莫能菌素钠、磺胺嘧啶和蒿甲醚体内外抗弓形虫RH株速殖子的效果分析

通过弓形虫RH株速殖子在宿主体内和体外的感染试验,比较了莫能菌素钠、磺胺嘧啶和蒿甲醚的抗弓形虫效果。体外试验:用四甲基偶氮唑盐(MTT)法,评价了3种不同浓度的药物对人包皮成纤维细胞(HFF)毒性及增殖情况;在药物的安全浓度范围内,用5×10~4个弓形虫RH株速殖子感染5×10~5个HFF细胞,每种药物设置5个浓度梯度,培养48 h后观察药物体外抑制虫体在细胞内的增殖效果;以相对抑制率为指标,评估药物的体外抗弓形虫效果。体内试验:用5×10~4个弓形虫RH株速殖子接种小鼠,4 h后,3种药物分高中低剂量组进行灌胃给药,连续给药5 d后停药,观察并记录小鼠每天死亡情况;且每天每组随机抽取1只小鼠,检查腹腔液中速殖子量及停药后是否复发,评价药物体内抗弓形虫效果。体外试验结果表明:莫能菌素钠可显著抑制细胞内弓形虫的增殖,效果优于蒿甲醚,而磺胺嘧啶的效果波动性较大。体内试验结果表明:莫能菌素钠显著延长小鼠平均存活时间,磺胺嘧啶次之,蒿甲醚最次。体内和体外试验结果均显示出莫能菌素钠能显著抑制弓形虫速殖子增殖,延长小鼠存活时间。本研究为后续抗弓形虫药物研究以及临床用药提供了参考依据。     

人工感染猪弓形虫病的治疗试验

弓形虫（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａｇｏｎｄｉｉ）能感染所有的哺乳动物，人类通过接触终末宿主猫科动物和食入寄生弓形虫包囊的猪、羊、鸡等的产品也可感染，因此弓形虫病是严重影响人类健康及畜牧业发展的人畜共患寄生虫病之一。对本病的治疗，多年来一直采用螺旋霉素和磺胺类药物，而这些药仅对滋养体有效，对弓形虫包囊则无效。为了寻求一种既能杀灭滋养体又对包囊有特效的抗弓形虫药物，我们用氢溴酸槟榔碱和常山混合制剂对人工感染猪进行了治疗试验。１　材料与方法１．１　材料１．１．１　弓形虫强毒株　试验用弓形虫标准强毒虫株ＧＪＳ…     

12种中草药水煎剂体外抑制弓形虫感染效果的real-time PCR评价

为探究苍术、川乌等12种中草药的体外抗弓形虫感染效果,经制备水煎剂、测取吸光值和干重,评价其对Vero细胞的毒害作用;合成引物,优化real-time PCR条件,用9种回归模型拟合不同感染孔内弓形虫数目,求得24孔板单孔适合感染量;用适合数目RH速殖子与适当浓度水煎剂作用6 h、12 h、1 d、2 d和3 d,real-time PCR法定量水煎剂的体外抗弓形虫效果。结果显示,所得水煎剂的吸光值大小与干重间无线性关系,高浓度水煎剂不利于Vero细胞生长。抗感染结果显示,槟榔、白薇、青蒿、蒲公英和柴胡作用3 d时弓形虫速殖子数均较空白组显著降低(P0.05),其他水煎剂和时间点则作用不明显(P0.05),表明槟榔、白薇、青蒿、蒲公英和柴胡可抑制弓形虫体外增殖,能用作研发抗弓形虫感染特效药的重要研究对象。     

抗弓形虫单克隆抗体的被动保护和体外中和试验(初报)

应用抗弓形虫McAb(3C_2)株诱生腹水McAb,经纯化后被动免疫小鼠,4小时和24小时后用弓形虫强毒(RH)攻击,获得40％和20％的保护率;用McAb(3C_2)与RH在体外中和24和48小时后接种小鼠,获得60％的保护率。各对照组小鼠全部死亡,并查到大量弓形虫。对各个存活小鼠进行弓形虫包囊检查和盲传均未发现弓形虫病原存在。初步证明仅单一型的抗弓形虫McAb对小鼠具有抗弓形虫强毒感染的被动保护效力。     

