牛源大肠杆菌毒力基因的检测及其对小鼠致病性的研究

为了解肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157∶H7黑龙江分离株的毒力及其接种小鼠后所引起的病理组织学变化,对该菌株进行了7种毒力基因的检测和毒力试验;在5周龄昆明小鼠饮水中加入萘啶酮酸预处理,腹腔注射大肠杆菌O157∶H7 1.0×1010 CFU,进行临床观察与病理组织学检查。结果显示,该菌株携带stx1、eaeA及hly基因,未检测出stx2、F4、k99、F17基因;小鼠接种该菌株后24h内全部死亡,半数致死量为7.9×107 CFU,最小致死量为5.0×106CFU。该分离株引起肺出血、肾水肿、肠壁变薄等病理变化。研究结果表明,EHEC O157∶H7黑龙江分离株毒力较强,可引发小鼠器官与肠道出现不同程度的病理变化;这一结果有助于了解大肠杆菌O157∶H7的致病机理和临床诊断。     

一株致猪胃溃疡大肠杆菌的分离鉴定

四川某猪场暴发保育猪与育肥猪水样腹泻,病理剖解可见胃黏膜大面积脱落、胃溃疡等症状,采集病死猪扁桃体与肠系膜淋巴结进行病毒检测;以肠内容物做寄生虫卵检测;选取其中一代表病例做细菌分离,经小鼠致死试验、仔猪回归试验确定病原菌,并对病原菌进行了形态学观察、生化鉴定、16SrDNA序列分析及药敏试验。结果显示,猪瘟病毒、伪狂犬病病毒等的检测结果为阴性;无寄生虫感染;从十二指肠内容物中分离到1株疑似致病性大肠杆菌,并命名为SCDC-1。用SCDC-1株人工感染健康仔猪成功复制出水样腹泻、胃溃疡病例。对SCDC-1株进行16SrDNA克隆测序,并与GenBank中的8株肠杆菌科和4株巴氏杆菌科菌株的16S基因进行同源性分析,发现SCDC-1株与大肠杆菌16S基因的相似性高达99.5%～99.9%。药敏试验结果显示,该病原菌仅对头孢曲松钠、头孢吡肟、丁胺卡那霉素敏感。试验结果证实,引起此次保育猪与育肥猪胃溃疡的主要病原为致病性大肠杆菌。     

猕猴肠侵袭型大肠杆菌的分离鉴定及其毒力因子基因的检测

2010年5月从四川省某猕猴养殖场急性腹泻猕猴肠道内分离出4株致病性大肠杆菌,并对其进行了16SrDNA扩增、生化反应、血清型鉴定、药敏试验以及毒力因子基因的分子生物学检测。结果显示,该菌株血清型为O28;药敏试验证实该菌对多种抗生素具有抗性,并且呈现多重耐药性;攻毒试验证实该菌能够导致小白鼠大量死亡;多重PCR成功检测出侵袭性大肠杆菌的Einv毒力基因。确定该病原菌为肠侵袭型大肠杆菌,而且毒力很强。     

山羊溶血性曼氏杆菌2型的分离鉴定

为了确定某养殖场奶山羊细菌性感染导致死亡的具体病原种类,从送检的肺和肝组织病料中分离纯化细菌。通过生化培养特性观察、16S rRNA和毒力基因的PCR扩增、血清型鉴定、药敏试验和致病性试验来鉴定病原种类。结果显示,从送检的组织中分离出2株革兰阴性球杆菌;16S rRNA和毒力基因LKT测序结果表明,所分离的病原菌为溶血性曼氏杆菌,血清型鉴定均为溶血性曼氏杆菌A2型,故可确定分离株为具有致病性的溶血性曼氏杆菌2型。药敏试验结果显示,分离株对羧苄西林、庆大霉素敏感,对氨苄西林、卡那霉素等中度敏感,而对复方新诺明具有耐药性。小鼠致病性试验表明,接种分离株后小鼠于24 h内陆续死亡,并从剖检小鼠肺中也检测到溶血性曼氏杆菌,表明该菌有一定的致病力。结果表明,造成山羊死亡的主要病原是溶血性曼氏杆菌,这为溶血性曼氏杆菌病的临床用药提供了参考。     

