小反刍兽疫病毒Nigeria75/1株F基因的克隆与原核表达

提取小反刍兽疫病毒(PPRV)疫苗株Nigeria 75/1的总RNA,用RT-PCR方法扩增F基因并克隆到pMD18-T载体中,以鉴定正确的质粒为模板克隆去掉N端信号肽和跨膜区的F基因(F-1)并亚克隆于原核表达载体pET-30a(+),得到重组质粒pET30-F-1,转化大肠杆菌BL21(DE3)进行诱导表达,表达产物进行SDS-PAGE、Western-blot分析,同时将重组蛋白免疫SPF家兔制备抗体,进行间接免疫荧光检测并用ELISA测定抗体效价.结果显示,目的基因正确插入了表达载体,在大肠杆菌中主要以包涵体形式表达,用重组蛋白免疫3次后,兔血清抗体达到较高水平,Western-blot分析说明表达产物能够与兔血清抗体发生特异性反应,间接免疫荧光试验显示重组蛋白免疫兔阳性血清能够识别PPRV Nigeria 75/1株全病毒抗原.表明,重组蛋白在原核表达系统内得到了高水平的表达,并且具有较好的反应原性.     

十二指肠贾第虫γ贾第素和δ贾第素基因疫苗的构建及其免疫保护力的评价

为了评估贾第虫γ贾第素(γ-giardin)和δ贾第素(δ-giardin)的免疫原性及免疫保护力,构建了截短型真核表达质粒pcDNA3.1-γ-giardin、pcDNA3.1-δ-giardin和pcDNA3.1-γ-δ-giardin,并将这3种质粒肌肉注射到BALB/c小鼠体内,通过血清抗体测定、脾淋巴细胞增殖试验、淋巴细胞检测、细胞因子测定和攻虫试验评价疫苗的免疫保护力。结果显示,接种了这3种真核表达质粒的小鼠产生了特异性的体液和细胞反应,与对照组相比,Ig G和Ig G2a抗体水平显著提高,并且CD3~+CD4~+CD8~-和CD3~+CD8~+CD4~-T细胞百分比显著提高, pcDNA3.1-γ-giardin和pcDNA3.1-γ-δ-giardin免疫组的细胞因子IL-4和IFN-γ水平显著提高, pcDNA3.1-δ-giardin免疫组的IFN-γ水平显著提高。攻虫试验结果显示,接种pcDNA3.1-γ-giardin、pcDNA3.1-δ-giardin和pcDNA3.1-γ-δ-giardin基因疫苗的小鼠的减虫率分别为39.1%、26.1%和18.3%,单一DNA(γ-giardin或δ-giardin)质粒和多基因DNA(γ-δ-giardin)质粒均可以诱导小鼠产生一定的免疫保护力。     

帕利亚姆病毒VP7蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备

本研究将帕利亚姆病毒(PALV)VP7蛋白的编码区序列插入原核表达质粒pET-32a(+),构建出重组质粒pET32-PALV-VP7,转化大肠杆菌Rosetta(DE3),以异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)进行重组蛋白的诱导表达。采用镍离子亲和层析进行重组蛋白的纯化,通过透析进行纯化蛋白的复性,采用Western-blot对复性后的蛋白进行鉴定。将纯化后的蛋白免疫家兔制备多克隆抗体,采用间接ELISA、Western-blot与间接免疫荧光对多克隆抗体的效价与反应原性进行分析。结果显示,在37℃与0.1 mmol/L IPTG诱导条件下,PALVVP7重组蛋白在大肠杆菌中得以高效表达,其分子质量约为43 ku,以包涵体形式存在,占菌体蛋白总量的30.4%。重组蛋白经纯化与复性处理后纯度达94.1%,Western-blot结果显示,复性后的重组蛋白可与PALV阳性血清发生特异性结合。ELISA检测结果显示,制备的家兔抗PALVVP7多克隆抗体效价可达1∶12 000。使用该多克隆抗体为一抗,可通过免疫荧光与Western-blot检测到PALV感染细胞中的VP7蛋白,表明抗体可特异性结合PALV的VP7蛋白。本研究成功在大肠杆菌中表达PALV VP7重组蛋白,并制备获得多克隆抗体,为PALV诊断试剂的开发奠定了基础。     

