快速检测犬瘟热病毒的实时荧光RPA方法的建立

针对犬瘟热病毒(canine distemper virus,CDV)基因保守序列,设计特异性引物和荧光探针,并进行了敏感性和特异性试验,建立了CDV实时重组聚合酶等温扩增(real-time recombinase polymerase amplification,real-time RPA)检测方法。结果表明,该实时荧光RPA方法在39℃恒温反应25 min能特异性扩增目的基因,与其他犬病毒以及CDV同属的麻疹病毒均未出现交叉反应;该检测方法具有与RT-PCR一致的敏感性;通过对CDV阳性犬的组织样品、体表样品和不同时期分离鉴定的临床样本的检测,证实建立的实时荧光RPA方法具有良好的稳定性和可靠性。与现有的核酸检测方法相比,该实时荧光RPA检测方法在核酸上样25 min内即可判读结果,可满足CDV快速检疫的需要。     

猪瘟兔化弱毒疫苗RT-LAMP检测方法的建立

根据GenBank中登录的猪瘟病毒(CSFV)野毒株、猪瘟兔化弱毒疫苗(HCLV)和牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的NS5B基因序列,利用在线软件Pri mer Explorer V4Software,设计了一套环介导逆转录等温核酸扩增(RT-LAMP)引物,建立了特异性检测HCLV的RT-LAMP方法。在BstDNA聚合酶作用下,65℃恒温反应1h即可完成扩增过程,扩增产物可通过20g/L琼脂糖凝胶电泳或加入SYBR GreenⅠ染料进行分析。经检测,该方法对于CSFV、BVDV以及其他猪源病毒无特异性扩增,具有良好的HCLV特异性;其灵敏度与本实验室建立的TaqMan实时荧光定量RT-PCR检测结果一致,均达到5个拷贝。分别用这两种方法对58份市售猪瘟弱毒疫苗进行检测,结果符合率达100%。表明,建立的HCLV RT-LAMP技术可以应用于基层实验室或养殖场,便于养殖户对疫苗中的弱毒含量进行监测。     

犬细小病毒实时荧光环介导等温扩增检测方法的建立

参照GenBank中犬细小病毒(CPV)VP2基因保守区域序列设计合成特殊的内、外引物,在扩增反应体系中加入荧光染料SYBR GreenⅠ,通过恒温荧光检测仪Deaou-308C扩增检测,建立了一种快速检测CPV的实时荧光环介导等温扩增(LAMP)方法。结果显示,这种方法对CPV具有特异性的扩增反应,对照病毒核酸的扩增结果均为阴性。灵敏度试验最低可检出3.72 copies/μL的病毒核酸。重复性试验结果表明,其检测重复性良好。对30份临床宠物犬的粪便样品进行检测,与免疫胶体金检测试纸方法进行比较,符合率为90%。将本方法初步应用于大熊猫粪便中犬细小病毒的检测,结果表明,从大熊猫基地采集的84份粪便样品中有16份为细小病毒阳性,阳性率为19.0%。本方法在63℃下恒温45 min可以完成检测,操作简单、灵敏度高、特异性强,通过恒温实时荧光检测仪可实时检测及自动判读检测结果,对大熊猫的早期诊断非常重要。     

塞内卡谷病毒荧光RT-RPA快速检测方法的建立

本研究利用重组酶聚合酶扩增(RPA)技术建立快速检测塞内卡谷病毒(SVV)的实时荧光RT-RPA方法。试验结果表明,该方法特异性强,能准确检测SVV核酸,与水泡性口炎病毒(VSV-IND和VSV-NJ)、猪水泡病病毒(SVDV)、口蹄疫病毒(FMDV)、猪瘟病毒(CSFV)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)等灭活抗原核酸无交叉反应;灵敏度高,本试验中最低可检测SVV核酸浓度为1.35×10~(-3)g/mL;简便快速,反应时间小于20 min;重复性好。利用所建立方法对116份临床样品进行检测,结果与实时荧光RT-PCR一致。本研究为SVV防控提供了一种快速检测的新方法,可用于基层实验室对SVV的快速检测。     

