扬子鳄Viperin基因的遗传衍化分析及表达量的测定

为研究扬子鳄Viperin基因的序列结构以及生物学功能,通过提取成年扬子鳄外周血液中的m RNA,经反转录得到c DNA,设计引物,对得到的c DNA进行PCR扩增,连接至p MD19-T载体上构建重组质粒,对PCR鉴定呈阳性的质粒进行序列测定,并进行进化树分析、同源性分析以及结构和功能预测,同时对扬子鳄不同组织中Viperin的表达水平进行测定和分析。结果显示,扬子鳄Viperin基因的完整ORF序列为1 011 bp,共编码336个氨基酸,前18个氨基酸为信号肽。成熟蛋白的分子质量为38 ku,等电点为8.72。三级结构显示,该蛋白主要由8段α螺旋,8段β折叠组成,与经典Viperin的结构一致。通过同源性和进化树分析,扬子鳄Viperin基因与湾鳄的同源性最高,为96.4%,在进化树中处于同一分支。Viperin在血液中表达量最高,在肌肉组织中表达量最低。本试验结果为扬子鳄Viperin基因的表达调控机制和功能研究奠定了基础。     

扬子鳄IL-1β基因的克隆和生物信息学分析及表达量的测定

为研究扬子鳄IL-1β基因的序列、结构以及生物学功能,通过采取成年健康扬子鳄外周血液,进行淋巴细胞的提取,再提取其mRNA,反转录得到cDNA,应用设计的引物进行PCR扩增,克隆出扬子鳄IL-1β基因的CDS区域,对得到测序正确的序列进行生物信息学分析、同源性分析以及进化树构建,同时选取6种组织对扬子鳄IL-1β不同时期的表达水平进行测定和分析。结果显示,扬子鳄IL-1β基因的完整ORF序列为801 bp,共编码266个氨基酸,理论上该成熟蛋白的分子质量为30 ku,等电点为5.15,总平均亲水指数为-0.254。同源性分析和进化树构建结果显示,扬子鳄IL-1β基因与美国短吻鳄的同源性高达91.9%,且处于进化树的同一个分支。IL-1β表达量在血液中呈现最高,非冬眠期普遍比冬眠期表达量高。本试验研究结果为扬子鳄IL-1β基因的表达调控机制和功能研究奠定了基础,也为扬子鳄的健康养殖和种群保护奠定了一定基础。     

扬子鳄TLR7蛋白多克隆抗体的制备及其在不同组织中的差异表达

通过比较不同物种的TLR7基因序列,设计了扩增扬子鳄TLR7部分片段的简并引物,成功克隆了该基因。以此设计原核表达引物,将表达产物克隆于表达载体pET-32a(+)中,转入大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达,成功获得该蛋白,并以此作为免疫原免疫新西兰大白兔,制备重组蛋白的多克隆抗体血清,采用ELISA测定效价,Western-blot验证特异性;以制备的多克隆抗体作为一抗,对冬眠期和非冬眠期扬子鳄的5种组织进行Western-blot,半定量分析TLR7蛋白含量的变化。结果显示,多克隆抗体血清效价达到1∶25 600,Western-blot试验中它与目的蛋白有良好的免疫反应性。TLR7蛋白在扬子鳄肺组织中表达量最高,且冬眠期蛋白表达量普遍低于非冬眠期。本试验结果为进一步研究扬子鳄TLR7的功能奠定了基础。     

天府肉鹅IFN-α基因的克隆及生物信息学分析

采用RT-PCR方法从天府肉鹅外周血单核细胞中扩增了IFN-α基因;并将上述扩增片段克隆到pMD18-T载体中,构建了重组质粒。用生物信息学软件及在线分析方法对IFN-α基因的核苷酸序列及其推导的氨基酸序列进行了分析,同时与13个物种的IFN-α基因进行了同源性比较。结果表明,成功地克隆了IFN-α基因,该基因与同类水禽(鸭、鹅)的IFN-α基因有90%以上的同源性,在进化树中位于同一分支,研究结果为开发鹅的干扰素制剂奠定了基础。     

猪IFN-α1基因的原核表达及其蛋白质结构的预测

利用RT-PCR技术,从被诱导的猪外周血单核细胞中克隆出了猪α1干扰素(IFN-α1)基因.序列分析表明,克隆的猪IFN-α1基因序列与GenBank上登录的猪IFN-α1基因的同源性为97.8%.用克隆的猪IFN-α1基因构建了重组表达质粒pGEX-4T-1-IFN-α1.探讨了猪IFN-α1.基因表达的最佳条件,并在大肠杆菌中对此基因进行了表达.结果表明,IPTG的最佳诱导浓度为0.5 mmol/L,最适诱导温度为42℃,诱导9h表达量最大,表达产物约占菌体总蛋白的30%.SDS-PAGE分析表明,表达产物的分子质量为45 ku,且目的蛋白主要以包涵体的形式存在.经预测,猪IFN-α1蛋白为一结构松散的球状蛋白.     