传染性脓疱病毒112基因的原核表达及亚细胞定位

对本实验室分离的传染性脓疱病毒(ORFV)AH-F10株的112基因进行克隆、原核表达及亚细胞定位。通过PCR方法获得其112基因,并分别构建原核表达重组质粒pET-32a-112及真核表达重组质粒pEGFP-C3-112。pET-32a-112经IPTG诱导表达,获得112蛋白并制备超免疫血清。同时将pEGFP-C3-112转染BHK21细胞,观察病毒112蛋白的亚细胞定位。结果显示,pET-32a-112在大肠杆菌中主要以包涵体形式表达,大小约为60 ku;Western-blot结果表明,重组112蛋白具有良好的反应原性;112蛋白主要定位于细胞质中。本试验为进一步研究112蛋白的功能奠定了一定的理论基础。     

可介导多药耐药的cfr基因的原核表达及多克隆抗体的制备

为建立监测Cfr蛋白的方法奠定基础,采用PCR方法扩增cfr基因,并克隆入pEasy-T载体;测序确认后克隆入pET-28a(+)载体,构建重组质粒pET-28a-cfr,然后转化入大肠杆菌BL21(DE3)中并用IPTG诱导表达Cfr蛋白;用纯化的Cfr蛋白免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,并对抗体进行鉴定。结果显示,成功克隆了全长cfr基因,构建了重组质粒pET-28a-cfr,并诱导了Cfr蛋白表达以及制备了小鼠抗Cfr蛋白的多克隆抗体;Western-blot法鉴定该抗体可特异性识别重组蛋白Cfr;ELISA法测定抗体效价为1∶64 000。结果表明,用大肠杆菌BL21(DE3)能够成功表达Cfr蛋白,并且获得了高特异性、高效价的小鼠抗Cfr蛋白的多克隆抗体。     

鸭肠炎病毒gB N端(60～110aa)抗原优势区的原核表达及抗血清的制备

以本实验室已克隆的鸭肠炎病毒(DEV)C-KCE株ul27基因序列为模板,设计特异性引物,PCR扩增获得编码鸭肠炎病毒gB N端第60~110aa的目的基因片段,大小为150bp。将目的基因亚克隆至原核表达载体pET-32a(+)中,阳性质粒被命名为pET-32a(+)-gB-1。经IPTG诱导,SDS-PAGE分析表明,重组蛋白以包涵体形式表达,大小约为27ku。用Ni-NTA柱亲和层析获得纯化的重组蛋白,鸭抗DEV阳性血清经间接ELISA检测证实其具有抗原性,并以此为免疫原免疫家兔制备抗血清,经间接ELISA检测,抗血清效价为1∶25 600。应用间接免疫荧光及Western-blot分析制备的抗血清的反应性,均证实抗血清可特异性识别DEV gB蛋白。分别以重组蛋白和DEV超离病毒为检测抗原进行间接ELISA,检测DEV免疫鸭的抗体消长规律,结果显示两者的抗体变化趋势一致。以上结果表明,制备的抗血清可作为DEV检测的候选试剂,表达的重组蛋白可作为DEV抗体检测的诊断抗原。     

