变异猪伪狂犬病病毒自然感染仔猪的病理组织学研究

为了解伪狂犬病病毒(PRV)变异株对自然感染仔猪的组织病理损伤,对自然感染发病仔猪进行病理剖检、细菌分离、病毒PCR鉴定、病毒分离培养、病毒粒子观察、基因序列分析及病理组织学观察,证实该发病仔猪为典型的PRV病毒变异株感染发病。病理剖检和病理组织学检查结果显示,发病仔猪脑、心脏、肝、脾、肺、肾等主要器官组织可见典型的猪伪狂犬病剖检病变和病理组织学变化。脑实质中小血管扩张充血,大量胶质细胞浸润,形成明显的血管套和噬神经元现象;肝索紊乱、肝细胞坏死;全身免疫器官淋巴细胞减少等。同时发现PRV在发病仔猪全身分布广泛,且组织中病原含量与组织病理损伤程度密切相关。结果表明,自然发病仔猪感染的PRV变异毒株属于强毒株,具有较强的致病性。     

猪伪狂犬病病毒JSZ株的分离鉴定及其病毒核酸的分布规律

用猪伪狂犬病病毒(PRV)特异性引物对江苏省某猪场疑似猪伪狂犬病的病死仔猪组织病料进行了PCR鉴定,结果可扩增到特异性的条带.用该病料接种PK-15细胞,24 h即出现细胞病变,PCR和间接免疫荧光试验结果均证明所分离病毒为PRV.用该PRV分离株接种兔后出现奇痒症状并麻痹致死;接种仔猪后出现持续发热,肌肉震颤等症状.通过对自然感染PRV病死仔猪脏器进行PCR检测,发现PRV在仔猪体内广泛分布,其中以脾的检出率最高,可达100%;对人工感染猪的直肠和鼻腔棉拭样品进行PCR检测,发现病猪排毒最长可达13 d.证实,该分离株为猪伪狂犬病强毒株,脾为病毒检测的首选靶器官.     

伪狂犬病病毒HNX株增殖特性及其致病性的研究

将伪狂犬病病毒(PRV)HNX株和经典Ea株分别接种PK-15和Vero细胞,观察细胞病变情况,用TCID50法检测HNX株的病毒效价并绘制一步生长曲线。将15头50日龄的PRV阴性仔猪随机平均分为3组,其中2组分别滴鼻接种1mL 107 TCID50的HNX株和Ea株病毒,第3组滴鼻接种1mL DMEM培养液作为空白对照。结果显示,HNX株和Ea株在这2种细胞中产生的CPE差异明显。病毒一步生长曲线显示,HNX株早期增殖速度明显比Ea株快。动物试验结果显示,接种HNX株的试验猪临床症状典型,体温和排毒量明显高于Ea株组,HNX株的致死率为60%(3/5),Ea株的致死率为0。HNX株造成的病理损伤比Ea株严重。结果表明,HNX株能快速适应宿主细胞,相关增殖特性发生明显改变,并且对仔猪的致病性明显增强。     

伪狂犬病病毒主要毒力基因对其致细胞病变能力的影响

以伪狂犬病病毒(PRV)Fa株为对照,时PRV Fa株TK基因缺失株、PRV Fa株gI/gE双基因缺失株和PRV Fa株TK/gI/gE三基因缺失株进行了细胞培养特性的观察.包括对照毒株在内的4个毒株均按0.5 mL(1×10~6PFU)接种量分别感染IBRS-2、Marc-145、ST、Vero和MDBK等细胞系;选择在接种后第0、8、12、24、36和48 h观察感染细胞的形态学变化.结果显示,这4个毒株在这5种细胞上均能增殖并引起细胞病变,但PRV基因缺失株引起的病变程度均不及Fa株.表明,PRV的不同毒力基因对其致细胞病变能力不同.     

猪生殖与呼吸综合征病理损害与免疫抑制观察

对自然感染猪在进行流行病学调查、血清学检测和病原鉴定后,将确定为生殖-呼吸综合征(PRRS)病猪38头进行病理解剖,观察其病变组织和器官的剖检变化以及在普通光镜、电镜下的病理变化,并对病猪外周血淋巴细胞进行计数;同时设8头健康猪进行对照.观察发现,病猪的免疫器官和细胞系统地遭受了严重的损伤,其中淋巴结、脾表现出坏死性炎症变化;血管内皮细胞肿胀、增生或坏死、脱落;病猪外周血淋巴细胞较健康猪明显减少(P＜0.05),且多出现变性和坏死.提示PRRS可引起明显的免疫抑制.     