扬子鳄α型干扰素蛋白抗病毒活性分析

为了研究扬子鳄IFN-α抗病毒活性,构建真核表达载体pcDNA3.1-caIFN及pEGFP-N1-caIFN,将pc DNA3.1-caIFN转染至293T细胞中,通过间接免疫荧光试验证明IFN-α成功表达,并显示定位于细胞质中,第48小时扬子鳄IFN-α的表达量要高于第24小时的。将pEGFP-N1-caIFN转染至Vero细胞中,过表达24 h后接种水疱性口炎病毒(VSV),观察细胞,并在VSV感染后第24及48小时收集细胞,通过荧光定量PCR测定病毒VSV-G基因的变化,同时收集上清测定VSV子代病毒滴度,结果表明,与对照组相比,第24及48小时过表达扬子鳄IFN-α的试验组VSV-G基因的表达分别下调4倍及7倍,VSV子代病毒滴度分别低2.3及1.9个数量级。本研究结果证明,真核表达扬子鳄IFN-α蛋白能够抑制VSV mRNA的转录,并能抑制病毒增殖。     

长毛兔和獭兔IFN-γ基因的克隆与真核表达及表达产物的生物学活性

为扩增长毛兔和獭兔IFN-γ基因及检测其真核表达重组体的生物学活性,采用RT-PCR法从德系安哥拉长毛兔和白色獭兔外周血淋巴细胞总RNA中扩增了IFN-γ基因,测序并序列分析;将该基因亚克隆入pVAX1载体,转染COS-7细胞,MTT法检测其生物学活性。结果表明,长毛兔和獭兔IFN-γ基因大小均为504 bp,两序列间仅在492位存在1个碱基的变异(A→T)。两序列推导的氨基酸序列相同,含167个氨基酸残基。长毛兔和獭兔IFN-γ核苷酸同源性为99.8%,与国内外学者报道的兔IFN-γ核苷酸同源性分别为100.0%和99.8%。基于NJ法构建的进化树发现,国内外学者所报道兔的不同品种均聚类在一起。通过脂质体法转染COS-7细胞,获得具有一定生物学活性的IFN-γ蛋白。结果表明,不同兔品种的IFN-γ基因间差异极小,具有较近的亲缘关系;且pVAX1-IFN-γ转染细胞后能表达具有生物学活性的蛋白。     

番鸭呼肠孤病毒YB株NS基因的序列分析及原核表达

为实现番鸭呼肠孤病毒(MDRV)YB株NS非结构基因的克隆分析及原核表达,首先经RT-PCR扩增NS基因的完整编码序列(CDS),并将其克隆到p ET-32a(+)载体中。测序后对获得的NS基因进行核苷酸及氨基酸序列分析。将重组质粒转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞中,进行IPTG诱导表达及条件优化。对表达产物进行SDS-PAGE分析和Western-blot分析。测序结果显示,成功构建了包含MDRV-YB株NS基因的原核重组质粒p ET-YB-NS,并获取了NS基因序列。序列分析结果显示,MDRV-YB NS基因的CDS大小为1 908 bp,编码635个氨基酸;该基因核苷酸序列与传统MDRV的同源性为98.2%~99.4%。遗传进化树分析显示,MDRV-YB株处于传统型MDRV分支上。该蛋白氨基酸序列中并不含有潜在的信号肽序列,但是含有2个潜在的N-糖基化位点以及61个磷酸化位点。经IPTG诱导表达后,SDS-PAGE分析显示,成功高效表达出分子质量约为88.7 ku的融合蛋白(p-NS),表达时IPTG最佳诱导时间、浓度和温度分别为5 h、0.4 mmol/L和36℃。Western-blot结果显示,表达的p-NS蛋白能特异性识别MDRV阳性血清,表明表达产物具备良好的反应原性。上述结果表明,MDRV NS非结构基因的克隆分析及其蛋白表达的实现,为进一步研究MDRV NS蛋白功能奠定了基础。     

