旋毛虫感染对小鼠脾树突状细胞吲哚胺2,3-双加氧酶表达的影响

为探讨小鼠感染旋毛虫后脾来源的树突状细胞在不同时间点吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)的表达情况,将一定量旋毛虫肌幼虫经口感染小鼠,感染剂量为每只300条肌幼虫,并设立对照组.分别在感染后第7、15、25、35、50天处死小鼠取脾,用免疫磁珠分选CD11c+树突状细胞,实时荧光定量PCR检测IDO、IL-10、IFN-γ...     

口疮病毒GIF蛋白的原核表达及对小鼠免疫细胞的影响

探究口疮病毒GIF蛋白对小鼠骨髓源树突状细胞成熟及Na?ve CD4~+T细胞极化作用的影响。原核表达口疮病毒GIF蛋白,用纯化后的蛋白刺激小鼠树突状细胞,利用流式细胞术检测细胞表面分子的表达情况,ELISA方法检测细胞培养上清中细胞因子IL-12P40、TNF-α、IL-10、IL-1β的分泌情况。将Na?ve CD4~+T细胞与经不同质量浓度的GIF蛋白刺激后的树突状细胞共培养,用ELISA检测该树突状细胞对Na?ve CD4~+T细胞的免疫刺激能力,并进一步检测培养上清中IFN-γ和IL-5的分泌水平。结果显示,成功克隆了ORFV117基因,表达了羊口疮病毒GIF蛋白。经不同质量浓度蛋白刺激后,树突状细胞的表面共刺激分子CD86、CD40的表达水平均明显升高,其中5μg/mL蛋白刺激后,MHCⅡ表达水平显著升高,IL-12P40、TNF-α、IL-1β、IL-10释放水平显著升高。经不同质量浓度的GIF重组蛋白刺激后的树突状细胞对Na?ve CD4~+T细胞的刺激能力增强,淋巴细胞共培养上清中IFN-γ分泌量显著增加。这表明一定质量浓度的口疮病毒GIF蛋白能促进小鼠骨髓源树突状细胞的成熟,能够激活抗原递呈作用,并且具有刺激T细胞分化的能力。     

旋毛虫ES抗原对小鼠巨噬细胞TLR2/4mRNA表达的影响

为探讨旋毛虫ES抗原对RAW264.7细胞TLR2/4mRNA表达的影响,分别取经0、2、5、15、30、45μg/mL ES抗原作用24h的RAW264.7细胞和用15μg/mL ES抗原作用0、3、6、12、18、24h后的RAW264.7细胞,采用半定量PCR方法检测TLR2和TLR4mRNA的表达水平变化。结果显示,随着ES抗原浓度的升高,TLR2/4mRNA的表达量逐渐上升,15μg/mL ES抗原组与空白对照组相比差异显著(P<0.05)。在15μg/mL ES抗原作用24h内,随着作用时间的延长,TLR2/4mRNA的表达量逐渐上升,作用18h后的表达水平升高,且与空白对照组差异显著(P<0.05)。证实,ES抗原可刺激RAW264.7细胞表面受体TLR2/4表达升高,且存在一定的剂量和时间效应。     

羊口疮病毒ORFV129蛋白对树突状细胞成熟和功能的影响

为了探讨羊口疮病毒ORFV129蛋白对小鼠骨髓树突状细胞(DCs)生物免疫学功能的影响,从小鼠骨髓腔中分离获得单核细胞,诱导分化为未成熟DCs并用不同浓度的ORFV129蛋白进行刺激,采用流式细胞术检测成熟DCs的表面标记物MHC-Ⅱ、CD40等表达及吞噬FITC-dextran的能力,以及检测ORFV129蛋白作用DCs后分泌IFN-γ、IL-6等细胞因子的水平;采用CCK8法检测ORFV129蛋白对DCs刺激T细胞增殖的影响以及检测培养上清中IFN-γ、IL-5的水平。结果显示,经10μg与5μg浓度的ORFV129蛋白作用24 h后,DCs表面分子CD80、CD40的表达显著上调,与未处理组相比差异显著(P0.05);经ORFV129蛋白刺激后DCs吞噬FITC-dextran的能力下降;10μg的ORFV129蛋白极显著地促进了IFN-γ、IL-6、IL-12p40等细胞因子的表达,与空白组相比差异极显著(P0.01);另外,经ORFV129蛋白处理的DCs还可刺激T细胞增殖,以及使培养上清中IFN-γ的分泌量显著增加。ORFV129蛋白可上调DCs表面MHC-Ⅱ、CD40、CD80和CD86分子表达,降低其吞噬能力,促进DCs分泌IFN-γ、IL-6、IL-10、IL-12p40等细胞因子,还可刺激T细胞增殖,表明ORFV129蛋白对DCs的成熟起到促进作用。     