维氏气单胞菌脂蛋白的原核表达及其抗血清的抗菌作用研究

为了探究维氏气单胞菌毒力因子脂蛋白的生物学功能,对脂蛋白基因进行原核表达,对表达产物进行鉴定并制备多克隆抗体研究其抗菌效应。通过PCR扩增脂蛋白基因,连接至pET-32a(+)载体,构建重组质粒pET-32a(+)-Lpp。将重组质粒pET-32a(+)-Lpp转化入感受态细胞BL21(DE3),用IPTG诱导表达。利用His标签镍离子蛋白纯化柱对表达产物进行纯化,并采用SDS-PAGE和Western-blot鉴定重组蛋白的表达产物。用纯化后的重组脂蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,多抗经皮下接种小鼠研究其抗菌效应。结果显示,经酶切鉴定和序列测定发现重组质粒pET-32a(+)-Lpp构建成功。通过SDS-PAGE检测发现,重组蛋白LPP在原核表达系统中以可溶性形式表达,分子质量约为69 ku。Western-blot结果显示,纯化后的重组蛋白LPP为单一条带。制备的多克隆抗体的效价为102 400,该多抗可提高荷菌小鼠的生存率,减少脾荷菌量。因此,本实验成功构建了重组质粒pET-32a(+)-Lpp,表达并纯化了重组蛋白LPP,制备的多抗具有抗菌作用,为该蛋白生物学功能的研究及疫苗的制备奠定了基础。     

延边白鹅IFN-α基因的原核表达及其表达产物生物学活性的研究

以本实验室构建的鹅pMD18-T-IFN-α载体为基础,利用PCR技术扩增得到鹅α干扰素(IFN-α)DNA,经BamHⅠ+SalⅠ双酶切,将其亚克隆到原核表达载体pET-30a上。将构建的重组质粒pET-30aIFN-α转化至大肠杆菌BL21(DE3)菌株,经IPTG诱导表达后,进行SDS-PAGE、Western-blot分析鉴定;用Ni柱亲和层析纯化目的蛋白,以纯化的重组蛋白作为抗原,免疫家兔制备多克隆抗体并进行鉴定。结果显示,PCR扩增出的鹅α干扰素基因全长576bp;成功构建了原核表达载体pET-30a-IFN-α并得到表达;经SDS-PAGE和Western-blot检测,该蛋白的分子质量约为29ku,以纯化后的重组蛋白为抗原免疫家兔,成功制备了多克隆抗体,血清效价为1∶32。本试验为研究鹅IFN-α的作用机理,开发有效防治鹅疾病的新型制剂奠定了基础。     

牛结节性皮肤病病毒ORF006蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备

为探究牛结节性皮肤病病毒（LSDV）ORF006蛋白的生物学功能,制备了ORF006基因的多克隆抗体,用PCR技术获得LSDV ORF006的基因片段克隆至pET-28a原核表达载体,并转化至大肠杆菌BL21(DE3)后进行IPTG诱导表达,将纯化后的蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体。结果显示,LSDV ORF006基因全长约696 bp;pET-28a-ORF006重组质粒在大肠杆菌中于37℃经1 mmol/L的IPTG诱导12 h,成功表达约28.0 ku目的蛋白;ELISA结果显示,制备的多克隆抗体效价为1∶102 400;Western-blot结果显示,制备的多克隆抗体能特异性识别ORF006蛋白;间接免疫荧光试验表明,制备的多克隆抗体能够特异性识别LSDV感染MDBK细胞表达的ORF006蛋白。本研究为进一步探究LSDV ORF006蛋白生物学功能奠定了基础。     