牦牛FGF18基因的克隆及其在子宫中表达水平的检测

为研究牦牛FGF18(fibroblast growth factor 18)基因的序列特性及其在子宫中的表达水平,根据黄牛FGF18基因序列5′端和3′端的保守性设计特异性引物,RT-PCR扩增之后通过基因克隆得到牦牛FGF18基因,利用生物学软件对其进行生物信息学分析,并采用实时荧光定量PCR(QRT-PCR)检测了FGF18基因在妊娠早期和非妊娠期牦牛子宫中的表达情况。结果显示,牦牛FGF18基因序列编码区长624bp,编码207个氨基酸,其中赖氨酸含量最高,约为9.7%;同源性分析和系统进化树显示,它与黄牛FGF18基因的同源性最高,为99.7%,表明FGF18基因在进化中具有高度保守性;编码产物的主要功能是胁迫应答和信号转导,与IL-1有相似的结构域,并且含有典型信号肽,整体表现为亲水性。QRT-PCR检测结果显示,FGF18基因在妊娠早期牦牛子宫中的表达量是非妊娠期子宫中表达量的24.7倍,说明FGF18蛋白在牦牛胚胎的早期发育中起着重要作用。     

番鸭呼肠孤病毒YB株μB蛋白的原核表达与生物信息学分析

为研究番鸭呼肠孤病毒YB株(MDRV-YB株)μB蛋白基因与其他多株参考毒株之间的遗传进化关系以及对该序列的结构功能预测和进行蛋白的原核表达,本试验通过RT-PCR方法从MDRV中特异性扩增μB基因,并构建重组质粒pET-YB-μB,经测序获得其完整的CDS区;通过DNAstar等软件对MDRVYB株μB基因进行生物学信息分析,预测其编码蛋白的结构功能;重组质粒转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达μB融合蛋白。结果显示,μB蛋白基因CDS区全长2031 bp,共编码676个氨基酸;μB蛋白分子式为C3217H5105N879O1014S27,不存在信号肽,可能含有4个N-糖基化位点、85个磷酸化位点,二级结构中α螺旋结构、β螺旋结构、β转角结构和无规卷曲的氨基酸残基分别占27.6%,53.3%,10%和9.1%;在核苷酸同源性方面MDRV-YB株μB基因与番鸭呼肠孤病毒ZJ2000M株同源性高达99.8%,与其他多株鸡源呼肠孤病毒、鸭源呼肠孤病毒和鹅源呼肠孤病毒同源性都很低,仅为67.3%~69.6%;进化树分析结果显示,MDRV-YB株与MW9710株处于最近的分支;SDS-PAGE和Western-blot分析结果显示,经IPTG诱导,重组质粒pET-YB-μB成功表达了大小约为99.1 ku的μB融合蛋白,并且该蛋白反应原性良好。本试验结果为MDRV的遗传进化和μB蛋白功能的研究奠定了基础,为进一步研究MDRV的致病机制提供了数据支撑。     

牦牛β-干扰素基因的克隆与表达

提取经植物血凝素(PHA)诱导培养的牦牛外周血淋巴细胞总RNA,采用RT-PCR技术扩增并克隆了牦牛IFN-β基因,经PCR和酶切鉴定及测序分析,再克隆到pGEX-4T-1质粒载体中,构建了原核表达重组载体,经IPTG诱导表达重组蛋白,可表达约41 ku的牦牛IFN-β融合蛋白,主要以包涵体形式存在。序列分析结果表明,牦牛IFN-β基因ORF为498 bp,与乳牛IFN-β参考序列的同源性高达98.6%,与猪、马、猫、人IFN-β基因的同源性分别为72.5%、68.9%、66.1%和63.5%,而与狗、鼠、鸡等动物的同源性均不超过25%;分子遗传进化树分析也表明,牦牛与乳牛IFN-β基因的亲缘关系最近,而与鼠、狗、鸡等的亲缘关系较远,说明IFN-β基因有种属差异性。     

非洲猪瘟病毒M1249L基因编码蛋白的序列分析和结构预测及亚细胞定位

为了解非洲猪瘟病毒（ASFV） M1249L基因及其编码蛋白pM1249L的结构和功能,本研究从NCBI数据库中采集100个ASFV毒株基因序列,对这些毒株的M1249L基因序列及氨基酸序列进行比对并构建分子进化树;进一步分析M1249L基因及p M1249L蛋白的理化性质,预测pM1249L蛋白的二级结构,预测并验证pM1249L蛋白在胞内的分布,验证p M1249L蛋白的泛素化修饰。结果表明,本实验室所使用毒株CN/GS/2018的M1249L基因与ASFV II型毒株同源性最高,相似度为99.87%;氨基酸序列比对结果表明,pM1249L蛋白较为保守;物理性质分析显示,p M1249L蛋白较为稳定,无跨膜区,无核定位序列及信号肽;化学性质分析显示,pM1249L蛋白具有磷酸化、泛素化、糖基化修饰位点;p M1249L蛋白以α-螺旋为主;激光共聚焦试验证实pM1249L蛋白分布于胞质;免疫共沉淀试验表明,pM1249L蛋白能够发生泛素化修饰。通过网站预测及试验验证,本研究全面分析了p M1249L蛋白的理化特性,为阐明其发挥功能的结构基础提供了相关数据。     

