抗O型口蹄疫病毒单克隆抗体的制备及其生物学特性分析

用灭活O型口蹄疫病毒为抗原免疫BALB/c小鼠4次后,取致敏的脾B淋巴细胞和SP2/0小鼠骨髓瘤细胞进行融合,在HAT选择培养基中培养2周,经间接ELISA法筛选,最终获得了3株抗O型FMDV的阳性杂交瘤细胞株,命名为2F1、2G7和6H4。血清学试验证明该McAbs能与FMDV抗原结合,具有高度特异性。     

抗O型口蹄疫病毒VP1蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

以高浓缩的O型口蹄疫病毒(FMDV)灭活疫苗为抗原免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与小鼠SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,以重组表达的O型重组VP1蛋白(O-r VP1)为筛选抗原,利用杂交瘤技术获得1株可稳定分泌抗O型FMDV VP1蛋白抗体的杂交瘤细胞株1C7,染色体数高于任一亲本细胞的染色体数目;腹水的抗体效价为1︰105,质量浓度为4.7 mg/m L。1C7单克隆抗体为IgG2b亚型,相对亲和力常数为1.5 mol/L,能够与O型FMDV特异性地结合,且仅与结构蛋白VP1反应。稳定性鉴定结果表明1C7株能稳定分泌抗体。阻断ELISA试验表明1C7单克隆抗体能够被O型FMDV免疫阳性血清特异性地阻断。本研究为进一步建立O型FMDV抗体的阻断ELISA及胶体金免疫层析快速检测方法奠定了基础。     

三株O型口蹄疫病毒单克隆抗体的抗原识别位点分析

用抗O型口蹄疫病毒(FMDV)单克隆抗体杂交瘤细胞株(4A9、4C3、9F12)制备腹水并进行纯化,经ELISA检测,单抗4A9、4C3和9F12的腹水效价分别为1:25 600、1:102 400和1:51 200,SDS-PAGE分析显示,3株纯化单抗均以IgG重链和轻链为主,其分子质量分别约为45 ku和25 ku.单抗4A9、4C3和9F12的饱和度分别为1:40、1:40和1:1 000,叠加试验所得增值指数分别为0.27%、13.05%、13.34%,均小于50%.Western-blotting结果显示,3株单抗均可与O型FMDV结构蛋白VP1发生特异性反应.表明,此3株单抗均识别O型FMDV VP1蛋白上的同一个抗原位点,存在干扰现象.     

口蹄疫病毒O型和A型交互反应性单克隆抗体的筛选与鉴定

不同血清型口蹄疫病毒(FMDV)之间不能产生交叉免疫保护,但是血清学的交叉反应确实存在。本研究旨在建立一种筛选型间交互反应性抗体的方法,以期为解析FMDV血清型间保守的抗原结构奠定基础。本方法主要依据单个B细胞抗体技术,首先采用两种不同的荧光染料FluoProbes 647H和Pacific Blue分别标记O型与A型FMDV 146S灭活抗原,然后利用流式细胞分选技术,从免疫牛外周血单个核细胞(PBMCs)中分选出结合两种抗原的特异性B细胞,通过单个B细胞抗体基因测定,获得Ig G抗体重链与轻链可变区编码序列,并将可变区基因插入含有牛IgG抗体恒定区的pcDNA3.4载体中,构建IgG抗体的重链与轻链表达质粒。将重链与轻链表达质粒共转染中国仓鼠卵巢悬浮细胞(CHO-S)进行完整抗体表达。结果显示,通过该方法获得了5株FMDV特异性单克隆抗体,其中4株(H64、R82、I16、R29)经间接免疫荧光(IFA)检测都可特异性识别O和A型FMDV;ELISA结果显示,H64、R82、I16与O、A型抗原均具有较好的亲合力;Western-blot结果显示,I16可特异性结合O、A型FMDV结构蛋白VP2中的线性表位,说明在衣壳蛋白VP2上存在血清型间保守的抗原表位,通过本研究进一步加深了对FMDV抗原结构的认识。     

Asia1型口蹄疫病毒3B蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

为了获得Asia1型口蹄疫病毒非结构蛋白3B的单克隆抗体,以含Asia1型FMDV/JS/05毒株3B基因的pCAGGS-3B质粒为模板,扩增3B蛋白基因,并克隆至pET-30a(+)载体,进行原核表达及纯化。分别以Asia1型口蹄疫病毒、纯化的3B蛋白为抗原,免疫4~6周龄的雌性BALB/c小鼠,经过4次免疫后,取小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞按5∶1~10∶1进行细胞融合,用本实验室建立的间接ELISA对融合后的细胞进行筛选,并进行4次有限稀释筛选出的阳性细胞扩大培养后,注射小鼠腹腔,制备腹水。对制备的腹水进行类别鉴定、反应原性和效价鉴定。结果表明,获得1株能稳定分泌抗Asia1型口蹄疫病毒3B蛋白的细胞株,其抗体类别为IgM,腹水效价为1∶12 800,通过Western-blot和间接免疫荧光试验,确定其能识别口蹄疫病毒3B蛋白。     