太子参茎叶多糖对小鼠脾淋巴细胞因子含量及对细胞因子和转录因子mRNA表达量的影响

为研究太子参茎叶多糖(Radix pseudostellariae stem and leaf polysaccharides,RPSLP)对小鼠脾淋巴细胞因子含量及对细胞因子和转录因子mRNA表达量的影响。将RPSLP添加到体外分离培养的淋巴细胞中,用ELISA法检测细胞因子IL-2、IL-4、IL-6、IFN-γ、TNF-α含量;RT-PC R法检测上述细胞因子以及转录因子T-bet、G ATA-3的mRNA表达量。检测结果表明,添加RPSLP后在3.125~50 g/m L浓度范围内可显著促进细胞因子IL-2、IL-4、IL-6、IFN-γ、TNF-α的分泌及其mRNA的表达(P0.05),并能调控T-bet、GATA-3的mRNA表达,使T-bet/GATA-3比率处于动态平衡。上述结果说明,RPSLP可以通过调控细胞因子mRNA表达来改变分泌量,对小鼠脾淋巴细胞起免疫调节作用。     

感染旋毛虫后小鼠腹腔巨噬细胞NOD1样受体及相关细胞因子的表达动态分析

为了解感染旋毛虫后宿主巨噬细胞NOD1受体及其信号通路中关键分子与相关细胞因子的表达动态,将一定量旋毛虫肌幼虫经口感染小鼠,在感染后第0.5、4、7、14、21、28、35天分别取小鼠腹腔巨噬细胞,应用荧光定量PCR检测细胞中NOD1、RIP2、NF-κB mRNA表达量,Western-blot测定NOD1、RIP2、NF-κB蛋白表达量,ELISA测定细胞培养上清及血清中TNF-α、IL-1β和IL-6的质量浓度。荧光定量PCR结果显示,感染旋毛虫后巨噬细胞中NOD1、RIP2、NF-κB的mRNA表达量变化趋势基本一致,均呈现"升高-降低-升高-降低-平稳"的态势,且分别在感染后第4和21天各具有1个mRNA表达量峰值,在第28～35天时mRNA水平降低并趋向稳定。Western-blot结果表明,NOD1、RIP2和NF-κB p-p65的蛋白质量浓度变化趋势与其mRNA表达量检测结果基本一致。ELISA结果显示,感染小鼠腹腔巨噬细胞培养上清和小鼠血清中TNF-α、IL-6的质量浓度与对照组相比变化明显(P0.01,P0.05),变化趋势与NOD1、RIP2和NF-κB的变化相似,IL-1β的质量浓度变化程度不明显。结果表明,旋毛虫感染可以引起小鼠NOD1受体的激活,在旋毛虫生活史的特定时期上调NOD1受体通路中关键分子RIP2和下游分子NF-κB的表达,促进细胞因子TNF-α和IL-6的分泌。试验证明,宿主NOD1受体参与了旋毛虫感染引起的免疫应答,为防治旋毛虫病和理解旋毛虫对宿主的感染机制提供了新的思路。     

复方苦芩对小鼠免疫功能及犬IL-4 mRNA和IFN-γ mRNA表达的影响

为了探讨复方苦芩对免疫低下小鼠免疫功能和对犬细胞因子IL-4mRNA、IFN-γmRNA表达的影响,将120只小鼠随机分为空白对照组、模型组(环磷酰胺造免疫低下小鼠模型,不给药)、阳性药物对照组(黄芪多糖注射液)、复方苦芩制剂高、中、低剂量组,连续给药7d,给药后,除空白对照组外,各组腹腔注射环磷酰胺0.2mL(80mg/kg)制造免疫低下模型,1次/d,共3d。于末次给药后第1小时,测定碳粒廓清指数、脾指数、胸腺脏器指数及T、B淋巴细胞转化率;建立犬细小病毒模型,用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)法观察复方苦芩对犬细胞因子IL-4mRNA、IFN-γmRNA表达的影响。结果显示,复方苦芩能增加小鼠脾指数和胸腺指数,明显增加T、B淋巴细胞的转化率和碳清值,降低犬细小病毒引起的犬血清细胞因子IL-4含量及其mRNA表达的增加,升高犬细小病毒引起的犬血清IFN-γ含量及其mRNA表达的降低。结果表明,复方苦芩具有增强小鼠非特异性免疫功能,降低犬血清细胞因子IL-4含量及其mRNA的表达,升高犬血清IFN-γ含量及其mRNA的表达的作用。     