鲫鱼ghrelin基因的克隆和生物信息学分析

从鲫鱼的肠道内提取总RNA,运用RT-PCR扩增ghrelin基因并测序,用生物信息学软件预测其结构,并构建系统进化树,探讨了鲫鱼ghrelin基因的生物学功能,为进一步研究该基因对鲫鱼摄食的影响奠定基础。结果显示,获得了长490bp的ghrelin基因(GenBank登录号为HM567312),其序列含有1个312bp的完整开放阅读框,编码103个氨基酸;ghrelin蛋白分子质量为11 519.48u,等电点为5.20,半衰期为1.20h,不稳定系数为31.29,总平均亲水性为0.727,疏水性为-2.900～2.856;1～26位氨基酸可能是信号肽序列;在ghrelin的分子序列中存在44处α螺旋富集区域,8处β折叠区域,集中于成熟肽部分,有43处无规则卷曲。系统进化树分析显示鲫鱼ghrelin基因与金鱼的进化距离最近。     

日本血吸虫信号转导蛋白Sjwnt10a基因的克隆及其在童虫和成虫中mRNA表达量的变化

利用RACE技术从19日龄的日本血吸虫童虫中扩增了1个Wnt家族基因,并对其进行了生物信息学分析。同源性分析表明,该基因为日本血吸虫新基因,完整开放阅读框(ORF)长1896 bp,编码631个氨基酸,理论分子质量为73.3 ku。该基因编码的氨基酸序列具有Wnt家族蛋白的典型特征,与人、鼠Wnt10a的氨基酸序列同源性均为26%,推测为血吸虫的Wnt10a基因,命名为Sjwnt10a(Gen BanK登录号DQ643829)。利用实时荧光定量PCR分析该基因在日本血吸虫不同发育阶段虫体中的表达情况,结果显示该基因在19日龄的日本血吸虫童虫中表达量最高,在14日龄童虫和44日龄雄虫中也有表达,但分别仅为19日龄童虫表达量的8.8%和5.0%,而在31日龄成虫和44日龄雌虫中没有检测到该基因。结果提示,童虫差异表达的Sjwnt10a基因可能对童虫的生长、发育至关重要。     

番鸭呼肠孤病毒YB株μA基因的克隆分析与原核表达

为了对番鸭呼肠孤病毒(MDRV)μA基因进行克隆分析和原核表达,本研究设计了1对特异性引物,对MDRV-YB株的μA基因进行RT-PCR扩增,扩增产物经过双酶切后克隆到p ET-32a(+)载体中,经测序验证成功后,将重组质粒转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞中,进行IPTG诱导表达及条件优化。随后对表达产物进行SDS-PAGE以及W estern-blot分析。结果显示,成功构建了包含MDRV-YB株A基因的原核重组质粒,并获取了A蛋白的基因序列。序列分析结果显示,MDRV-YB株μA基因CDS大小为2 199 bp,负责编码732个氨基酸,该基因核苷酸序列与传统MDRV的同源性为83.8%~99.7%,与新型鸭源呼肠孤病毒(NDRV)的同源性约为82.5%,与鹅源呼肠孤病毒(GRV)同源性为80.9%,而与禽(鸡源)呼肠孤病毒(ARV)的同源性仅为73.1%;进化树分析μA基因的结果显示,MDRV-YB株属于传统型呼肠孤病毒,该蛋白氨基酸序列中无潜在的信号肽序列,6个潜在的N-糖基化位点以及45个磷酸化位点;SDS-PAGE分析表明,目的蛋白为分子质量约为99.7 ku的融合蛋白,主要以包涵体形式存在,其IPTG最佳诱导温度为33℃,浓度为0.8 mmol/L,时间为6 h;Western-blot结果显示,表达的目的蛋白能与抗MDRV阳性血清发生特异性反应,表明其具备良好的反应原性。本研究为进一步探索MDRV μA蛋白功能奠定了基础。     