非洲猪瘟病毒免提取核酸荧光定量PCR检测方法的建立

根据非洲猪瘟病毒(ASFV)保守的VP72基因序列,设计特异性引物和探针,经过优化反应体系中各组分及反应条件,建立了直接检测样品中ASFV的荧光定量PCR方法,并分析该方法的特异性和敏感性。结果显示,该直扩荧光定量PCR方法只对ASFV有特异性扩增,对其他几种相似疾病病原的灭活抗原,如猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒、猪圆环病毒、口蹄疫病毒、印第安纳型水泡性口炎病毒、新泽西型水泡性口炎病毒、猪流行性腹泻病毒等检测均呈阴性。敏感性试验结果显示,对10倍梯度稀释的非洲猪瘟病毒灭活抗原的检测敏感性可达1×10~(-6),与OIE推荐的传统的荧光PCR的检测敏感性相当。3个ASFV稀释度样品的组内和组间重复的变异系数均小于5%。该方法无须提取核酸,可在60 min内完成对样品的检测,检测快速、灵敏,结果准确,结合便携式荧光PCR仪,为野外或现场的非洲猪瘟病毒快速检测提供了一种切实可行的方法。     

犬副流感病毒实时荧光RPA检测方法的建立

为快速监控犬猫科动物中犬副流感病毒(CPIV)的感染情况,本研究针对CPIV核衣壳蛋白基因的保守序列,设计特异性引物和荧光探针,建立了CPIV实时荧光重组酶聚合酶等温扩增方法(real-time RPA)。结果表明,该方法具有良好的特异性,与其他犬病毒和同属的副黏病毒均未出现交叉反应;其敏感性与RT-PCR方法相近;将该方法应用于CPIV感染犬的临床组织样本、体表样本的检测,证实该实时荧光RPA方法具有良好的稳定性和可靠性。与现有的核酸检测方法相比,该实时荧光RPA方法检测周期仅30min即可完成结果判读,满足了犬猫科动物CPIV快速检测的需要。     

猪瘟病毒RT-LAMP检测方法的建立

利用逆转录环介导等温核酸扩增技术(RT-LAMP),建立了猪瘟病毒快速检测方法,同时评价了该方法的灵敏性和特异性。结果,根据猪瘟病毒5′端非编码区的一段保守序列设计的LAMP引物能够在65℃下1h内实现目标核酸区段的大量扩增,检测结果可直接用肉眼判断。结果表明,该检测体系具有极高的特异性,只能检测到目标病毒,与其他类似病毒如猪繁殖与呼吸综合征病毒、伪狂犬病病毒、传染性胃肠炎病毒、猪细小病毒和猪圆环病毒2型的核酸等无交叉反应,可检测到1×10-3稀释度的目标病毒核酸量,比普通RT-PCR的灵敏性高10倍。     

猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒双重RT-LAMP检测方法的建立与应用

根据GenBank中猪瘟病毒(CSFV)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的保守序列各设计一套LAMP引物,在同一体系中进行RT-LAMP扩增,通过对体系内引物浓度及反应温度等进行优化,建立了可在63℃恒温下对CSFV和PRRSV进行同步检测的LAMP方法,并进行了敏感性和特异性试验。结果显示,该方法的灵敏度与荧光定量RT-PCR相当,与常规RT-PCR相比高10倍;用该方法对猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、猪轮状病毒、伪狂犬病病毒、猪圆环病毒2型进行RT-LAMP扩增,均未发生交叉反应。用该法对采自天津市4个猪场的52份临床样品进行检测,与荧光定量RT-PCR检测结果的符合率为100%。结果表明,该方法具有良好的敏感性和特异性,可实现两病原的同步快速检测,是临床疫病初筛技术的强有力候选。     

