小反刍兽疫病毒Nigeria75/1株F基因的克隆与原核表达

提取小反刍兽疫病毒(PPRV)疫苗株Nigeria 75/1的总RNA,用RT-PCR方法扩增F基因并克隆到pMD18-T载体中,以鉴定正确的质粒为模板克隆去掉N端信号肽和跨膜区的F基因(F-1)并亚克隆于原核表达载体pET-30a(+),得到重组质粒pET30-F-1,转化大肠杆菌BL21(DE3)进行诱导表达,表达产物进行SDS-PAGE、Western-blot分析,同时将重组蛋白免疫SPF家兔制备抗体,进行间接免疫荧光检测并用ELISA测定抗体效价.结果显示,目的基因正确插入了表达载体,在大肠杆菌中主要以包涵体形式表达,用重组蛋白免疫3次后,兔血清抗体达到较高水平,Western-blot分析说明表达产物能够与兔血清抗体发生特异性反应,间接免疫荧光试验显示重组蛋白免疫兔阳性血清能够识别PPRV Nigeria 75/1株全病毒抗原.表明,重组蛋白在原核表达系统内得到了高水平的表达,并且具有较好的反应原性.     

帕利亚姆病毒VP7蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备

本研究将帕利亚姆病毒(PALV)VP7蛋白的编码区序列插入原核表达质粒pET-32a(+),构建出重组质粒pET32-PALV-VP7,转化大肠杆菌Rosetta(DE3),以异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)进行重组蛋白的诱导表达。采用镍离子亲和层析进行重组蛋白的纯化,通过透析进行纯化蛋白的复性,采用Western-blot对复性后的蛋白进行鉴定。将纯化后的蛋白免疫家兔制备多克隆抗体,采用间接ELISA、Western-blot与间接免疫荧光对多克隆抗体的效价与反应原性进行分析。结果显示,在37℃与0.1 mmol/L IPTG诱导条件下,PALVVP7重组蛋白在大肠杆菌中得以高效表达,其分子质量约为43 ku,以包涵体形式存在,占菌体蛋白总量的30.4%。重组蛋白经纯化与复性处理后纯度达94.1%,Western-blot结果显示,复性后的重组蛋白可与PALV阳性血清发生特异性结合。ELISA检测结果显示,制备的家兔抗PALVVP7多克隆抗体效价可达1∶12 000。使用该多克隆抗体为一抗,可通过免疫荧光与Western-blot检测到PALV感染细胞中的VP7蛋白,表明抗体可特异性结合PALV的VP7蛋白。本研究成功在大肠杆菌中表达PALV VP7重组蛋白,并制备获得多克隆抗体,为PALV诊断试剂的开发奠定了基础。     

小反刍兽疫病毒N蛋白单克隆抗体的制备及其阻断化学发光抗体检测方法的建立

为了快速高效地检测小反刍兽疫病毒(PPRV),本研究旨在建立并优化小反刍兽疫N蛋白阻断化学发光抗体检测方法。原核表达并纯化了小反刍兽疫病毒N蛋白,用其免疫BALB/c小鼠,研制出PPRV N蛋白的特异性单克隆细胞5F2B10。用纯化的N蛋白作为包被抗原,辣根过氧化物酶标记的单克隆抗体5F2B10作为阻断抗体,优化反应条件后,确定N蛋白最佳稀释浓度为0.25μg/mL,阻断抗体的最佳稀释浓度为0.5μg/mL,待测血清按1∶8稀释后37℃反应1 h,底物最佳条件为室温避光5 min。通过检测40份小反刍兽疫病毒阳性血清和40份阴性血清,最终确定阴阳性样品抑制率(PI)临界值为50%。特异性试验证明该方法与山羊痘病毒(GPV)、羊口疮病毒(ORFV)、口蹄疫病毒(FMDV)的阳性血清不发生交叉反应。通过对220份绵羊血清样品进行检测,该方法与商品化试剂盒的符合率为94.5%(208/220)。上述结果表明,建立的阻断化学发光抗体检测方法可用于PPRV临床样品的抗体水平检测,为PPRV疫苗免疫效果检验及PPRV根除提供了新的方法。     