维氏气单胞菌胞外产物HisJ基因的克隆与生物信息学分析及原核表达

为研究维氏气单胞菌胞外产物HisJ基因的可能相关功能,扩增HisJ基因,并通过同源性比较构建HisJ基因的系统进化树,利用相关软件对HisJ基因编码的蛋白进行生物信息学分析,并对HisJ基因进行原核表达以及表达产物的免疫原性进行检测。结果显示,HisJ基因全长774 bp,编码247个氨基酸,TH0426株HisJ与维氏气单胞菌属同一分支,具有信号肽、跨膜区,属于膜外蛋白,二级结构主要以α螺旋、无规则卷曲为主。经SDS-PAGE分析发现,重组菌可表达出融合性蛋白,并且以10‰的体积接菌、IPTG终浓度为1.0mmol/L诱导8 h表达效果最好。Western-blot分析结果显示,重组HisJ蛋白在大肠杆菌中被成功表达且能被小鼠抗HisJ蛋白血清识别,表明表达的HisJ蛋白具有一定的免疫原性。为进一步对HisJ蛋白的结构功能及与致病性、耐药性关系的研究奠定了基础。     

塞内加谷病毒VP1蛋白的表达纯化及鉴定

为表达并纯化塞内加谷病毒(Senecavirus A,SVA)的VP1蛋白,克隆SVA的VP1基因,测定其序列并构建遗传进化树,分析VP1蛋白氨基酸突变位点并预测其二级结构。然后将VP1基因克隆至载体pET-32a(+)中,IPTG诱导表达VP1重组蛋白,用Ni-NTA亲和层析柱纯化并用W estern-blot进行验证。结果显示,表达的VP1重组蛋白的大小为48 ku,主要以包涵体形式存在,能与抗His标签的单克隆抗体发生特异性免疫反应。结果表明成功表达并纯化出VP1重组蛋白。     

杜氏利什曼原虫NH36基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

应用RT-PCR技术扩增并克隆杜氏利什曼原虫(Leishmania donovani)NH36编码基因,经鉴定及序列分析,构建其原核重组表达载体,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western-blotting鉴定其表达产物。结果显示,获得的NH36开放阅读框为945 bp,编码314个氨基酸残基,与GenBank上发表的国际标准株NH36编码基因序列以及氨基酸序列同源性分别为88.57%(837/945)和89.17%(280/314)。表达蛋白为36 ku,经1 mol/L IPTG诱导6 h后的表达量最高;薄层扫描显示表达的蛋白占菌体蛋白总量的57%;该蛋白可被抗杜氏利什曼原虫的多克隆抗体血清识别。     

鹅IFN-α基因的高效表达

通过对鹅IFN-α成熟蛋白基因的分析,利用在线软件,将序列中稀有密码子改为优势密码子,优化了密码子适应性指数,更多地采用了利于表达的密码子对,优化了表达的起始区域和终止区域mRNA的二级结构及自由能.然后,将人工合成的鹅IFN-α基因与表达载体pWL连接后诱导表达.SDS-PAGE分析表明,所表达蛋白的分子质量为18.83 ku,蛋白表达量占菌体总蛋白的35.3%.表达产物以包涵体形式存在.复性、纯化后的鹅IFN-α重组蛋白的纯度达98%,活性达1.28×107U/mL.     

惠阳胡须鸡Ⅱ型干扰素基因在毕赤酵母中的表达及其产物活性分析

为了确定惠阳胡须鸡IFN-γ基因(chIFN-γ2)在毕赤酵母中表达的重组蛋白的抗病毒活性和蛋白的二级结构,将pGEM-T-chIFN-γ2重组质粒中的chIFN-γ2基因克隆到表达质粒pPICZαB上,经酶切鉴定、PCR鉴定和测序后的序列同源性分析,证明目的基因没有发生缺失、突变,并且插入方向正确。将重组质粒电转化到毕赤酵母感受态细胞GS115中,阳性转化子经甲醇诱导表达,获得了高效分泌表达。重组IFN-γ的分子质量约为33 ku,表达量达0.604 mg/mL,在鸡胚成纤维细胞(CEF)上抑制VSV的抗病毒活性为3.2×104U/mg。圆二色性分析表明,IFN-γ酵母重组蛋白属于典型的α螺旋蛋白,二级结构含量为:α螺旋55.1%,β折叠8.3%,转角13.9%,无规卷曲22.8%。采用毕赤酵母分泌表达了有活性的鸡IFN-γ,并首次证明鸡IFN-γ重组蛋白属于典型的α型蛋白。