两种旋毛虫丝氨酸蛋白酶抑制剂对小鼠免疫保护效果的评估

为评估旋毛虫丝氨酸蛋白酶抑制剂对BALB/c小鼠的免疫保护作用,选用2种重组表达的Serpin型和Kazal型旋毛虫丝氨酸蛋白酶抑制剂（TsAdSPI和TsKaSPI）,联合弗氏佐剂通过腹腔注射的方式单独免疫小鼠,用间接ELISA法检测免疫后小鼠特异性血清抗体Ig G以及Ig G亚型（IgG1和Ig G2a）的水平,用CCK-8法测定重组蛋白刺激后脾淋巴细胞的增殖情况,用ELISA法检测脾淋巴细胞培养液上清中细胞因子IFN-γ、IL-10、IL-12和IL-4的水平;使用旋毛虫肌幼虫攻击感染免疫后的小鼠,计算并分析小鼠肠道成虫减虫率及肠道病理变化,并评估TsAdSPI和TsKaSPI与ISA206佐剂联合免疫小鼠后对小鼠肠道成虫减虫率的影响。结果表明,与PBS组相比,2种重组蛋白所诱导的Ig G和Ig G亚型抗体水平均明显升高,IL-12、IFN-γ、IL-4和IL-10表达水平也均显著升高,且重组蛋白可诱导免疫小鼠脾淋巴细胞的体外增殖;攻虫结果表明,2种重组蛋白免疫后小鼠肠道旋毛虫成虫数量较PBS组显著减少且肠道病理变化减轻;2种重组蛋白联合免疫组的成虫减虫率高于单独免疫组。上述结果...     

羟乙基化猴头菇多糖对小鼠树突状细胞和自然杀伤细胞相互作用的影响

本研究旨在制备羟乙基化猴头菇多糖,考察羟乙基化猴头菇多糖对树突状细胞(DCs)与自然杀伤细胞(NKs)相互作用的影响。以环氧乙烷为羟乙基化试剂,对猴头菇多糖进行羟乙基化。并采用RT-PCR和Western-blot探索猴头菇多糖(HEP)和羟乙基化猴头菇多糖(HE-HEP)分别与DCs和NKs共同孵育后对细胞免疫因子mRNA表达的影响。结果表明,HEP和HE-HEP可以使IL-12、IL-15、IL-18、NF-κB、NKG2D、TNF-α、IFN-γ和GM-CSF的mRNA表达上调。31.25 g/mL、62.5 g/mL的HE-HEP对IL-12、IL-15、IL-18、NF-κB的mRNA表达方面的效果优于HEP,并且62.5 g/mL、125 g/mL的HE-HEP对NKG2D、TNF-α、IFN-γ和GM-CSF的mRNA表达方面的效果优于HEP。结果表明,羟乙基化修饰可以显著增强猴头菇多糖对DCs和NKs之间的相互作用,提高其免疫活性。     

黄芪总黄酮对脂多糖体外诱导的RAW264.7细胞的细胞因子和NO分泌水平的影响

为了研究黄芪总黄酮(TFA)的体外抗炎作用,通过脂多糖体外诱导小鼠RAW264.7细胞建立炎症模型,采用MTT法检测黄芪总黄酮的细胞毒性作用,用ELISA检测细胞上清液中IL-6、IFN-γ、IL-1β及TNF-α水平,采用Griess法检测细胞内NO表达水平。MTT结果显示,10~100μg/mL TFA对RAW264.7细胞没有明显的毒性作用。与模型组比较,10、25、100μg/mL TFA均能抑制RAW264.7细胞过量分泌IL-6、IFN-γ、IL-1β、TNF-α及NO,且呈一定的量效关系。本试验结果表明黄芪总黄酮具有体外抗炎活性。     