五种中草药对弓形虫体外增殖的抑制效果

探索治疗弓形虫病的有效药物组方,从而为临床合理用药提供科学的指导,通过体外试验,培养Ana-1细胞作为弓形虫宿主细胞,采用MTT法测定了甘草、黄芩、百部、苦参和贯众5种中药对细胞的安全浓度,将弓形虫RH株速殖子与Ana-1细胞在含不同浓度药物的细胞培养液中共同培养,在加药后第4、8、12、24、48小时,观察细胞和弓形虫的生长状态和形态,选取第48小时观察药物体外抑制虫体增殖的效果,并以磺胺嘧啶钠作为阳性药物对照。结果显示,黄芩、百部、甘草可显著抑制弓形虫的增殖,而贯众和苦参效果不佳。     

弓形虫抗体免疫胶体金快速检测试纸条的研制

将样品垫(加样区)、包被了弓形虫排泄分泌抗原和胶体金结合物的结合垫、包被了弓形虫排泄分泌抗原和抗弓形虫抗体的硝酸纤维素膜、吸水垫依次首尾互相衔接粘贴在白色塑料板上,组装成检测弓形虫抗体的免疫胶体金快速试纸条。然后用其进行动物弓形虫病血清抗体检测,并用弓形虫IHA诊断试剂进行对照试验。经对已知弓形虫阴、阳性血清检测,与弓形虫IHA检测结果的符合率为82.5%,金标试纸条较弓形虫IHA诊断试剂能提前2 d检测到抗体。结果表明,检测弓形虫抗体免疫胶体金试剂(金标试纸条)的敏感度高于IHA。     

抗弓形虫独特型抗体的研究——抗弓形虫独特型抗体对小白鼠免疫保护试验

应用抗弓形虫McAb(Ab_1)免疫家兔制备poly抗Id(Ab_2)抗体免疫健康BALB/c小鼠,用弓形虫强毒(GJS)10~4攻击,进行免疫保护力效检。结果末经免疫的对照鼠5天内全部死亡,免疫鼠可存活11天陆继死亡。虫检率为100％,初步证明抗Id抗体做为弓形虫无病原抗原替代物,可诱导鼠体免疫应答,产生一定的免疫保护力、可延迟小鼠的死亡时间。提示抗弓形虫Id有进一步深入研究的价值。     

抗弓形虫独特型抗体的研究——抗独特型抗体的制备及其免疫原性测试

用抗弓形虫单克隆杂交瘤细胞株(3C_2)扩大培养,于腹腔注射BALB/C小鼠诱生腹水,经3次饱和硫酸铵盐析,透析,DEAE-Sephadex-A_(50)离子交换层析,除菌,制得纯化McAb(Ab_1),蛋白含量2mg/ml,用福氏佐剂乳化后免疫健康家兔4次,放血分离血清,再经盐析和层析处理,制得多克隆抗弓形虫独特型抗体(Ab_2),用佐剂制备疫苗,3次免疫绵羊(5～10mg/只)2只。共采集4次血清,制得抗抗弓形虫独特型抗体(Ab_3),用IHA法检测抗体效价为1:64～1024。证实抗独特型抗体(Ab_2)是特异的,是能模拟弓形虫抗原,具有类似弓形虫免疫原性,并可激发宿主免疫应答产生抗体,进而证实独特型和抗独特型的免疫网络学说在弓形虫病免疫中的应用价值。     

动物抗寄生虫药物的研究与应用

综述了动物抗寄生虫药物在国内外的最新研制以及使用现状,并对抗寄生虫药原料药、制剂、复方药物的研发前景作了展望,概括了新型抗寄生虫药物的研究途径,提出了21世纪新药研究的热点集中在作用于细胞内的核靶和多糖靶,同时先导物的设计也将成为热点。     

分泌抗弓形虫GJS株、NT株和RH株McAb杂交瘤细胞株的建立

自Khlor和Milstein 1975年创立淋巴细胞杂交瘤技术后,使在体外产生抗弓形虫特异性McAc及在此基础上分离、提取抗弓形虫保护性抗原和研制弓形虫基因工程苗成为可能,据此我们将SP2/0小鼠骨髓瘤细胞分别与刚地弓形虫GJS珠、NT株和RH株可溶性抗原免疫BALB/C小鼠的脾细胞融合,经IHA检测和克隆化后,获得了4株杂交瘤细胞。该4株杂交瘤细胞所分泌的McAb经鉴定均属IeG_1亚类,4株杂交瘤细胞经连续60代传递和5～23个月冻存复苏     