非洲猪瘟病毒LFD-RPA快速检测方法的建立

本研究根据非洲猪瘟病毒(ASFV)B646L基因保守序列设计nfo RPA特异性引物和探针,建立了ASFV核酸LFD-RPA快速检测法。结果表明,该方法特异性强,与猪圆环病毒2型(PCV2)、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、口蹄疫病毒(FMDV)、猪A型塞内卡病毒(SVA)等病原核酸无交叉反应;最低可以检测到1.57×10~2copies/μL重组质粒pUC-B646L;检测时间短,其中RPA扩增20 min,LFD检测10～20 min。应用该法及OIE推荐的荧光PCR法对24个模拟样品进行检测,检测结果一致。对50份已知的临床样品核酸进行检测,阳性符合率为73.3%。上述结果表明,本研究建立的LFD-RPA快速检测方法操作简便,为ASFV现场快速检测提供了技术支持。     

非洲猪瘟病毒荧光RPA快速检测方法的建立及初步应用

本研究根据非洲猪瘟病毒(ASFV)基因组中序列保守稳定的B646L基因设计特异性引物和探针,建立了敏感、特异、高效的ASFV核酸RPA快速检测法。结果显示,该方法特异性强,能准确检测ASFV核酸,与猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征(PRRSV)、猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2)、口蹄疫病毒(FMDV)、猪A型塞内卡病毒(SVA)等灭活病毒核酸无交叉反应;敏感性高,本试验中最低可检测到2×101copies/uL;检测时间短,15 min即可完成反应;重复性好。采用ASFV灭活抗原和猪血液制备模拟临床猪血样品,能检出灭活抗原的稀释度为1∶12 800,应用该方法对200份进口冻猪产品及供港猪场420份猪抗凝血进行检测,结果均为阴性,与OIE推荐的实时荧光PCR法检测结果相同。本研究建立的RPA快速检测法操作简便,尤其适合ASFV现场快速检测。     

猪环曲病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立与应用

根据GenBank中猪环曲病毒(porcine torovirus,PToV)N基因的保守序列,设计合成1对针对PToV的特异性引物,建立了基于SYBR GreenⅡ检测PToV的实时荧光定量RT-PCR方法。结果显示,该方法能很好地将PToV与猪伪狂犬病病毒、猪嵴病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、A群猪轮状病毒、猪瘟病毒、沙门菌和大肠杆菌区分开来,特异性强。检测PToV的N基因在8.65×101~8.65×108拷贝/μL范围内有很好的线性关系,其扩增相关系数为0.998 9,扩增产物的熔解曲线分析只有1个单特异峰。所建立的实时荧光定量RT-PCR方法组内变异系数为0.29%~1.30%,组间变异系数为0.45%~1.80%,重复性较好。利用该方法对采集自四川部分地区的43份临床样品进行检测,实时荧光定量RTPCR检出13份阳性样品,与常规PCR检测方法的阳性符合率为100%。结果表明建立的实时荧光定量RT-PCR方法特异性较强、灵敏度高,可用于该病的临床检测和流行病学调查。     

猪萨佩罗病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立与应用

为建立猪萨佩罗病毒(PSV)的检测方法,根据GenBank中PSV的5′端非编码区基因的保守序列设计并合成1对针对PSV的特异性引物,建立了基于SYBR GreenⅡ检测PSV的实时荧光定量RT-PCR方法。结果显示,该方法能很好地将PSV与猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪嵴病毒、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、A群猪轮状病毒区分开,特异性强。检测下限为6.37×102 copies/μL,比普通PCR敏感100倍,敏感性高。扩增产物的熔解曲线分析只有1个单特异峰。所建立的实时荧光定量RTPCR的批内变异系数为0.44%~1.14%,批间变异系数为0.70%~1.32%,重复性较好。应用该方法对采集自四川省部分地区的58份有腹泻症状的猪粪便进行检测,实时荧光定量RT-PCR检测阳性率为56.9%,与常规PCR检测方法的阳性符合率为100%。结果表明,本研究建立的实时荧光定量RT-PCR特异性较强、灵敏度高,可用于该病毒的临床检测、定量分析及流行病学调查。     