贵州某猪场胸膜肺炎放线杆菌血清5型的分离鉴定

2020年11月贵州毕节某猪场一头经产母猪突然发病死亡,为鉴定导致其发病死亡的致病菌,试验无菌采取病死猪病变肺组织,通过细菌分离培养、染色镜检、生化试验、16S rRNA PCR扩增等方法进行鉴定,并对分离菌进行药敏试验、血清型鉴定、毒素基因鉴定、耐药基因检测及毒力试验。结果显示,从病变肺中分离到1株病原菌,分离菌的菌落形态、菌体形态、生化特征和16S rRNA基因序列均与胸膜肺炎放线杆菌相符,将其命名为APP GZBJ2020;药敏试验显示,APP GZBJ2020株对头孢曲松、头孢哌酮、青霉素等9种药物敏感,对头孢氨苄和米诺环素中度敏感,对庆大霉素、红霉素、新霉素等9种药物耐药;血清型鉴定结果显示其为血清5型胸膜肺炎放线杆菌;毒素鉴定结果显示APP GZBJ2020株含有ApxⅠ、ApxⅡ及ApxⅣ三种毒素基因;耐药基因检测结果显示,APP GZBJ2020株携带有tem、gyrB、parC和parE四种耐药基因;动物毒力试验结果显示,APP GZBJ2020株对小鼠有致病性。试验成功从病死经产母猪病变肺中分离到1株血清5型胸膜肺炎放线杆菌,试验结果可为该猪场治疗发病猪提供一定帮助,并为了解胸膜肺炎放线杆菌在贵州省的流行血清型提供数据支持。     

华南虎源铜绿假单胞菌的分离鉴定及其生物学特性研究

为探明福建省梅花山华南虎繁育研究所1只3岁华南虎公虎的死亡原因,无菌采集死亡虎的肝、脾、肺等组织样本,并接种于鲜血琼脂培养基分离优势细菌,利用表型特性及16S rRNA基因序列分析鉴定分离菌株;通过毒力基因检测、小鼠致病性试验、药敏试验及耐药基因检测对分离菌株进行致病性和耐药性研究。结果显示,从死亡华南虎肝组织中分离到1株铜绿假单胞菌,命名为FJ/Tiger-201801;该分离菌与26株铜绿假单胞菌16SrRNA的核苷酸序列同源性为97.1%～99.6%,其中与水貂源CS-20株、林麝源FMDP002株、人源Kasamber2株的同源性高达99.6%;毒力基因检测结果显示,该分离菌携带exoT、exoS、exoY这3种毒力基因;动物致病性试验结果显示,该分离菌对小鼠具有较强的致病性,试验小鼠在攻毒后13 h内全部死亡,并对死亡小鼠的肝、肺、脾等组织器官造成了严重的病理组织损伤;对11类30种常用抗菌药物的药敏试验结果显示,该分离菌株对氨苄西林等其中8类18种抗菌药物均表现耐药,对多黏菌素B等6种抗菌药物表现中度敏感,仅对头孢吡肟、氧氟沙星、左氧氟沙星、环丙沙星、妥布霉素和哌拉西林这6...     