分泌抗弓形虫单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立——体外免疫法制备免疫脾细胞

作者用纯化弓形虫速殖子可溶性抗原体外免疫BALB/C小鼠的正常脾细胞与小鼠SP2/0骨髓瘤细胞融合,经ABC—ELISA和IHA筛选和3次克隆化培养后获得了1株分泌抗弓形虫单克隆抗体的杂交瘤细胞(E5)。E5杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体经琼脂双扩散免疫试验确定为IgGl亚类抗体。单克隆抗体的抗原吸收试验结果证明E5单克隆抗体为抗弓形虫特异性抗体。E5杂交瘤细胞的染色体数目为92～108,经连续30代传递培养和4个月冻存复苏试验证明其分泌特异性单克隆抗体的性能相当稳定。初步证实E5单克隆抗体针对一种弓形虫的共同抗原成份。     

重组猪干扰素-γ的体外抗弓形虫作用

在体外以不同剂量的重组猪IFN-γ刺激PK15细胞和猪腹腔巨噬细胞,观察了其对弓形虫入侵细胞和在细胞内增殖的影响.结果表明,随着重组猪IFN-γ剂量的增大,巨噬细胞的抗弓形虫作用逐渐增强,而不同浓度的重组猪IFN-γ对弓形虫入侵PK15细胞均无明显影响.推测重组猪IFN-γ可激活巨噬细胞抑制弓形虫的入侵和增殖,并与剂量有关;同时说明IFN-γ在非吞噬细胞内与在巨噬细胞内的作用不同.     

弓形虫单克隆抗体试剂的研究——单克隆抗体微量反向间接血凝试验

本文首次报道用杂交瘤细胞株3C_2分泌的抗弓形虫单克隆抗体腹水经饱和硫酸胺盐析纯化后致敏绵羊红细胞而建立了弓形虫微量反向间接血凝试验。结果表明:它可检测出含量仅为5μg/ml的弓形虫速殖子可溶性抗原,并且在弓形虫QHO株速殖子感染绵羊和家兔之后的2～6天,血清中即能检测到循环抗原;与正常绵羊、家兔和小白鼠的血清以及其它寄生虫感染的动物血清无非特异性反应和交叉反应;试剂经冷冻真空干燥处理后其活性不受影响,且至少能保存3个月之久。从而为早期弓形虫感染和现症急性感染等提供了一种特异性强、灵敏度较高和简便实用的诊断方法。     

抗弓形虫单克隆抗体试剂的研究——分泌抗弓形虫单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立

本研究选用了弓形虫QHO株活虫抗原免疫BALB/C小鼠,摘取脾细胞与SP_2/O骨髓瘤细胞融合,获得了分泌抗弓形虫McAb杂交瘤细胞株(2A_(11),3C_2)。其细胞分泌抗体效价为1:64(IHA),诱生腹水效价为1:1024和1:16384,经3个月连续培养和2次液氮冻存复苏培养,细胞生长良好,持续稳定分泌抗体效价不变,用诱生腹水经(NH_4)_2SO_4盐析、DEAE-Sephadex-A50层析和PEG浓缩,所得McAb致敏5％鞣酸化绵羊红细胞,与弓形虫可溶性抗原显示良好凝集效果,证明McAb与弓形虫可溶性抗原反应特异、敏感,并在血凝诊断试剂上具有应用价值。     

应用弓形虫McAb—RIHA对甘肃省羊猪血清弓形虫循环抗原的检测

应用已建立的分泌抗弓形虫MCAb杂交瘤细胞株(3C_2)诱导小鼠腹水,在50％(NH_4)_2SO_4溶液中4℃保存二年后,经盐析纯化,致敏戊二醛化鞣化绵羊红细胞制备抗弓形虫单克隆抗体反向间接血凝诊断试剂(MCAb-RIHA)检测已纯化的弓形虫可溶性抗原,灵敏度为7.43μg/ml;应用该诊断试剂对甘肃省部分弓形虫流产高发区的绵山羊血清435份(其中天祝县125份、古浪县121份、景泰县189份、高台县种猪场猪血清65份和人工感染羊兔的血清29份进行了弓形虫循环抗原(CAg)检测,共检出CAg阳性血清160份,阳性率30.3％(160/529),同时用IHA和RIHA诊断法对529份血样进行了血清、抗体(Ab)和CAg的检测和比较。结果表明,用以上两法同时检测的529份血样结果:151份Ab阳性,阳性率28.5％(151/529),107份中Ab、Ab均为阳性,占CAg阳性总数66.9％(107/160),占Ab阳性总数70.9％(107/151)。仅检出CAg阳性数53份,仅Ab阳性数44份,各占阳性总数的33.1％(53/160)和29.1％(44/151)。证明受检羊群和猪场同时存在既往感染史(Ab)和现症感染(CAg)。进而证明McAb-RIHA方法对弓形虫病早期诊断、流行病学监测具有实用价值。     