小反刍兽疫病毒F和H蛋白在CHO细胞中的融合表达及其免疫原性的研究

以小反刍兽疫病毒(peste des petits ruminants virus,PPRV)疫苗株Nigeria75/1基因序列为基础,构建了融合表达PPRV囊膜蛋白F和H胞外区的真核重组质粒pcDNA3.1-F-H,在悬浮CHO细胞中进行分泌表达。离心收集转染后的细胞培养上清进行亲和层析纯化,纯化样品经Western-blot鉴定,融合蛋白与PPRV阳性血清和His标签抗体都能发生免疫反应。使用纯化后的融合蛋白免疫BALB/c小鼠,可诱导小鼠体内产生针对PPRV的特异性抗体。上述研究结果为小反刍兽疫新型亚单位疫苗的研制奠定了基础。     

小反刍兽疫病毒N蛋白主要抗原区域的原核表达及间接ELISA检测方法的建立

为了建立可特异性地检测血清中抗小反刍兽疫病毒(PRRV)抗体的方法,对具有小反刍兽疫病毒特异性的N蛋白第Ⅳ区域进行扩增,并克隆至原核表达载体pET-32a(+)中,用于小反刍兽疫病毒N亚单位重组蛋白的表达。用纯化的重组蛋白作为检测抗原,建立了检测血清中抗小反刍兽疫病毒抗体的间接ELISA方法,并对该间接ELISA的抗原包被量、血清稀释倍数、血清孵育时间等反应条件进行了优化。Western-blot分析结果表明,重组蛋白具有良好的反应原性。所建立的间接ELISA方法可以鉴别血清中的小反刍兽疫病毒抗体和牛瘟病毒抗体,具有良好的特异性和灵敏性,与标准竞争ELISA试剂盒的符合率达98.4%。证实,本研究建立的检测血清中抗PPRV抗体的间接ELISA方法具有良好的特异性和灵敏性。     

小反刍兽疫病毒H基因胞外区的表达与分析

为了掌握小反刍兽疫病毒(PPRV)H蛋白胞外区的功能,根据GenBank中已发表的小反刍兽疫病毒Nigeria 75/1株的H基因序列设计相应引物,分别克隆tH基因后构建原核表达载体pET-30a(+)-tH和真核表达载体pPIC9K-tH。将测序正确的重组质粒分别转化至大肠杆菌BL21(DE3)和酵母菌GS115,而后进行诱导表达。SDS-PAGE分析结果显示,tH蛋白均获得了高效表达,融合蛋白的分子质量约为60ku,原核表达产物以包涵体的形式存在,其表达产量为4.68g/L,而目的蛋白的真核表达产量为0.5~1g/L。Western-blot分析表明,所表达的重组蛋白能被抗PPRV Nigeria 75/1株的阳性家兔血清特异性识别。结果表明,成功表达了小反刍兽疫病毒H基因胞外区,重组表达蛋白具有良好的反应原性,这为PPRV H蛋白与其受体相互作用功能区的确定奠定了基础。     

可介导多药耐药的cfr基因的原核表达及多克隆抗体的制备

为建立监测Cfr蛋白的方法奠定基础,采用PCR方法扩增cfr基因,并克隆入pEasy-T载体;测序确认后克隆入pET-28a(+)载体,构建重组质粒pET-28a-cfr,然后转化入大肠杆菌BL21(DE3)中并用IPTG诱导表达Cfr蛋白;用纯化的Cfr蛋白免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,并对抗体进行鉴定。结果显示,成功克隆了全长cfr基因,构建了重组质粒pET-28a-cfr,并诱导了Cfr蛋白表达以及制备了小鼠抗Cfr蛋白的多克隆抗体;Western-blot法鉴定该抗体可特异性识别重组蛋白Cfr;ELISA法测定抗体效价为1∶64 000。结果表明,用大肠杆菌BL21(DE3)能够成功表达Cfr蛋白,并且获得了高特异性、高效价的小鼠抗Cfr蛋白的多克隆抗体。     