鲫鱼源致病性维氏气单胞菌的分离鉴定及药敏试验

为鉴定长春市某渔场鲫鱼病原菌,从患病鲫鱼脾中分离到病原菌J YX-1,通过生理生化试验,16S rRNA、管家基因及毒力基因扩增,系统发育分析和药敏试验进行鉴定。结果显示,分离菌J YX-1对鲫鱼具有致病性;基于16Sr RNA与4种管家基因构建的系统发育树显示,该菌与维氏气单胞菌同属一个分支,亲缘关系较近,表明J YX-1为维氏气单胞菌;毒力基因检测发现,能从J YX-1扩增出气溶素(aer)、细胞毒性肠毒素(act)、黏附素(Aha)、丝氨酸蛋白酶(ser)、核酸酶(exu)及脂肪酶(lip)6种毒力因子基因。药敏试验结果显示,分离菌J YX-1对克拉霉素、妥布霉素及链霉素等11种药物敏感。本研究结果为鲫鱼感染维氏气单胞菌的鉴定及治疗提供了理论依据。     

大熊猫源普通变形杆菌分离鉴定及致病性分析

为探明福州某患病大熊猫的病因,研究病原菌的生物学特性、药物敏感性及致病性,从患病大熊猫的粪便中分离、纯化病原菌,经培养特性、形态学观察、生化试验及16S rRNA PCR扩增、测序及进化树分析等系统鉴定,并对鉴定菌进行药敏试验、动物致病性试验、组织病理学观察及毒力因子检测。结果分离到1株具有迁徙生长特点的革兰阴性杆菌,生化特性与普通变形杆菌(Proteus vulgaris)相一致,16S rRNA基因序列与普通变形杆菌的相似性为99.9%,进化树分析显示,与普通变形杆菌处于同一分支,确定分离菌为普通变形杆菌,命名为GP19株。该分离菌至少携带ureC、mrpA、fli L、flhA、flhB、flhD和pmbA等7种毒力基因,小鼠腹腔接种后12 h内死亡,半数致死量(LD50)为9.73×106CFU/m L。病理切片观察可见肝、脾、肺、肾、脑等实质器官淤血、出血,十二指肠肠绒毛大量坏死、脱落。药敏试验表明,该菌对环丙沙星、头孢克肟和氨曲南等23种药物敏感,对林可霉素、强力霉素和头孢唑啉等13种药物耐药。以上研究表明,患病大熊猫粪便中存在携带多种毒力因子的普通变形杆菌,并表现出较强的致病力,可损伤肝、脾、肺、肾、脑及十二指肠等多个组织器官,对临床药物显示多重耐药,本研究结果为大熊猫的疫病防控提供了科学依据。     

貂源铜绿假单孢菌的分离鉴定及其致病性研究

为确定山东威海某养殖场发病水貂的病原菌,从发病水貂肺中分离并纯化细菌,根据其形态特征、培养特性、生化试验结果及PCR鉴定,确定其为铜绿假单孢菌。致病性试验中,将8.0×1010CFU/mL的菌液10倍系列稀释后,感染60日龄健康昆明系小鼠,半数致死量和最小致死量分别为1.4×107 CFU/mL和8.0×106 CFU/mL。剖检死亡小鼠可见皮下和肺出血,并能从死亡小鼠的肺中分离出与感染菌株形态特征完全一致的菌落。药敏试验结果显示,该分离菌株对庆大霉素、环丙沙星、诺氟沙星、头孢哌酮等较为敏感,而对青霉素、链霉素不敏感。系统发育分析结果表明,该分离菌株与从小麦中分离的铜绿假单孢菌的亲缘关系最近,据此怀疑该发病水貂有可能是食用了污染的饲料引起的。     

扬子鳄源变形杆菌的致病性测定及毒力因子鉴定

为确定人工养殖条件下越冬期间扬子鳄尿酸盐沉积的发病原因,对2012—2013年分离于发病扬子鳄或卵的18株普通变形杆菌(Proteus vulgaris)进行PCR鉴定、致病力试验、毒力因子检测。结果显示,18株普通变形杆菌中强毒株的小鼠LD50为2.5×106~5.3×106CFU/m L。采用特异性引物进行PCR,检测到18株菌的Fli L、Zap A、Hpm A、Hpm B、Rpo A毒力因子基因。鉴定出3株强毒性扬子鳄源普通变形杆菌,但并未发现毒力因子与菌株的毒力强弱有直接关系。本研究结果可为深入探究变形杆菌引发扬子鳄发生尿酸痛风并造成死亡的原因提供试验依据。     