猪札幌病毒VP1基因的表达及ELISA抗体检测方法的建立

为了在大肠杆菌中表达猪札幌病毒VP1基因,并以纯化的重组蛋白为抗原建立猪札幌病毒血清抗体ELISA检测方法。采用RT-PCR技术扩增VP1基因,并将其克隆到pMD18-T载体中,再将所克隆的衣壳蛋白的编码序列亚克隆到表达载体pET-28a(+)中,将成功构建的原核表达质粒pETSAVCAP转化大肠杆菌Rosetta(DE3)进行诱导表达。用纯化的VP1蛋白作为抗原建立了猪札幌病毒血清抗体间接ELISA检测方法并初步用于临床样品的检测。结果显示,猪札幌病毒VP1基因可在大肠杆菌中稳定、高效地表达,Western-blot分析表明该重组蛋白具有良好的反应原性。经对反应条件进行优化,确定间接ELISA的抗原最佳包被浓度为0.5μg/mL,且不与其他常见猪病的阳性血清发生交叉反应,建立的ELISA方法具有较好的敏感性、特异性和重复性。通过对从多个省份收集的490份猪血清样品进行检测,阳性率为65.31%。表明,以大肠杆菌表达的猪札幌病毒VP1重组蛋白为抗原建立的间接ELISA方法可以用于猪札幌病毒抗体的检测。     

肌旋毛虫谷氨酰胺酶基因的原核表达及其免疫荧光定位研究

采用RT-PCR方法从旋毛虫肌幼虫中扩增出谷氨酰胺酶(TsGls)基因全长序列,将其克隆到表达载体pET-32a(+)中,测序验证后转化到表达宿主菌Rosetta(DE3)pLysS中,用IPTG诱导表达重组蛋白TsGls。以纯化的TsGls蛋白免疫家兔制备多克隆抗体,并对旋毛虫肌幼虫中的TsGls进行免疫荧光定位。结果显示,成功构建了重组质粒pET-32a(+)-TsGls;经SDS-PAGE分析,重组TsGls蛋白的分子质量约为72 ku;制备的多克隆抗体效价可达1.024×10~6;Western-blot分析结果显示,多克隆抗体与重组TsGls具有较强反应性;免疫荧光定位显示,TsGls蛋白存在于旋毛虫肌幼虫皮下组织。上述研究结果为进一步研究旋毛虫谷氨酸依赖型抗酸机制奠定了基础。     

猪细胞因子信号传导抑制因子1蛋白的表达纯化与多克隆抗体制备

为制备猪细胞因子信号传导抑制因子1(SOCS1)的多克隆抗体,采用RT-PCR扩增猪SOCS1基因序列,将其克隆至原核表达载体pET-28a(+),构建重组表达载体pET28a-pSOCS1,并转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,在不同温度、IPTG浓度、诱导时间等条件下进行表达,确定最佳表达条件,并对重组蛋白pSOCS1进行纯化。以表达的重组蛋白pSOCS1免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,经4次免疫,间接ELISA测得抗体效价达到1∶51 200。Western-blot和间接免疫荧光试验结果表明,该多克隆抗体可与pSOCS1重组蛋白和经HEK293T细胞过表达的pSOCS1蛋白发生特异性反应,证明pSOCS1重组蛋白免疫原性良好。本研究为后续制备单克隆抗体、研究猪SOCS1相关作用机制奠定了基础。     

大肠杆菌多重耐药调控基因rob的原核表达及其表达蛋白多克隆抗体的制备

提取阳性克隆质粒pMD18-T-rob,经SacⅠ+XhoⅠ双酶切,回收目的片段,定向克隆到pET-28a(+)原核表达载体中,提取阳性质粒,转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,获得阳性克隆。经IPTG诱导阳性菌,收集表达产物,SDS-PAGE分析证实pET-28a-rob可成功地在大肠杆菌中表达出Rob蛋白。Western-blot分析证明,Rob蛋白具有良好的反应原性。表达出的Rob蛋白经侧带法纯化后免疫獭兔3次,制备抗Rob蛋白的多克隆抗体。通过间接ELISA方法检测抗体效价,结果表明抗体血清1∶40稀释时抗体效价较高。     