小反刍兽疫病毒抗体间接ELISA检测方法的建立

为建立一种能快速、特异、敏感地检测血清中小反刍兽疫病毒(PPRV)抗体的方法,通过RT-PCR方法扩增出1 830bp的小反刍兽疫病毒的H基因,并将其克隆至原核表达载体pET-22b(+)中,进行H基因的重组表达。采用SDS-PAGE和Western-blot对重组蛋白进行鉴定及抗原性分析。用纯化的重组蛋白作为包被抗原,建立间接ELISA检测方法。通过矩阵法优化抗原最佳包被浓度、血清稀释度、最佳封闭剂、酶标二抗的最佳稀释度及孵育时间。结果显示,重组H蛋白(分子质量为68ku)能与PPRV阳性血清发生特异性反应。用建立的间接ELISA与标准竞争ELISA试剂盒检测92份临床样品并进行比较,两者的符合率为94.11%。结果表明,本研究建立的间接ELISA可以用于临床PPRV抗体的检测。     

番鸭呼肠孤病毒σNS蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备

为制备番鸭呼肠孤病毒(MDRV)YB株σNS蛋白的多克隆抗体,首先经RT-PCR扩增了σNS基因的完整编码序列,并成功构建了重组表达质粒pET-YB-σNS。将其转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导后,SDS-PAGE显示成功高效表达出分子质量约为58ku的融合蛋白。该融合蛋白以包涵体和可溶性蛋白两种形式存在,表达时的最佳诱导时间、IPTG诱导浓度、诱导温度分别为4h、1mmol/L和37℃。通过对包涵体和可溶性蛋白进行尿素洗涤纯化和(或)Ni 2+柱亲和层析纯化,得到了高纯度的重组蛋白。分别对纯化前、后的重组蛋白进行Western-blot分析,结果显示两者均可以与MDRV阳性血清发生特异性反应,表明它们具备良好的反应原性。将纯化后的可溶性σNS蛋白免疫家兔,制备的多克隆抗体ELISA效价达1∶32 000。上述研究结果为后续MDRVσNS蛋白功能研究奠定了基础。     

基因Ⅰ型乙脑病毒EDⅢ结构域蛋白的原核表达及其抗体制备与鉴定

为了分析和验证作为乙脑病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)亚单位疫苗研制的主要候选抗原EDⅢ结构域的免疫原性及其所产生的抗体对病毒的抑制效果,本研究利用RT-PCR方法扩增基因Ⅰ型JEV GS株EDⅢ结构域基因,构建原核重组表达载体p ET-30a-EDⅢ,转化大肠杆菌BL21感受态细胞,挑取阳性克隆进行诱导表达和纯化;将纯化的EDⅢ重组蛋白免疫家兔以制备多克隆抗体,利用Western-blot和间接免疫荧光试验验证制备的家兔抗EDⅢ多克隆抗体与全病毒抗原的特异性反应,并通过噬斑减少中和试验(PRNT50)测定家兔抗EDⅢ多克隆抗体的中和抗体效价。结果表明,重组EDⅢ蛋白以包涵体的形式表达,并获得了较高纯度的EDⅢ重组蛋白,制备的家兔抗EDⅢ多克隆抗体与全病毒抗原具有良好的特异性反应,中和抗体效价为133±46.2。以上结果表明,基因Ⅰ型JEV GS株EDⅢ结构域具有良好的免疫原性,免疫动物所产生的抗体具有较高的中和抗体效价,EDⅢ结构域可作为JEV亚单位疫苗研制的候选抗原。     