猪源伪狂犬病病毒福建龙岩分离株的鉴定及其TK基因和gE基因的分子特征

从福建省某规模化猪场疑似猪伪狂犬病发病仔猪的脑组织中分离到1株病毒,通过病理剖检、PCR鉴定、病毒分离培养等方法证实该病毒为伪狂犬病病毒(PRV)野毒株,并命名为Fujian-LY株。对其主要毒力基因TK和gE的分子特征和遗传进化关系进行分析,结果表明,Fujian-LY株TK基因与参考序列的核苷酸和氨基酸序列的同源性分别为98.5%~99.8%和98.1%~99.4%;gE基因核苷酸和氨基酸序列的同源性分别为97.6%~99.8%和95.5%~99.3%。氨基酸多序列比对发现,Fujian-LY株TK基因在2个位点发生了独特性的氨基酸突变,即第16位氨基酸由K→R和第129位氨基酸由S→G。其中,第16位氨基酸突变导致TK蛋白ATP结合结构域由-G**G*GK-转变为-G**G*GR-。gE氨基酸序列最具特征性的变化是第48位和第496位各有1个天冬氨酸(D)的插入,该插入特征为PRV变异毒株的重要标志。遗传进化树分析结果表明,Fujian-LY株与2012年以来国内不同省份分离的PRV变异株的亲缘关系较近,属于近年来流行的PRV变异毒株,而与PRV经典株的亲缘关系相对较远。     

猪瘟流行毒株的致病性研究

以3株猪瘟流行野毒(GSLT、GSLX、NXYC)人工感染健康猪,对其致病性进行了比较研究.结果表明,NXYC、GSLX、GSLT为中等毒力的毒株,均具有致病性,可引起亚急性型或慢性型猪瘟;3株猪瘟流行毒可引起猪组织和器官发生病变,其中脑(小脑、大脑)、免疫器官(脾、淋巴结、扁桃体)和肾为其主要靶器官;3株野毒所致病理组织学变化的特征是小脑与大脑的非化脓性脑膜脑炎,增生性肾小球肾炎,免疫器官出现增生与坏死,小血管内皮增生,多种组织器官有淋巴细胞和嗜酸性白细胞浸润.     

PRRSV间接免疫荧光检测法的建立和应用

以猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV) ATCC VR 2332 株人工单独感染3 头3 周龄仔猪,并用PRRSV ATCC VR 2332株和猪圆环病毒2型(PCV2)联合感染2 头3 周龄仔猪,每日检查试验猪体温、采食情况及临床表现,并用HerdChek IDEXX 试剂盒测其血清抗体。PRRSV PCV2联合感染猪分别在感染后1、3周剖杀,PRRSV单独感染猪和健康对照猪分别在感染后1、2和3周剖杀,对全部试验猪的肺组织进行灌洗处理以获得肺泡巨噬细胞(PAM),用PAM进行抹片,同时用肺组织直接进行触片做间接免疫荧光(IIF)检测。结果表明,用所获得的3 株单克隆抗体均检测到人工感染猪肺组织中的PRRSV抗原。另外,用IIF检测7 头临床疑似PRRS病猪的PAM抹片,其中沭阳县的2头猪呈现阳性反应;对这2头猪的肺组织进行病毒分离,在盲传到第4代时Marc 145细胞上产生明显的细胞病变,进一步证实用所获得的3株单克隆抗体检测临床样品的结果准确而可靠,且获得的3株单克隆抗体均可通过IIF用于检测猪肺组织中的PRRSV抗原。     

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒HBR变异株第125代的毒力试验

从临床病例中分离到1株高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)变异株HBR,经细胞传代和蚀斑克隆获得了1株增殖性能稳定的传代毒株。为了检测该毒株在Marc-145细胞传代过程中毒力的变化,用PRRSV-HBR株第125代培养物(毒价为107.5 TCID50/mL)经肌肉注射和滴鼻途径接种18头35日龄PRRSV抗体阴性猪,同时设未接种对照组。结果试验猪未出现明显的临床症状。用RT-PCR法检测试验猪血清,从第3天开始出现阳性,第7～14天达到高峰,第28天后转为阴性。对同一时间迫杀的试验猪检测各脏器组织中的病毒抗原分布情况,结果表明,感染后第7～14天试验猪多数脏器呈阳性反应,第21～42天病毒集中在脾、腹股沟淋巴结、颌下淋巴结等组织。病理学观察发现,第7～14天试验猪淋巴结及肺出现轻度病变。动物感染试验表明,尽管试验猪未显示明显的临床症状,但从病毒血症、病毒体内分布、病理变化等方面看,该毒株仍然具有一定的毒力,用于弱毒疫苗的研制还有待进一步驯化致弱。     