猪源奇异变形杆菌的分离鉴定及其毒力的测定

为探究引起保育猪死亡的病原菌的生物学特性、耐药性及毒力,通过形态学观察、生理生化特性测定、16S rDNA基因序列分析、药敏试验、半数致死量测定对分离菌株进行鉴定。结果表明,分离菌株为奇异变形杆菌,16S rDNA基因进化树分析表明该分离菌株与来自印度海水中的分离菌株CIFRI P-TSB-13(JF784025)的亲缘关系最近;分离菌株对头孢西丁、头孢他啶、大观霉素、氨曲南这4种抗生素高度敏感,对米诺环素、呋喃妥因、阿米卡星等10种抗生素中度敏感,对庆大霉素、氧氟沙星、左氟沙星等21种抗生素不敏感,表明分离菌株具有多重耐药性。分离菌株感染斑马鱼的半数致死量为2.12×10~5CFU/mL,感染昆明小鼠的半数致死量为1.46×10~7CFU/mL。证实引起本次保育猪细菌感染的病原为奇异变形杆菌,且该分离菌株的毒力较强,建议治疗时应针对性地选择高敏抗菌药物。     

牛源B型产气荚膜梭菌的分离鉴定与毒力基因检测

为探究内蒙古通辽市某牛场牛猝死的原因,本研究采集病死牛肠道内容物,分别进行革兰染色镜检、全自动微生物分析系统检测、16S rRNA基因扩增、毒力基因检测及系统进化树分析、动物致病性试验、半数致死量试验。结果显示,分离菌形态、生化特性符合产气荚膜梭菌的特性;16S rRNA基因序列与GenBank中已登录的产气荚膜梭菌的同源性为99%,系统进化树分析该分离菌与B型产气荚膜梭菌的亲缘性最近;3种毒力基因在该致病菌中均被检测到;分离菌对小鼠有致死性;该菌对小鼠半数致死的浓度为2.27×10~7CFU/mL;药敏结果显示,分离菌株对多黏菌素、庆大霉素等药物敏感,对卡那霉素等药物中度敏感,对头孢他啶、阿莫西林等药物耐药。该致病菌经鉴定,确定为B型产气荚膜梭菌,毒力基因分别为α、β_2和ε毒素。     

团头鲂致病嗜水气单胞菌的分离鉴定与毒力基因的检测及耐药分析

为鉴定长春市某水产养殖基地患病团头鲂(Megalobrama amblycephala)病原菌,本研究从患病鱼中分离出致病菌WC03株,经人工感染试验鉴定该病菌有较强的致病性,能使团头鲂、小鼠及斑马鱼致病死亡,之后对分离菌株WC03进行形态学、理化特性分析,初步判定该菌为嗜水气单胞菌。进一步使用分子生物学方法检测该菌16S r DNA和gyr B、rpo D和cpn60这3种管家基因,同时对该菌的致病性及毒力基因携带情况进行分析。结果显示,16S r DNA及管家基因系统进化分析表明,该菌与嗜水气单胞菌聚类,且同源性在98%以上。该菌含有气溶素(aer)、细胞毒性肠毒素(act)、黏附素(aha)、丝氨酸蛋白酶(Ser)、核酸酶(exu)、脂肪酶(Lip)及密度感应系统调控基因(Luxs)这7种毒力因子。药敏试验结果表明,该菌对呋喃妥因、头孢噻肟、头孢噻吩、头孢呋辛这4种药物高度敏感。     