非洲猪瘟病毒pNP419L蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备

为了评估原核表达的非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)pNP419L蛋白的免疫原性及其潜在的应用价值,将PCR扩增的NP419L基因片段插入载体pET-28a中,然后转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中进行表达,以金属离子层析法纯化蛋白后,免疫新西兰大白兔制备家兔抗pNP419L多克隆抗体。结果显示,用PCR成功地扩增了NP419L基因序列,NP419L基因转入表达载体后被成功表达;纯化后的重组pNP419L蛋白的分子质量为42 ku;用间接ELISA检测家兔源多克隆抗体的效价达到1∶512 000,IFA试验及Western-blot检测表明该多克隆抗体具有良好的反应性及特异性。本研究为pNP419L蛋白生物学功能的研究奠定了基础。     

牛结节性皮肤病病毒ORF006蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备

为探究牛结节性皮肤病病毒（LSDV）ORF006蛋白的生物学功能,制备了ORF006基因的多克隆抗体,用PCR技术获得LSDV ORF006的基因片段克隆至pET-28a原核表达载体,并转化至大肠杆菌BL21(DE3)后进行IPTG诱导表达,将纯化后的蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体。结果显示,LSDV ORF006基因全长约696 bp;pET-28a-ORF006重组质粒在大肠杆菌中于37℃经1 mmol/L的IPTG诱导12 h,成功表达约28.0 ku目的蛋白;ELISA结果显示,制备的多克隆抗体效价为1∶102 400;Western-blot结果显示,制备的多克隆抗体能特异性识别ORF006蛋白;间接免疫荧光试验表明,制备的多克隆抗体能够特异性识别LSDV感染MDBK细胞表达的ORF006蛋白。本研究为进一步探究LSDV ORF006蛋白生物学功能奠定了基础。     

小反刍兽疫病毒H基因或F基因重组山羊痘病毒活载体疫苗的研究

为构建能够表达小反刍兽疫病毒(PPRV)H基因或F基因的重组山羊痘病毒(GPV)并以此为活载体疫苗,在通用转移质粒pTKfpgigp的多克隆位点中插入PPRV的H基因或F基因,构建重组转移质粒pTKfpgigp-PPRV H和pTKfpgigp-PPRV F,并用Lipofectamine 2000转染已感染GPV的原代绵羊睾丸细胞,经同源重组产生重组GPV(rGPV)。用GFP和gpt选择标记筛选纯化rGPV,通过RT-PCR和免疫荧光技术检测rGPV在原代绵羊睾丸细胞中外源基因的表达情况。将获得的rGPV皮内接种山羊,检测抗山羊痘病毒和小反刍兽疫病毒的特异性抗体的变化情况。结果显示,获得了含有PPRV H基因或F基因的病毒株rGPV-PPRV H和rGPV-PPRV F;在原代绵羊睾丸细胞中rGPV所含的外源基因进行了正常转录和翻译,表达产物能与PPRV抗血清产生特异性反应,动物免疫试验表明,2株rGPV能诱导产生高水平的抗山羊痘病毒和小反刍兽疫病毒的特异性抗体。上述研究结果为PPRV重组标记疫苗的研制提供了参考。     