伪狂犬病病毒gB和gE蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

采用大肠杆菌表达系统表达获得了伪狂犬病病毒(PRV)超强毒株ZJ01的gB和gE重组蛋白,用其免疫BALB/c小鼠,通过细胞融合、克隆和间接ELISA筛选,获得了4株能稳定分泌抗PRV单克隆抗体的杂交瘤细胞,细胞培养上清的ELISA抗体效价在1∶1 600~1∶6 400之间,腹水抗体效价达1∶4×105;连续培养20代,抗体效价基本一致。抗gB单克隆抗体B1B6和B3D7属于IgG2b,抗gE单克隆抗体E1B11和E5C10属于IgG1,轻链均为κ型。Western-blot和IFA结果显示,4株单克隆抗体均能与PRV流行毒株ZJ01、HZ、SD、NJ、LA发生特异性反应,B1B6和B3D7还能与PRV gE基因缺失疫苗毒株Bartha-K61发生反应,但E1B11和E5C10不能与Bartha-K61发生反应。     

猪枝原体肺炎(猪喘气病)的病理发生

采用内布拉斯加株猪肺炎枝原体(Mycoplasma hyopneumoniae),实验接种29头仔猪。试验猪是用子宫切除术取出的未喂初乳的仔猪。顺次连续扑杀,以测定病变的发展过程。用2头仔猪作为对照。接种后第6天有1头试验猪出现显微病变,其余试验猪均在接种第10天以后查出有显微病变。肉眼病变于接种后第14天出现,除1头例外,肉眼病变一直维持到42天。从接种后第10天开始至第42天,除1头例外,均从接种猪肺中再分离到猪肺炎枝原体。免疫萤光反应不太敏感,但还是能在接种后第14天到第42天的大部分试验猪的细支气管上皮显示出免疫萤光。 电子显微镜所作的观察表明,枝原体存在于支气管和细支气管的上皮细胞原生质膜和纤毛附近,局限在上皮细胞表面,并不在上皮细胞里面。     

伪狂犬病病毒和猪圆环病毒2型混合人工感染仔猪排毒的检测

为了解伪狂犬病病毒(PRV)和猪圆环病毒2型(PCV2)感染仔猪后不同时间点的病毒载量及排毒规律,将34头健康仔猪分为4组,第1~3组分别为人工接种PRV、PCV2和PRV+PCV2组,第4组为空白对照组。分别在接种后第3、7、14、21、35天采集试验仔猪的鼻拭子和肛门拭子,用Taq Man荧光定量PCR(q PCR)对其进行定量检测,并分析仔猪排毒的变化规律。结果,接种后第3天,3个试验组仔猪肛门拭子、鼻拭子中均分离到PRV或PCV2;其中PRV单独感染后的病毒载量在第14天达到峰值331.67 copies/L;PCV2单独感染后的病毒载量在第3天达到峰值10 742.01 copies/L;PRV+PCV2混合感染后鼻拭子和肛门拭子的PRV分别在第14天和第7天达峰值980.96 copies/L和2 230.056 copies/L;鼻拭子和肛门拭子PCV2在感染后第14天达到峰值69.413 copies/L和271.72 copies/L;混合感染仔猪于感染后第8~14天发生死亡。3个感染组之间无论是肛门拭子还是鼻拭子,PRV、PCV2病毒载量均差异显著(P0.05)。上述结果表明,PRV单独感染、PCV2单独感染和二者混合感染均对仔猪造成严重危害,除引起仔猪发病死亡外,这2种病毒均能通过呼吸道和消化道向外排毒。     