猪沙门菌分离株的毒力及耐药特征

为了检测哈尔滨市猪沙门菌分离株的毒力及耐药情况,对采自健康猪群的非重复35株沙门菌进行了血清型鉴定、人工感染及毒力试验、药敏试验、耐药基因的检测与转移试验。结果显示,检出的最主要血清型为猪霍乱沙门菌,共25株,占71.4%(25/35),其次为猪伤寒沙门菌和鼠伤寒沙门菌。被攻毒小鼠全部死亡,肝、脾、胃出现不同程度的出血性病变。大部分沙门菌株对临床常用的抗菌药物已产生多重耐药,其中对氨苄青霉素、氟喹诺酮类、四环素和氨基糖苷类抗生素的耐药性较高,而碳青霉烯类抗生素的体外活性较高。结果表明,碳青霉烯类抗生素可作为临床治疗沙门菌病的首选药物之一。     

天津地区猪链球菌9型分离株致病性的研究

猪链球菌是引起人和动物发生猪链球菌病的主要病原,给养猪业带来巨大的经济损失,并严重危害人类公共卫生安全。本实验室从天津地区212个养猪场送检的470份临床病料中分离鉴定出8株9型猪链球菌,通过昆明小鼠LD50测定试验、PCR方法分析菌株携带的主要毒力基因、黏附力试验和溶血性试验等,对分离株的致病能力、基因特性、黏附能力和溶血能力等进行了研究。结果显示,8株9型猪链球菌分离株对昆明小鼠的LD50差异较大,最小值6.4×106CFU/m L,最大值为5.7×108CFU/m L;受试菌株中gdh、cps9J、gapdh、 fbps、orf2、mrp、sly和ef基因的检出率依次为100.0%、100.0%、62.5%、50.0%、 37.5%、0.0%、0.0%和0.0%,分为5种毒力基因型,毒力基因型与菌株对昆明鼠的致病能力无直接关系。8株9型猪链球菌对PK-15细胞均具有黏附作用,黏附能力为1.2×103～3.9×104CFU/m L,其中CHTJS55菌株最强,CHTJS9-ZL次之,CHTJS72S最弱。溶血性试验结果表明,随着孵育时间的增长,各菌株的溶血能力均增强,且孵育3 h时,CHTJS41菌株的溶血能力最强,CHTJS70菌株最弱。上述研究结果为临床制定合理、有效的猪链球菌病防控措施以及候选疫苗株的筛选提供了参考依据。     

鸭源致病性大肠杆菌的分离鉴定及系统发育分析

为确定江苏省徐州市某养鸭场病死鸭的病原菌,从发病鸭的肝中分离到1株细菌并命名为JSE 4,根据形态特征、培养特性、生化试验、16S r R N A分子鉴定结果可确定该菌为大肠杆菌(E.coli)。对该分离菌进行致病型快速鉴定、动物致病试验、毒力基因检测、药敏试验、系统发育分析,结果显示,该分离株为禽致病性大肠杆菌(APEC),可引起试验组SPF雏鸭死亡,死亡率为16.7%。分离株含有14种毒力基因中的12种,29种常用抗菌药物中,该分离株仅对链霉素、呋喃妥因、亚胺培南、呋喃唑酮、头孢他啶、氨曲南这6种药物具有敏感性。该分离株与源自比利时水源、瑞士禽肉源和中国鸭源分离株的亲缘关系最近,与比利时水源、瑞士禽肉源分离株的同源性高达99.7%。研究表明,从江苏徐州周边养鸭场病死鸭中分离到1株多重耐药的禽致病性大肠杆菌。     

貂源肺炎克雷伯氏菌的分离及毒力和耐药性的分析

为探讨采自山东省部分地区的10株貂源肺炎克雷伯氏菌(Kp)的毒力和耐药性,本研究从疑似肺炎发病水貂的肺中分离出10株革兰阴性菌,经PCR及Vitek全自动细菌鉴定仪鉴定为肺炎克雷伯氏菌。对10株肺炎克雷伯氏菌进行人工感染及毒力试验、药敏试验、耐药基因检测及接合转移试验。结果显示,10株肺炎克雷伯氏菌攻毒后小鼠全部死亡,肺、肝、脾和肾均有不同程度的出血。分离株中大部分肺炎克雷伯氏菌对临床常用药物表现出多重耐药,其中对氨基糖苷类、青霉素类、三代头孢菌素类、喹诺酮类及磺胺类抗生素的耐药性较高,但对阿莫西林/克拉维酸、亚胺培南及多黏菌素等抗生素敏感。耐药基因TEM、SHV和CTX-M的检出率分别为100%、70%和80%,以TEM基因检出率最高。     