鸭肠炎病毒gB N端(60～110aa)抗原优势区的原核表达及抗血清的制备

以本实验室已克隆的鸭肠炎病毒(DEV)C-KCE株ul27基因序列为模板,设计特异性引物,PCR扩增获得编码鸭肠炎病毒gB N端第60~110aa的目的基因片段,大小为150bp。将目的基因亚克隆至原核表达载体pET-32a(+)中,阳性质粒被命名为pET-32a(+)-gB-1。经IPTG诱导,SDS-PAGE分析表明,重组蛋白以包涵体形式表达,大小约为27ku。用Ni-NTA柱亲和层析获得纯化的重组蛋白,鸭抗DEV阳性血清经间接ELISA检测证实其具有抗原性,并以此为免疫原免疫家兔制备抗血清,经间接ELISA检测,抗血清效价为1∶25 600。应用间接免疫荧光及Western-blot分析制备的抗血清的反应性,均证实抗血清可特异性识别DEV gB蛋白。分别以重组蛋白和DEV超离病毒为检测抗原进行间接ELISA,检测DEV免疫鸭的抗体消长规律,结果显示两者的抗体变化趋势一致。以上结果表明,制备的抗血清可作为DEV检测的候选试剂,表达的重组蛋白可作为DEV抗体检测的诊断抗原。     

结核分枝杆菌rv1738基因的原核表达及多克隆抗体的制备

为了在大肠杆菌中克隆表达结核分枝杆菌rv1738基因,并制备针对Rv1738蛋白的小鼠多克隆抗体,以结核分枝杆菌H37Rv的基因组DNA为模板,PCR扩增rv1738基因,构建重组表达质粒pET-30a(+)-rv1738。重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导目的蛋白表达,通过镍柱亲和纯化重组蛋白,用SDS-PAGE鉴定目的蛋白的表达情况,并用Western-bolt分析表达蛋白的反应原性。最后,以纯化的Rv1738蛋白免疫C57BL/6小鼠制备多克隆抗体。结果显示,成功构建了原核表达载体pET-30a(+)-rv1738,经IPTG诱导在重组大肠杆菌中表达出分子质量为20ku的目的蛋白,并且以可溶的形式表达;对表达产物进行镍柱亲和纯化,获得了纯度较高的融合蛋白。重组蛋白Rv1738能与家兔抗H37Rv多抗血清发生特异反应,具有良好的反应原性。纯化的Rv1738蛋白免疫小鼠后,能有效地刺激特异性抗体的产生,血清ELISA效价达到1∶8 800,且具有良好的特异性。以上结果表明,成功克隆表达了结核分枝杆菌rv1738基因,并制备了针对Rv1738蛋白的小鼠多克隆抗体,这一结果为探索Rv1738蛋白在结核病疫苗开发和新型诊断试剂研制方面的潜能奠定了基础。     

猪氨肽酶N多抗血清的制备及活性分析

为进一步研究猪氨肽酶N(pAPN)介导TGEV与靶细胞相互作用的机制,将编码猪氨肽酶N成熟肽基因(105～2889bp)克隆至原核表达载体pET-30a,将重组质粒pET-30a-pAPN转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导后进行SDS-PAGE分析,利用蛋白切胶纯化技术对目的蛋白进行纯化,制备其多抗血清,并通过琼扩试验、Western-blot分析、病毒抑制试验及体外瞬时转染试验分析该多抗血清的生物活性。结果,获得了大小为112ku的目的蛋白,多抗血清效价为1∶32,该血清在低浓度时仍具有抑制病毒的活性。结果证实,制备的多抗血清具有较高的抗体效价、较强的特异性及良好的生物活性。     

抗小反刍兽疫病毒P蛋白单链抗体的制备及鉴定

为制备抗小反刍兽疫病毒(PPRV)Nigeria75/1株P蛋白的单克隆抗体并获得其单链抗体(ScFv)基因,利用纯化的PPRV和带有GST标签的重组P蛋白免疫BALB/c小鼠,制备抗PPRV P蛋白的单克隆抗体(m Ab),从分泌抗PPRV P单克隆抗体的杂交瘤细胞中提取总RNA,扩增VH基因和VL基因,采用重叠延伸PCR(SOE-PCR)法获得单链抗体全长基因,并克隆至原核表达载体p ET32a(+)中,再将构建的重组质粒p ET32a-ScFv-3A6转化大肠杆菌BL21(DE3),诱导单链抗体重组蛋白表达。结果,获得了4株能稳定分泌抗PPRV P蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株3A6、1P4、3F8和1P1,对m Ab 3A6进行了Western-blot鉴定和间接免疫荧光试验(IFA)。成功扩增了杂交瘤细胞株3A6的ScFv基因,获得了ScFv-3A6重组蛋白,大小为47 ku,证实该重组蛋白具有较强的抗原结合活性。上述研究结果表明,本研究获得了4株能稳定分泌抗PPRV P蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株,并成功扩增到杂交瘤细胞株3A6的ScFv基因,实现了原核表达,为PPR防控新措施的研究奠定了基础。     