弓形虫重组MIC3蛋白间接ELISA检测方法的建立

为检测弓形虫特异性抗体,以纯化的重组MIC3蛋白作为包被抗原,用羊抗猪IgG-HRP作为酶标二抗,分别对抗原浓度、血清稀释度、酶标二抗稀释度以及作用时间等进行了优化,初步建立了检测弓形虫特异性抗体的间接ELISA方法。结果显示,该方法检测猪球虫、猪肺炎支原体、猪圆环病毒2型、副猪嗜血杆菌等阳性血清均为阴性,表明该方法具有良好的特异性。组内和组间重复性试验的变异系数均小于8%,表明该方法具有较好的重复性。应用所建立的ELISA方法和商品化试剂盒A(IHA)、B(ELISA)同时检测从南京某猪场采集的猪血清样品166份,符合率分别可达94.58%和95.78%。该方法为我国进行弓形虫病的诊断与流行病学调查提供了一种技术手段,并为试剂盒的研制与开发奠定了前期工作基础。     

抗弓形虫感染免疫中T淋巴细胞亚群的变化与功能

抗弓形虫感染免疫中Ｔ淋巴细胞亚群的变化与功能张君（青海省畜牧兽医科学院西宁８１０００３）杜重波（审校）（中国农业科学院兰州兽医研究所）弓形虫（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａｇｏｎｄｉ）是严格的细胞内寄生原虫，可感染包括人类在内的多种动物。在正常情况下，感染的弓...     

弓形虫单克隆抗体试剂的研究——应用RIHA及IHA法对弓形虫感染兔、羊循环抗原和抗体的检测

应用抗弓形虫单克隆体(McAb)致敏绵羊红细胞建立的反向间接血凝诊断法(RIHA)和间接血凝诊断方法(IHA),对人工感染弓形虫的兔、羊血清进行了循环抗原(CAg)和抗体(Ab)检测。结果表明,弓形虫弱毒(QHO)株和强毒(RH)株感染的兔和羊血清,用RIHA检出CAg的时间在感染后1～2天,平均4天;IHA检出Ab的时间在感染后8～16天,平均12天。用毒力不同的弓形虫感染后,CAg检出时间有一定差异:QHO株感染的兔平均5.3天,羊平均6.25天;RH株感染的兔平均2.3天,羊为1天。兔、羊CAg的阳性检出率均为100％。兔、羊血清CAg于感染后23～66天先后消失,而Ab滴度长期维持在一定高度(1:64～1:4096)。证明RIHA方法对不同毒力弓形虫感染的动物血清CAg可以达到早期诊断的目的。为弓形虫病急性期和早期现症感染提供了可靠的诊断方法和手段。     

抗弓形虫SAG2蛋白单克隆抗体的制备及其免疫学特性鉴定

为制备抗弓形虫SAG2蛋白的单克隆抗体(McAb),用纯化的rSAG2蛋白免疫BALB/c小鼠,3次免疫后,取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,经间接ELISA方法筛选稳定分泌高效价McAb的杂交瘤细胞株,体内诱生腹水法制备单抗。用ELISA方法测定其效价;单克隆抗体类型鉴定试纸条鉴定其类型;Western-blot和IFA试验进行特异性鉴定。结果显示,筛选出2株能稳定分泌抗SAG2蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别被命名为5E2、2A8。间接ELISA测定其效价分别为1∶256 000、1∶128 000;2株单克隆抗体亚型均为IgG1型,轻链均为κ链;Western-blot与IFA试验表明,这2株McAb均能够特异性识别天然构象的SAG2蛋白,并且进一步说明此蛋白是位于弓形虫膜表面的蛋白。成功获得了具有较高特异性及敏感性的抗SAG2蛋白的单克隆抗体,并能特异性识别天然构象的SAG2蛋白,为弓形虫病免疫诊断及基因工程亚单位疫苗的研制奠定了基础。     

抗弓形虫单克隆抗体试剂的研究——抗弓形虫单克隆抗体理化特性的测定

以分泌物抗弓形虫单克隆抗体杂交瘤细胞株3C_2接种BALB/C小鼠腹腔,所诱发的腹水McAb经反复冻融8次、冻干1次、饱和(NH_4)_2SO_4盐析3次,室温4℃及-20℃下保存5个月和不同pC缓冲液稀释等不同条件处理之后,其抗体活性无明显变化。从而证明该McAb性质稳定,能适应较复杂的环境,为建立弓形虫病免疫学诊断试剂盒以及该试剂盒的贮存、包装和运输等提供了科学依据。