoligospora)孢子批量培养技术、孢子通过兔消化道后的活力及其对绵羊消化液的体外耐受力。结果表明 ,少孢节丛孢菌孢子最适合以玉米粒为基质批量培养 ;少孢节丛孢菌的孢子在通过兔消化道后 ,可以保持存活 ;并且在体外对绵羊瘤胃液、真胃液、十二指肠液有一定的耐受力     

甘南牦牛三种消化道线虫多重PCR检测方法的建立及流行病学调查

为建立一种能同时检测奥氏奥斯特线虫、捻转血矛线虫和环纹背带线虫的多重PCR检测方法,掌握三种线虫在甘南牦牛中的流行情况,本研究以三种线虫的核糖体ITS序列为靶标设计3对特异性引物,建立了多重PCR检测方法,同时检测986份甘南牦牛粪便样品,对三种线虫进行流行病学分析。结果显示,本研究建立的多重PCR方法检测到奥氏奥斯特线虫、捻转血矛线虫、环纹背带线虫DNA的最低浓度分别为0.03、0.03、0.02 ng/μL,三种线虫的感染率分别为12.58%、14.30%、11.36%,混合感染率为12.98%。1—4月份3种消化道线虫的感染率显著高于5—8月份和9—12月份（P<0.01）,3种消化道线虫的感染率在0～3岁与大于3岁的牦牛之间差异不显著。本研究成功建立了用于牦牛奥氏奥斯特线虫、捻转血矛线虫、环纹背带线虫的多重PCR检测方法;甘南牦牛三种线虫的流行率较高,提示甘南牦牛消化道线虫的防控不能忽视。     

枝孢样枝孢霉弱毒株的微波诱变结合亚硝基胍诱变选育

为建立枝孢样枝孢霉弱毒株突变体的诱变方法,研究枝孢样枝孢霉及其突变体生物特性和致病力,用不同浓度的亚硝基胍和微波诱变野生型枝孢样枝孢霉,经小鼠致病性试验筛选,得到1株菌落颜色明显变浅,表型改变,产孢期短,产孢量明显减少,对小鼠致病力减弱的毒株Zt。确定了枝孢样枝孢霉突变体的诱变条件,得到了预期突变样本。     

湖南省2种鼠类线虫新记录

在湖南省长沙市东郊剖检59只褐家鼠、12只黑家鼠,从其肠道中检获2种线虫,经鉴定为巴西日圆线虫(Nippostrongylus brasiliesis)和四翼无刺线虫(Aspiculuris tetrateres).前者在褐家鼠的感染率为89.83%(53/57),感染强度为1-14条,在黑家鼠的感染率为58.33%(7/12),感染强度为1-10条;后者在褐家鼠的感染率为35.59%(21/59),感染强度为1-8条,在黑家鼠的感染率为41.67%(5/12),感染强度为1-5条.     

RNA干扰技术及其在寄生线虫基因功能研究中的应用

介绍了RNA干扰(RNAi)的概念、线虫中RNAi的作用机理、RNAi的三个分子特性,即可遗传性、转移性RNAi的放大效应和RNAi信号的传播特性。从模板dsRNA的获取、dsRNA的导入和线虫中RNAi效应的检测方法三个方面概述了应用RNAi技术研究线虫基因功能的试验方法和最新进展。     

用表面免疫荧光法鉴定鸡源霉形体

本文报告了用表面免疫荧光法鉴定鸡源霉形体的结果。此法具有很高的特异性,能成功地用于分类鉴定的目的,并能检出培养物中混杂的霉形体种类。 (一)材料和方法 1.培养基:按Frey(1968)所介绍的配方经过适当修改后制成。 2.霉形体菌株:自国际霉形体中心Freundt教授处引进4种霉形体模式株:鸡毒霉形体(Mycoplasma gallisepticum,PG31株);雏鸡霉形体(M.pullorum,CKK株);滑液霉形体(M.synoviae WVU1853株);鸡霉形体(M.gallinarum PG16株)。新分离菌株有:从北京东沙种鸡场(DS)分离3株;从北京朝阳区十八里店公社西直河大队鸡场(XZ)分离13株;从海淀区四季青公社巴沟鸡场(BG)分离23株;从广西南宁市郊区(GX) 4个鸡场分离10株,共计49株。     

鸡源霉形体的分离和鉴定

对乌鲁木齐市 2个大型鸡场鸡毒霉形体 (Mycoplasmagallisepticum ,MG)、滑液囊霉形体 (M .synoviae ,MS)感染情况用血清平板凝集试验 (SPA)进行了血清学抽样调查。结果表明 ,凝集抗体的阳性率分别为 6 6 .92 %和 35 .90 %,其中商品鸡场MG和MS的阳性率分别为 82 .5 0 %和 5 2 .5 0 %。从疑似MG、MS感染鸡的气管、肺、气囊、鼻裂和跗关节腔分离到 19株分离物。经初步鉴定 ,分离物均为霉形体属成员。用生化和血清学及其他生物学方法 ,对这些分离物进行了鉴定。结果 6株为MG ,3株为MS ,其余 10株也属于霉形体。     