猪巨细胞病毒gB优势抗原表位区的原核表达及其多克隆抗体的制备

为制备猪巨细胞病毒(PCMV)gB优势抗原表位区重组蛋白的多克隆抗体,进一步分析PCMV gB蛋白的生物学特性,建立PCMV抗体血清学检测方法。对PCMV gB基因优势抗原表位区进行了PCR扩增,将回收的目的片段连接入pET32a(+)表达载体,转化入E.coli Rosetta(DE3),构建了重组表达菌E.coli Rosetta-pET32a(+)-gB,经IPTG诱导表达了gB优势抗原表位区重组蛋白。对重组蛋白进行纯化后,通过Western-blot试验验证了重组蛋白的反应原性,并免疫家兔制备了多克隆抗体。结果表明,该重组蛋白大量可溶性表达,且具有良好的反应原性。琼脂扩散试验及Western-blot检测表明,多克隆抗体效价达到1∶8,且能与gB优势抗原表位区重组蛋白特异性结合。证实,成功制备了PCMV gB优势抗原表位区重组蛋白多克隆抗体。     

新型鹅细小病毒VP2蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备

为探究造成鸭短喙与侏儒综合征的病原即新型鹅细小病毒（NGPV） VP2蛋白的生物学功能,根据NGPV SD株序列,扩增VP2基因克隆至原核表达载体pET-32a,转化到大肠杆菌BL21(DE3)中表达重组蛋白。将纯化的蛋白按照标准程序免疫7周龄BALB/c小鼠制备多克隆抗体。结果显示,NGPV VP2基因全长为2 199 bp;通过大肠杆菌BL21(DE3)成功表达出大小约为83 ku的His-VP2融合蛋白。ELISA结果显示,制备的多克隆抗体效价为1∶204 800。Western-blot结果显示,制备的多克隆抗体能特异性识别VP2蛋白。间接免疫荧光试验表明,制备的多克隆抗体能够特异性识别受感染细胞中的NGPV和鹅细小病毒。综上所述,本研究成功表达并纯化了VP2蛋白,并成功制备了效价高反应性好的多克隆抗体,为进一步探究NGPV VP2蛋白生物学功能奠定了基础。     

延边白鹅IFN-α基因的原核表达及其表达产物生物学活性的研究

以本实验室构建的鹅pMD18-T-IFN-α载体为基础,利用PCR技术扩增得到鹅α干扰素(IFN-α)DNA,经BamHⅠ+SalⅠ双酶切,将其亚克隆到原核表达载体pET-30a上。将构建的重组质粒pET-30aIFN-α转化至大肠杆菌BL21(DE3)菌株,经IPTG诱导表达后,进行SDS-PAGE、Western-blot分析鉴定;用Ni柱亲和层析纯化目的蛋白,以纯化的重组蛋白作为抗原,免疫家兔制备多克隆抗体并进行鉴定。结果显示,PCR扩增出的鹅α干扰素基因全长576bp;成功构建了原核表达载体pET-30a-IFN-α并得到表达;经SDS-PAGE和Western-blot检测,该蛋白的分子质量约为29ku,以纯化后的重组蛋白为抗原免疫家兔,成功制备了多克隆抗体,血清效价为1∶32。本试验为研究鹅IFN-α的作用机理,开发有效防治鹅疾病的新型制剂奠定了基础。