犬细小病毒的新型原液荧光定量PCR方法的建立

为建立一种不提取病毒DNA,直接采用样本上清液检测犬细小病毒(CPV)的TaqMan荧光定量PCR方法,通过扩增CPV NS基因部分片段构建重组质粒,建立TaqMan荧光定量PCR方法;对建立的方法进行反应条件、特异性、敏感性的检测;通过建立的方法对核酸荧光定量PCR和原液荧光定量PCR进行对比;最后对临床中疑似的CPV病例进行检测。结果显示,建立的方法特异性好,对犬常见病毒无扩增。该方法检测的灵敏度达101copies/L,该方法的批内变异系数为0.09%~1.30%,批间变异系数为0.57%~0.94%,重复性良好。核酸荧光定量PCR和原液荧光定量PCR的最低检测浓度均可以达到101 copies/L,且原液荧光定量PCR的产物浓度约为核酸荧光定量PCR的7倍,提示核酸在提取过程中有大量的损耗。对187份临床病料进行检测,建立的方法共检出128份阳性,与普通PCR和胶体金快速检测板的阳性符合率均为100%,核酸法与原液法的符合率为100%。因此,本试验建立的CPV病料原液TaqMan荧光定量PCR方法与普通PCR和胶体金快速检测板相比,具有阳性检出率更高、准确率更好的特点。     

非洲猪瘟病毒实时荧光RAA检测方法的建立

为了建立非洲猪瘟病毒(ASFV)简捷、高效的基层临床检测方法,本研究选取非洲猪瘟病毒保守基因B646L (P72)序列,设计特异性引物和探针,建立非洲猪瘟病毒实时荧光重组酶介导等温扩增(RAA)检测方法。结果显示,所建立方法与OIE推荐的荧光定量PCR方法灵敏度相当,低至10 copies,μL,检测时长仅需10 min,与口蹄疫病毒(FMDV)、猪细小病毒(PPV)、伪狂犬病病毒(PRV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)均无交叉反应。对100份临床样品的检测结果与OIE推荐的荧光定量PCR结果一致,但相较于荧光定量PCR检测时间的2h,检测时间大大缩短。结果表明,本研究建立的方法灵敏度较高、特异性较好,为ASFV早期临床诊断提供了技术支持。     

牛传染性鼻气管炎病毒SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立

为了检测牛传染性鼻气管炎病毒,本研究建立了牛传染性鼻气管炎病毒SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法。通过设计特异性引物扩增病毒基因,将扩增的目的片段(119 bp)连接到pMD19-T载体中,构建重组质粒。将重组质粒作为阳性标准品,用于SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法的建立。结果显示,特异性引物扩增的目的片段约为119 bp,符合预期的大小,经测序鉴定所扩增的目的片段正确。敏感性结果显示,用该方法检测阳性质粒标准品的最低限度为3.04 X101 copies/mL,是Nano-PCR的10倍。将牛病毒性腹泻病毒、牛呼吸道合胞体病毒、牛副流感病毒3型与牛传染性鼻气管炎病毒进行特异性检测。结果显示,只有牛传染性鼻气管炎病毒被检测到,其他病毒均未有特异性的扩增曲线,表明该方法的特异性良好。批内和批间重复变异系数均小于1%,显示该方法具有良好的重复性。用建立的方法对20份疑似IBRV的临床样品进行检测,并与Nano-PCR检测方法进行对比,结果显示本方法的阳性样晶率高于Nano-PCR检测方法。本研究建立的牛传染性鼻气管炎病毒SYBR Green I实时荧光定量PCR方法特异性好、灵敏度高、重复性好,可用于牛传染性鼻气管炎病毒的检测。     