食蟹猴源食道口线虫和缩小特尼登线虫的形态学鉴定及基于其ITS2基因的分子种系发育分析

对采集自食蟹猴肠道血结节中的3种线虫进行形态观察后鉴定,并用PCR扩增其ITS2基因后进行序列测定分析。结果显示,3种线虫分别为尖形食道口线虫、双叉食道口线虫及缩小特尼登线虫。测序结果表明,3种虫体ITS2基因序列的大小均为216bp。邻位连接法构建的种系发育树显示,本研究中测定的尖形食道口线虫、双叉食道口线虫和缩小特尼登线虫序列在进化树上自成独立的拓扑分支。以上结果为人类食道口线虫病及缩小特尼登线虫病建立分子鉴别诊断方法提供了分子标记。     

特种经济动物球虫种类调查

从安徽、山东和河北省以及上海市郊采集梅花鹿、鹧鸪、獭兔、山鸡、北极狐、水貂、孔雀、海狸鼠、野鸭、野兔、天鹅等11种特种经济动物的粪样,观察了4104个球虫卵囊,共发现4属82种球虫,其中艾美属(Eimeria)74种,等孢属(Isospora)5种,泰泽属(Tyzzeria)1种,温扬属(Wenyonella)2种.     

绵羊毛圆科线虫卵在不同温度下的发育情况观察

观察了寄生于绵羊体内的优势虫种细颈线虫、奥斯特线虫、捻转血矛线虫、马歇尔线虫等毛圆科线虫卵在不同环境中的发育能力 ;研究了细颈线虫卵在相对湿度 10 0 % ,0、3、5、10、15、2 0、2 5、30、35℃共 9个不同温度梯度的发育率和发育周期 ;并对毛圆科线虫卵在 - 17～ - 2 5℃自然冷冻环境中的发育情况和幼虫在干燥环境中的抗干旱能力进行了测试。结果表明 ,细颈线虫卵在 2 0℃、相对湿度 10 0 %的条件下发育率最高 ,发育周期最短 ;毛圆科线虫卵在 - 2 5～ 0℃环境中不发育 ,也不死亡 ;毛圆科线虫的幼虫在无水分的干燥环境中可存活 10 0d左右。     

鲁道夫对盲囊线虫C新种的ITS rDNA序列测定及种系发育关系分析

以鲁道夫对盲囊线虫C种为研究对象,对其rDNA的内转录间隔区(ITS)序列进行PCR扩增、测序和序列分析,以Clustal X 1.81程序对序列进行比对,然后用MEGA4.0程序的MP法和NJ法及PUZ-ZLE 4.1程序的ML法构建鲁道夫对盲囊线虫A、B、C种以及北方对盲囊线虫的种系发育关系.结果显示,鲁道夫对盲囊线虫C种的ITS-1,5.8 S,ITS-2序列大小分别为451 bp、127 bp和277 bp,鲁道夫对盲囊线虫3个种与北方对盲囊线虫ITS序列种内差异小,种间差异明显.种系发育关系分析发现,这3种方法(NJ法、MP法和ML法)构建的种系发育树的拓扑结构基本一致,其中C种和A种聚在一起,构成一支,再和B种聚在一起;北方对盲囊线虫单独成一支.研究结果证明鲁道夫对盲囊线虫C种确为一新种.     

应用RNA干扰技术抑制捻转血矛线虫Hc38基因转录的研究

为研究RNA干扰对捻转血矛线虫Hc38基因转录的抑制作用,针对Hc38基因序列设计并合成特异性dsRNA、3对siRNAs(siRNA1,siRNA2,siRNA3),采用浸泡方式分别将dsRNA、siRNAs导入捻转血矛线虫感染性L3期幼虫体内,利用实时荧光定量PCR分析Hc38基因在L3期幼虫中的相对含量以确定抑制效果。通过体外转录成功获得高浓度和高纯度的dsRNA,L3期幼虫经浸泡处理3d后,siRNAs组Hc38基因的相对含量分别为(14.93±1.75)%、(26.34±2.91)%和(15.86±2.54)%,dsRNA组为(32.27±1.50)%,均显著低于对照组。表明通过浸泡法导入的dsRNA和siRNAs均能有效抑制Hc38基因的转录,从而为捻转血矛线虫及其他寄生线虫的基因功能研究提供了一种新的方法。