水牛匈爱病毒结构蛋白VP1的截短表达及多克隆抗体的制备

为了制备水牛匈爱病毒（BufHuV）结构蛋白VP1截短基因的多克隆抗体,将病毒的VP1截短基因克隆至原核表达载体pET-32a（+）获得重组质粒pET-32a-BufHuV-VP1,重组质粒转化至BL21感受态细胞（DE3）后诱导表达,VP1截短蛋白的分子质量约为31.5 ku,主要以包涵体的形式表达。以纯化好的重组蛋白免疫昆明小鼠以制备多克隆抗体,通过Western-blot与IFA鉴定其特异性。结果显示,制备的小鼠多克隆抗体能与纯化的VP1重组截短蛋白和感染BufHuV的细胞表达的VP1特异性结合,表明多克隆抗体具有良好的反应原性和特异性。水牛匈爱病毒VP1截短重组蛋白及其多克隆抗体的成功制备为研究BufHuV致病机制、VP1蛋白功能以及血清学检测方法的建立提供了材料基础。     

羊种布氏杆菌M5-90 DnaK的原核表达及免疫保护性研究

为对布氏杆菌DnaK基因的原核表达情况及免疫保护性进行分析,根据Gen Bank中公布的羊种布氏杆菌M5-90的DnaK基因序列,设计引物,合成DnaK基因片段,将其连接到p UC57载体测序;将DnaK基因克隆至原核表达载体pET-28a,转化入大肠杆菌DE3感受态细胞中诱导表达;用SDS-PAGE凝胶电泳对DnaK融合蛋白进行分析;利用AKTAxpress智能多维纯化系统进行纯化;用Western-blot分析其反应原性。将DnaK融合蛋白免疫小鼠,利用ELISA试剂盒检测小鼠血清中IgG和IFN-γ水平。结果显示,获得pET-28a-DnaK重组表达质粒,大约在69.8 ku处出现DnaK融合蛋白条带;纯化后条带单一;DnaK具有较好的反应原性;DnaK融合蛋白可诱导小鼠血清产生抗体IgG和细胞因子IFN-γ。结果表明,DnaK融合蛋白可作为候选亚单位疫苗。     

产气荚膜梭菌EF-Tu基因的原核表达及其多克隆抗体的制备

通过PCR方法扩增产气荚膜梭菌ATCC13124株EF-Tu基因,利用原核表达载体pGEX-6P-1构建重组质粒pGEX-EF,经双酶切和测序鉴定正确后转化E.coli Rosseta,进行IPTG诱导表达,表达产物纯化后免疫大白兔制备多克隆抗体,应用间接ELISA、Western-blot和间接免疫荧光方法对所得抗体进行检测。结果显示,经1.0mmol/L IPTG诱导5h后蛋白表达量最高,并且主要以包涵体的形式存在,分子质量为69ku。间接ELISA方法检测的多抗血清效价为1∶262 144。Western-blot结果证实,重组蛋白与产气荚膜梭菌ATCC13124株制备的多克隆抗体发生特异性结合,具有良好的免疫原性。Western-blot和间接免疫荧光结果表明,多抗血清能分别与pGEX-EF重组蛋白、ATCC13124菌体裂解液、pcDNA3.1-EF-Tu瞬时转染后的BHK-21细胞及ATCC13124感染的小鼠肠组织中菌体发生特异性结合反应。上述结果表明,此多克隆抗体能够应用于临床诊断。     

尼帕病毒截短G蛋白的原核表达及间接ELISA检测方法的建立

以截短的尼帕病毒（NiV）G基因原核表达产物为抗原建立检测尼帕病毒抗体的间接ELISA检测方法。对编码尼帕病毒G蛋白基因的部分序列进行扩增,将扩增获得的目的片段克隆至原核表达载体pET-30a（+）,并转化至大肠杆菌BL21(DE3)。菌落PCR鉴定后,在最佳诱导条件下表达目的蛋白。用Ni-NTA柱纯化截短的G蛋白,并进行SDS-PAGE和Western-blot鉴定。以纯化的蛋白为抗原建立尼帕病毒抗体间接ELISA检测方法,并对该方法的特异性、灵敏性、稳定性进行验证。结果显示：成功构建重组质粒pET-30a(+)-NiV-G;表达的尼帕病毒截短G蛋白分子质量为50 ku,与预期值相符;截短的G蛋白能被His-tag抗体、抗尼帕病毒G蛋白粗提IgG识别。以该蛋白为包被抗原建立的间接ELISA检测方法检测已知阳性血清尼帕病毒抗体效价为1︰20 480,裂谷热病毒、西尼罗病毒及克里米亚-刚果出血热病毒阳性马血清的检测结果均为阴性,且该方法批内、批间试验变异系数均小于10%。结果表明,成功构建了重组质粒pET-30a(+)-NiV-G,并诱导表达尼帕病毒截短G蛋白。以该蛋白建立的尼帕病毒抗体...     