猪圆环病毒3型RAA检测方法的建立及初步应用

为建立猪圆环病毒3型(PCV3)的快速简便检测方法,根据PCV3 Cap基因的保守序列设计多对引物和探针,建立了一种实时荧光RAA检测方法。通过筛选引物和优化试验条件,验证对常见动物疾病病毒的特异性,并与PCR方法在敏感性上进行比较。结果表明,PCV3与猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪A型塞内卡病毒(SVA)和口蹄疫病毒(FMDV)等核酸无交叉反应,可在39℃下20 min内快速特异完成。该方法灵敏度较高,最低检出浓度为10~2copies/μL。应用该方法对115份猪临床样品进行检测,检测结果与PCR方法一致。结果表明,该方法操作简单、快速灵敏、结果可靠,可用于PCV3的实验室检测和现场诊断。     

猪瘟病毒荧光RT-PCR快速检测方法的建立

以猪瘟病毒5′端非编码区为靶核酸序列设计引物和探针,建立了一步法荧光RT-PCR检测猪瘟病毒。荧光RT-PCR仅检测出猪瘟C株、T株,未能检测出牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、猪呼吸系统冠状病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪细小病毒、伪狂犬病病毒、猪生殖与呼吸综合征病毒、PK-15细胞和牛睾丸原代细胞;对猪瘟病毒T株的扩增反应产物进行了测序分析,与预期序列相符。荧光RT-PCR的检测极限可达到1 TCID50/mL,整个试验流程只需2 h。采用荧光RT-PCR和抗原捕获ELISA同时检测临床病料、猪副产品共207份样本,两种方法的检出率分别为17.4%和13.5%,两者符合率为95.7%(198/207);荧光RT-PCR的检出率高于ELISA,两者差异显著。结果表明,建立的荧光RT-PCR可用于猪产品、临床病料中猪瘟病毒的快速检测。     

水泡性口炎病毒双重荧光RT-PCR鉴别检测方法的建立

为建立水泡性口炎病毒印第安纳型(VSV-IND)和新泽西型(VSV-NJ)的快速鉴别检测方法,本研究根据水泡性口炎病毒2种血清型相对保守的L基因为靶序列,分别设计2对型特异性引物和2条不同荧光基团修饰的探针。经过对反应体系的优化,建立了能够同时检测VSV-IND和VSV-NJ的双重荧光RTPCR方法。该方法能准确鉴别VSV两种血清型,与口蹄疫病毒(FMDV)、蓝舌病病毒(BTV)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、猪水泡病病毒(SVDV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)等灭活抗原核酸无非特异性扩增,特异性强。与普通RT-PCR相比,反应快速、灵敏度高。Ct值的变异系数小于3%,重复性好。利用所建立方法对126份临床样品进行检测,结果与普通RT-PCR相同。上述结果表明,本研究建立的方法为VSV-IND和VSV-NJ的同时鉴别检测提供了一种快速、特异和敏感的方法。     

猪圆环病毒1型real-time PCR检测方法的建立

为了建立一种定量检测猪圆环病毒1型(PCV1)的实时荧光定量PCR方法,根据PCV1基因序列设计了1对特异性引物,并构建含有PCV1基因片段的重组质粒,以系列稀释后的重组质粒作为模板建立了定量检测PCV1的SYBR GreenⅠreal-time PCR方法,并绘制标准曲线,进行特异性、敏感性和重复性试验。结果显示,该方法的标准曲线的决定系数为0.999,显示出优良的线性关系;最低可准确检测320copies/μL的核酸模板,重复性试验的变异系数小于2%;该方法对PCV2、猪细小病毒、伪狂犬病病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒及猪瘟病毒等的检测结果均为阴性;对临床样品的检出率高于常规PCR方法。结果表明,建立的real-time PCR特异性强、灵敏度高、重复性好,可用于PCV1的检测与定量分析。