猪伪狂犬病病毒MQ18变异株的分离鉴定

为了解福建省猪伪狂犬病病毒(PRV)野毒株的病原学特性及分子遗传变异情况,本研究用羊胚胎鼻甲细胞(OFTu)从疑似暴发伪狂犬病猪场死亡的育肥猪中分离到1株病毒,该病毒能够产生典型的PRV细胞病变,病毒液接种小鼠(0.1 mL/只)及成年兔(0.5 mL/只)在48～60 h死亡,均表现出典型的伪狂犬病症状。经PCR试验、电镜观察及特异性血清间接免疫荧光试验鉴定为伪狂犬病病毒,命名为MQ18株;并对其进行病毒效价的测定及gC、gE基因核苷酸和氨基酸序列差异性分析。结果显示,分离株TCID50为10~(-7.71)/0.1 mL;将其gC和gE基因序列与国内外17个PRV参考毒株进行同源性比较,核苷酸序列同源性分别为93.5%～99.9%和97.8%～100%,氨基酸序列同源性分别为88.7%～99.8%和95.7%～100%;分子遗传进化树分析显示,gC和gE基因均与国内近6年分离的PRV变异株集聚在一起,属于同一个进化分支;与经典株相比,gC基因编码的氨基酸序列在第63～69位有1个AAASTPA的连续7个氨基酸插入,gE基因编码的氨基酸序列分别在第48位和第496位有1个天冬氨酸(D)的插入,与PRV变异株变异位点相一致。以上结果证实,从发病猪群中分离到1株PRV变异株,本研究结果为选择合适疫苗来防控猪伪狂犬病以及病原学研究提供了参考。     

IBDV感染鸡免疫器官淋巴细胞中细胞凋亡调控蛋白的动态表达

用鸡传染性腔上囊病病毒(IBDV)SNJ93株、BC6/85株、B87株感染SPF鸡后观察免疫器官淋巴细胞中Bcl 2和Bax蛋白的分布定位和动态变化。结果,B87株接种组的腔上囊、脾、胸腺淋巴细胞中这两种蛋白在各检测时间均为阴性反应;SNJ93与BC6/85攻毒组胸腺淋巴细胞中这两种蛋白呈现阴性反应,SNJ93攻毒组腔上囊和脾淋巴细胞在48h即开始出现Bcl 2和Bax阳性反应,腔上囊淋巴细胞内这两种蛋白在感染后72、96、120h呈现明显的强阳性反应,以后开始降低,脾淋巴细胞中这两种蛋白在感染后72、96h出现强阳性反应;BC6/85攻毒组腔上囊淋巴细胞中只在96、120h出现阳性反应,脾淋巴细胞中只在96h呈现阳性反应。用免疫组化法检测Bax和Bcl 2,有可能为IBDV毒力划分增添新的依据。     

中草药饲料添加剂对三黄鸡组织器官发育的影响

将 1日龄三黄鸡分为对照组、试验A组和B组 ,每组公母各 2 0只。对照组仅饲喂基础日粮 ;试验A组除供给基础日粮外 ,添加 4 g/kg的中草药饲料添加剂 ;试验B组除供给同样的基础日粮外 ,添加 8g/kg的中草药饲料添加剂。试验结果表明 ,添加 8g/kg水平的中草药饲料添加剂能明显促进热应激下肉鸡肝、肾和胃的生长发育 ;添加 4 g/kg水平的中草药饲料添加剂对热应激下肉鸡组织器官的促生长作用不明显 ;在组织水平上 ,中草药添加剂可在一定程度上减缓热应激对肺和肝的损伤     

人工感染血管瘤病变型ALV-J对鸡免疫器官的影响

为探讨血管瘤病变型J亚群禽白血病病毒(ALV-J)HN06克隆株的致病情况,通过人工接种7日龄SPF雏鸡ALV-J HN06株,检测HN06株对鸡体的影响。结果发现,感染鸡生长较慢,体重比对照组低。HN06株对胸腺抑制显著,对法氏囊影响不明显,外周免疫器官的脾指数比对照组大。PCR检测病毒在免疫器官中的分布结果显示,骨髓和脾在攻毒后第7天可检测到病毒整合到基因组中,法氏囊和胸腺则分别在攻毒后第14天和第21天才能检测到。通过ELISA和细胞培养技术检测病毒血症、抗体产生和排毒情况,发现HN06感染鸡血浆中第7天即出现病毒(7/21),第28天出现抗体(2/21),第21天泄殖腔出现排毒(2/21)。随着产生抗体鸡的比例升高,排毒鸡逐渐减少,42d后无排毒现象。由此可见,试验鸡后天感染HN06株出现病毒血症,HN06不但抑制机体生长,还影响免疫器官的发育;HN06首先感染免疫器官中的骨髓和脾,再感染法氏囊和胸腺;抗体的产生能抑制排毒,但病毒血症仍然存在。     