O型口蹄疫病毒冷变种的特性

在以前的报告中曾经指出,口蹄疫O型病毒在24℃犊牛肾细胞培养物中继代,可以促进其致弱。在24℃下培养75至90代以后,病毒致弱变种对牛和绵羊有显著的免疫原性。 通过在牛体上,对冷变种的试验证明安全有效(24℃,85～93代)。对免疫动物有0.3％的弱反应,在八个半月的观察期间,其中和抗体保持较高的水中(1:64～1:256)。但是在机体体温过低的情况下(周围环境温度为25～30℃),病毒变种反应性增高,并对未接     

口蹄疫病毒组织培养的研究——仔猪肾上皮细胞的口蹄疫O型及ZB型病毒传代

我们的研究工作是在去年的基础上继续进行的。我们将在我国所分离的O及ZB型病毒,已成功地适应在仔猪肾细胞上并能位代。两型病部能引起细胞显而稳定的病变,TCID_(50)在10~(-6.24)～10~(-7.5)之间。     

口蹄疫病毒组织培养的研究——仔猪肾上皮细胞分离培养口蹄疫O型及ZB型病毒

口蹄疫病毒曾是最早能在组织上培养的病毒之一。 近年来很多国外学者Bachrach氏,Sellers氏,Dinter氏,CeprNeeB氏,MuTeB氏等人都先后成功的在犊牛、仔猪、羔羊肾细胞组织培养上培养了口蹄疫病毒,并描述了病毒生长及引起致细胞病变情况。 国外都先后应用犊牛、仔猪肾细胞组织培养制造口蹄疫病毒疫苗,并已广泛应用于生产实践。     

口蹄疫消毒试验——福尔马林烟雾剂对O型口蹄疫病毒的消毒作用

据文献报导,福尔马林对口蹄疫病毒具有良好的杀毒能力。我们在前一报告中报导了福尔马林溶液对A型口蹄疫病毒的消毒作用。本文介绍福尔马林烟雾剂对人工污染于羊皮样品上的O型口蹄疫病毒的消毒效力试验结果。     

O型口蹄疫病毒致弱冷变种特性的研究

口蹄疫病毒同神经病毒及其它病毒均相类似,据此,很多研究者认为口蹄疫病毒在组织培养物中长期降低温度继代,其致病性将随之减弱。借助这种方法,成功地获得了口蹄疫病毒致弱变种。     

猪瘟病毒单克隆抗体的研制和应用——抗猪瘟兔化弱毒单克隆抗体的纯化

采用硫酸铵3次沉淀法和辛酸-硫酸铵法对4个IgG亚类(IgG_1,IgG_2a,IgG_2b,IgG_3)单克隆抗体腹水进行了纯化,以间接ELISA检测纯化前后样品的活性,经十二烷基硫酸钠-聚丙稀酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析纯化前后样品的纯度。结果表明,两种方法均可较为有效地去除腹水中的杂蛋白,获得用于诊断目的的单克隆抗体纯品。硫酸铵3次沉淀法适用于纯化所有IgG亚类的单克隆抗体,而辛酸-硫酸铵法不适于IgG_3亚类。     

金丝桃素的体外抗口蹄疫病毒活性

将体外培养的BHK21细胞感染FMDV后加入金丝桃素,日光灯下光活化1 h,通过细胞病变观察、MTT法、透射电子显微镜观察、H3 UR掺入试验,探讨了光活化金丝桃素对FMDV体外生长增殖的影响。结果表明,金丝桃素有明显的抑制FMDV致BHK21 细胞病变效应,能抑制FMDV的增殖,抑制率可达61.82%。透射电镜观察,金丝桃素组与病毒对照组相比,BHK21细胞的FMDV颗粒明显减少。证实,金丝桃素在体外有明显的抑制FMDV增殖的作用。     

抑制宿主脂肪酸合成关键酶活性影响O型口蹄疫病毒的复制

为探究宿主脂肪酸合成对O型口蹄疫病毒（FMDV）复制的影响,以猪肾细胞PK-15和IBRS-2细胞为模型,监测脂肪酸合成的关键酶抑制剂对FMDV复制的调控作用;通过CCK-8试剂盒检测抑制剂对细胞的毒性作用,筛选合适的抑制剂预处理浓度;用Western-blot和实时荧光定量PCR(qPCR)方法检测添加外源C75和TOFA对FMDV复制的调控作用。结果显示,和对照组相比,添加脂肪酸合成的关键酶抑制剂C75和TOFA后,口蹄疫病毒蛋白水平和转录水平均显著下调。结论,抑制宿主细胞脂肪酸合成会降低FMDV在宿主细胞中的复制效率,这为进一步深入研究FMDV的致病机制开辟了新的方向。     

抗兔出血症病毒单克隆抗体的制备

用1∶10稀释的兔出血症病毒(RHDV)加等量佐剂乳化后接种BALB/C小鼠3次,取免疫小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合。通过用间接ELISA试验筛选、克隆出分泌抗RHDV单克隆抗体的杂交瘤细胞林E_3E_6。     