牛疱疹病毒Ⅰ型gB基因的原核表达及间接ELISA检测方法的建立

采用PCR方法从牛疱疹病毒Ⅰ型(BHV-1)Bartha Nu/67株扩增出完整的gB基因编码区,将其克隆到pGEM-T Easy载体。根据抗原性将gB基因分成3段,分别克隆到原核表达载体pET-32a中,构建了重组质粒,将其转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析。结果显示,目的蛋白均获得了高效表达,均以包涵体形式存在,纯化后目的蛋白的纯度在90%以上。Western-blot和ELISA分析表明,重组蛋白pET-gBⅢ的反应原性最好。以纯化的pET-gBⅢ为诊断抗原包被酶标板,建立了检测BHV-1抗体的间接ELISA方法。用该间接ELISA与法国IDEXX公司的IBR抗体检测试剂盒对临床样品进行平行检测,结果二者的总符合率为93.8%。表明建立的gBⅢELISA检测方法具有很好的特异性和敏感性。     

猪流行性腹泻病毒COE基因的原核表达及其表达产物的生物活性分析

为了获得猪流行性腹泻病毒(PEDV)COE基因在原核表达载体pET-32a(+)中的表达产物,并检测表达产物的生物活性,根据猪流行性腹泻病毒COE基因的全序列设计引物,以pCMV-PEDVCOE质粒作为模板,通过PCR扩增得到COE基因编码区的序列,将其克隆至含有6×His tag的原核表达载体pET-32a(+)中进行诱导表达。表达产物经SDS-PAGE分析和Western-blot鉴定,并用Ni-NTA亲和层析柱纯化,以此纯化产物为包被抗原建立了ELISA检测方法,并用该方法对39份感染PEDV猪血清进行了检测。结果显示,COE基因在大肠杆菌中经IPTG诱导表达,获得与预期分子质量相符的融合蛋白条带。经Western-blot检测,该蛋白能与Anti-PEDV单克隆抗体发生特异性反应。该融合蛋白纯化、复性后的质量浓度为0.7mg/mL。采用以融合COE蛋白为包被抗原建立的ELISA对39份PEDV感染猪血清的检测结果都为阳性,说明该融合蛋白具备作为包被抗原建立ELISA抗体检测方法的潜力。     

西尼罗病毒E蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备

利用PCR技术扩增西尼罗病毒(WNV)E蛋白基因并将其插入原核表达载体pET-30a(+),构建重组质粒pET-30a(+)-WNV-E,并转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,经IPTG诱导目的蛋白表达,对诱导条件进行优化,利用His镍柱亲和层析法纯化目的蛋白,纯化后的蛋白经SDS-PAGE与Westernblot鉴定正确后,免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体并进行间接免疫荧光鉴定。结果显示:WNV E蛋白在大肠杆菌中以包涵体形式被成功表达,蛋白最佳诱导条件为37℃,0.8 mmol/L IPTG诱导5 h,经间接免疫荧光鉴定多克隆抗体能特异性识别WNV E蛋白。本研究成功表达并纯化了WNV E蛋白,证明该蛋白具有良好的免疫原性,为WNV抗原、抗体检测方法的建立和新型疫苗的研发及相关研究奠定了基础。