联合表达PPV VP2和PCV2 ORF2基因的重组PRV的构建

将包含有完整阅读框架的PPV VP2基因(1 740 bp)和PCV2 ORF2基因(750 bp)插入真核表达载体pPI-2.EGFP中,构建了重组质粒pPI-2.EGFP.VP2.ORF2.采用脂质体介导法将重组质粒的DNA和PRV SA215株的DNA共转染Vero细胞,转染后20 h出现带荧光的空斑,挑斑纯化后繁殖,并收获病毒液.PCR和免疫荧光试验结果证实,成功构建了重组病毒,将其命名为PRV SA215(D1)株.细胞培养特性试验结果显示,重组病毒可以在Vero、MDBK、ST和IBRS-2等多种细胞上增殖,在Vero细胞上的增殖效价为1×106PFU.分别以1×106PFU/头、1×104PFU/头剂量接种28日龄仔猪,结果显示,免疫仔猪的PPV、PCV2抗体水平均逐渐升高,并分别从接种后第14 d和21 d开始,PPV、PCV2抗体转为阳性.此结果进一步佐证了重组PRV SA215(D1)株已构建成功.     

猪圆环病毒2型对猪浅表淋巴组织的病理损伤及分布规律的研究

为探究猪圆环病毒2型(PCV2)在保育猪浅表淋巴组织和器官中的分布规律,帮助临床检测疾病更好地选择采样部位。对广西某地区PCV2感染的猪进行临床症状和病理学观察,结果发现感染PCV2的猪淋巴组织和器官均有不同程度的病变,其中腹股沟浅淋巴结病变较为严重。运用免疫组织化学技术进行PCV2在保育猪浅表淋巴组织分布规律的研究,发现阳性信号主要存在于巨噬细胞和淋巴细胞的胞浆中,腹股沟浅淋巴结均能检测出阳性信号,且PCV2阳性信号高于其他浅表淋巴组织。建议将腹股沟浅淋巴结作为PCV2诊断的采样组织部位。     

人工感染猪流行性腹泻病毒的哺乳仔猪的病理学观察

为观察猪流行性腹泻病毒(PEDV)感染的哺乳仔猪的病理学变化,选取60头健康的哺乳仔猪,随机均分为A、B两组。A组仔猪经口接种PEDV细胞毒,B组作为空白对照,观察不同发病阶段A组仔猪的临床症状、剖检变化、组织切片的病理学变化。结果显示,A组仔猪潜伏期表现比较正常,仅肠道有轻微的卡他性炎症,肠道上皮细胞肿胀。前驱期仔猪出现呕吐和腹泻,肠道和淋巴结充血严重。典型症状期仔猪出现严重的腹泻、脱水、粪便恶臭等猪流行性腹泻的典型症状,严重的陆续死亡;个别组织器官出现严重病变,如肠上皮细胞脱落、肺泡融合、脾白髓萎缩、肾出现蛋白管型等。耐过仔猪生长缓慢。结果表明,A组仔猪出现典型的猪流行性腹泻的病理学变化,且病理演变过程具有一定的规律性,其致病机理可能与对肠道、肺的组织嗜性和对淋巴结、脾的免疫抑制性有关。     

牛和猪人工感染牛带绦虫的囊尾蚴形态与肝组织的病理变化

将试验动物牛和猪分为 4 组:A组(从江牛带绦虫感染牛组)、B组(从江牛带绦虫感染猪组)、C组(都匀亚洲牛带绦虫感染牛组)及 D组(都匀亚洲牛带绦虫感染猪组)。分别灌喂从江牛带绦虫和都匀亚洲牛带绦虫的孕节,并于感染后第67 d剖检,对牛带绦虫人工感染牛、猪的囊尾蚴形态与肝组织的病理变化进行了观察比较。结果显示,A组、B组、C组囊尾蚴分布在肝,C组囊尾蚴分布在肝、心、肾及四肢肌肉等;A组、B组囊尾蚴外有少量纤维组织包绕,A组囊尾蚴囊壁向囊腔内突出生长,周围有少量嗜酸性粒细胞浸润;B组、D组囊尾蚴发生坏死、钙化,周围有大量嗜酸性粒细胞及中性粒细胞浸润,D组肉芽肿形成,B组、D组均有大量纤维组织增生。