口蹄疫病毒结构蛋白的二级结构及其B细胞抗原表位的预测

以口蹄疫病毒OLZ0 2株基因组序列为材料 ,采用Garnier Robson法、Chou Fasman法和Karplus Schulz法预测了其结构蛋白的二级结构 ,用Kyte Doolittle法分析了各结构蛋白的亲水性 ,Emini法预测了各结构蛋白的表面可能性 ,Jameson Wolf法预测了各蛋白的抗原指数 ,综合评价了口蹄疫病毒结构蛋白的B细胞抗原表位。结果表明 ,VP1蛋白含有的B细胞优势抗原表位最多 ,是研制口蹄疫基因工程疫苗的首选免疫原 ,但其他结构蛋白也含有少量的B细胞抗原表位 ,有的甚至有可能成为优势抗原表位     

A_5型口蹄疫病毒培养试验

获得大量抗元是口蹄疫免疫问题之一。10至15年来,一些国家利用小牛肾及猪肾作单层细胞培养。由于这种方法比较麻烦,使得许多人寻找其它的抗原来源。1960年,帕蒂(Patty)等人首次在悬浮的小牛肾细胞中培养口蹄疫病毒获得成功。意大利也采用这种方法培养病毒,并有所改进。 保加利亚兽医免疫学研究所口蹄疫防治实验室用此种方法在实验室中进行了实验。情况如下。     

表达O型口蹄疫病毒VP1中和表位的重组猪圆环病毒2型毒株的构建及其生物学特性

为构建以猪圆环病毒2型(PCV2)为载体,表达O型口蹄疫病毒(FMDV)中和表位的重组病毒,将FMDV-VP1蛋白中和抗原表位(第141～160位氨基酸)插入PCV2-ORF2编码的Cap蛋白C-末端,利用感染性克隆技术拯救出1株表达FMDV-VP1的中和抗原表位PCV2重组毒株(命名为recPCV2-CL-VP1);采用免疫过氧化物酶单层试验、捕获ELISA和免疫电镜技术鉴定该重组病毒。结果表明,在重组病毒感染细胞中检出PCV2特异性抗原及VP1表位抗原;重组病毒的形态学特征与亲本病毒相似,可采用PCR和ELISA法相鉴别;拯救毒株的繁殖能力较亲本毒差,经细胞连续传10代,体外培养增殖性能稳定。证实成功构建了1株表达FMDV-VP1中和抗原表位的PCV2重组病毒,为进一步研制基因工程疫苗奠定了基础。     

口蹄疫病毒非结构蛋白3A单克隆抗体的制备和鉴定

以原核表达并纯化的口蹄疫病毒(FMDV)非结构蛋白3A免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行融合,用间接ELISA方法筛选杂交瘤细胞,有限稀释法进行亚克隆,获得3株能稳定分泌抗3A蛋白单抗的杂交瘤细胞,分别命名为3H2、4B1、7F5,并对这3株单抗进行了生物学鉴定。结果显示,单抗3H2和4B1为IgG2a亚型,7F5为IgG2b亚型。单抗7F5针对的表位与3H2和4B1两株单抗的表位不一致;这3株单抗均能够与FMDV特异性结合,且单抗4B1与所有3A相关蛋白均反应。稳定性鉴定结果表明,获得的3株杂交瘤细胞均能稳定分泌单克隆抗体。研究结果为进一步探索3A蛋白的结构和功能以及建立诊断方法奠定了基础。     

O型口蹄疫病毒OA58株3C基因的克隆与真核表达

利用RT-PCR技术扩增获得了长度约640 bp的口蹄疫病毒目的基因,回收片段后与pMD18-T载体进行连接,测序结果表明获得了口蹄疫病毒3C基因。将重组质粒pMD18-3C与表达载体pEGFP-N1分别用BamHⅠ+XhoⅠ双酶切后,进行定向亚克隆,对重组表达质粒pEGFP-3C进行PCR、酶切鉴定及DNA测序,结果表明重组表达质粒所含的3C基因读码框正确。用pEGFP-3C转染BHK-21细胞,荧光显示目的基因EGFP发出绿色荧光;对3C转录的mRNA进行RT-PCR鉴定,证实3C基因在BHK-21细胞中得到了表达。     

抗牛T细胞表面抗原单克隆抗体的鉴定

目前具有人和小鼠淋巴细胞亚群鉴别功能的单克隆抗体(McAb)试剂已形成系列化和商品化,抗牛、马、羊、猪、兔、狗、豚鼠、大鼠和鸡等动物淋巴细胞的McAb也有报道。实践证明,McAb技术对于免疫活性细胞的分类测定、分离鉴定和表型与功能等的研究,甚至对于疾病的发病机理、诊断和治疗等的研究均具有重要价值。我国抗畜禽淋巴细胞McAb的研究起步较晚,尚未见有关的报道。为了促进我国兽医基础免疫学和临床免疫学的研究,我们进行了下述试验。(一)材料和方法1.细胞:牛胸腺细胞、外周血单个核细胞(PBM)、T细胞、B细胞和单核细胞的制备方法