狐源豚鼠气单胞菌的分离鉴定

2015年辽宁鞍山某狐狸养殖场偶发病原菌感染。病死狐狸后肢肌肉液化,出现溃疡。为查明致死原因进行了实验室诊断,从病灶部位分离到1株优势菌株,命名为M12。综合细菌形态观察、生理特性研究、传统生化试验和VETEK 2全自动生化分析,结果显示,该株菌为豚鼠气单胞菌,革兰阴性短杆状,最适生长温度30℃,最佳p H 7~8,细菌生长曲线比较显示,M12在相同条件下增殖速度明显高于豚鼠气单胞菌模式菌株。通过测定M12的16S r RNA和管家基因gyr B进行了气单胞菌属种内分子水平鉴定,BLAST结果显示,16S r RNA和gyr B基因与Gen Bank上的豚鼠气单胞菌同源性达到100%。将16S r RNA测序结果提交到Gen Bank,获得登录号KX170836。M12含有细胞毒性肠毒素(cytotoxic enterotoxin,act)和热敏感细胞肠毒素(heat-Labie cytotonic enterotoxin,alt)两种毒力基因。小鼠感染试验得到M12的LD_(50)为8×10~8,具有很强的致病性。药敏试验结果显示,该菌对大部分的抗生素具有很强的敏感性,从而为该菌的防治提供依据。     

狐狸源霍氏肠杆菌的分离鉴定与系统进化分析

为确定黑龙江省某狐狸养殖场患病狐狸的病原菌,从发病狐狸的子宫内脓液中分离到1株细菌,并命名为bz001001。根据其形态特征、培养特性、生化试验及16S rRNA分子鉴定结果,确定该菌为霍氏肠杆菌。之后对该分离菌进行了动物致病性试验、药敏试验和系统发育分析,结果显示,该菌可引起试验组小白鼠20%死亡,具有一定的致病性;该分离株对16种常用抗菌药物大部分表现耐药,少数药物敏感,具有较高的耐药性;该分离菌与来源于婴幼儿配方奶粉、人源、螃蟹源及实蝇源分离株的霍氏肠杆菌的遗传距离最近,同源性高达98%。本试验是首次从狐狸中分离到霍氏肠杆菌,此结果提示霍氏肠杆菌具有比以往认为的更广泛的宿主范围。     

牛源A型多杀性巴氏杆菌的分离鉴定及毒力基因检测

为确定黑龙江省2个规模化奶牛场犊牛急性呼吸道感染的病因,笔者进行了病原的分离纯化,细菌16S rDNA基因和多杀性巴氏杆菌特异性基因OmpH鉴定、生化试验、药敏试验、半数致死量试验、荚膜血清型分型及22种毒力因子的检测,以确定主要病原的种类、型别及生物学特性。结果表明,从死亡牛肺和患病牛鼻拭子分离的2株病原菌均为荚膜A型多杀性巴氏杆菌,分别被命名为WC16551和LY01,序列分析结果表明,其与牛源多杀性巴氏杆菌同源性达到99%以上。药敏试验显示2株菌均对恩诺沙星、环丙沙星高度敏感。半数致死量结果表明,LY01菌株的毒力明显强于WC16551菌株,2株分离菌均携带19种毒力因子,未检出hgbB、toxA和nanB三种基因。上述研究结果表明,导致2个牛场发病的主要病原菌为荚膜A型多杀性巴氏杆菌。