旋毛虫P49和P53ES抗原基因的真核表达

将构建的重组质粒pEGFP-N1-P49和pEGFP-N1-P53同时进行双酶切,回收P53基因片段和pEGFP-N1-P49载体,再将P53基因片段重组到pEGFP-N1-P49中,构建旋毛虫ES抗原P53和P49融合基因的真核表达载体pEGFP-N1-P49-P53,利用脂质体法将其转染哺乳动物细胞COS-7。于转染后第24小时在荧光显微镜下观察到发绿色荧光的转基因细胞;Western-blot分析证实目的基因的表达产物具有抗原性。结果表明,成功构建了含有旋毛虫ES抗原P53和P49融合基因的真核表达载体pEGFP-N1-P49-P53,并在COS-7细胞中表达了目的蛋白,并且表达的蛋白可被感染旋毛虫小鼠阳性血清特异地识别。     

黄芪颗粒对DON致BALB/c小鼠免疫损伤的保护作用

为探讨黄芪颗粒对脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)致BALB/c小鼠免疫抑制的保护作用,将48只BALB/c小鼠随机均分为空白对照组、黄芪对照组、DON组和黄芪-DON组。黄芪对照组和黄芪-DON组提前1周在饮水中添加黄芪颗粒(0.02 g/mL),连续5周;DON组和黄芪-DON组灌喂DON 2.4 mg/(kg·d),连续28d。每天观察体质量、采食量、脏器系数、病理组织学、血液学指标等的变化;采用ELISA试剂盒测定血清IL-1β、IL-2、IFN-γ、TNF-α、TGF-β水平变化,用实时荧光定量PCR检测上述细胞因子基因mRNA的表达,并采用流式细胞术检测脾CD4~+、CD8~+、CD3~+、CD19~+T细胞。结果显示,黄芪-DON组的体增重、采食量和脾系数显著高于DON组(P0.05),肝系数、肾系数显著减小(P0.05);通过病理组织切片观察,发现黄芪-DON组肝、肾的病变程度明显低于DON组;黄芪-DON组CD4+/CD8~+、CD19~+和血清IL-2、TNF-α、IFN-γ、TGF-β水平均显著高于DON组(P0.05),脾中IL-2、IFN-γ、TGF-β基因mRNA的表达量也显著高于DON组(P0.05)。结果表明,黄芪颗粒能明显减轻DON所致肝、肾损伤,缓减DON诱导的免疫抑制,可显著提升机体的免疫水平。     

负载灭活口蹄疫病毒树突状细胞活化CD8+T细胞的非蛋白酶体依赖途径

为研究树突状细胞加工和呈递灭活口蹄疫病毒(FMDV)抗原并活化CD8+T细胞的途径,用灭活FMDV负载经抑制剂预处理的小鼠单核细胞源树突状细胞(MoDCs),与CD8+T细胞共培养,对照为负载FMDV的正常MoDCs与CD8+T细胞.收集上清液,检测γ干扰素(IFN-γ)的含量.结果显示,试验组CD8+T细胞在共培养的...     

鸡枞菌多糖对小鼠T细胞免疫功能的影响

采用鸡枞菌多糖(TAP)体外作用于小鼠T淋巴细胞,用ELISA法检测其IL-4、IFN-γ及IL-2水平,流式细胞仪检测T淋巴细胞亚群,RT-PCR法检测相关细胞因子mRNA表达量,观察研究了鸡枞菌多糖对小鼠T细胞免疫功能的影响。结果表明,与ConA组相比,25～100μg/mL TAP在作用72h内均能显著促进T细胞产生IL-4、IFN-γ及IL-2(P<0.01);25μg/mL TAP作用48h后可显著降低被ConA激活的T细胞CD4+%(P<0.01),升高CD8+%(P<0.05),并降低CD4+/CD8+(P<0.05);50μg/mL TAP则可显著升高CD3+%(P<0.01);50μg/mL TAP在作用72h内能显著提高IL-2、IL-4及IFN-γmRNA表达量(P<0.01),并使其保持较高水平。提示,TAP对细胞免疫功能具有显著增强作用,T淋巴细胞是TAP的靶细胞之一。     

旋毛虫TsGLS和TsGAD重组蛋白免疫保护作用的研究

为了评价旋毛虫TsGLS、TsGAD重组蛋白诱导小鼠的免疫保护效果,将TsGLS、TsGAD、TsGLS+TsGAD重组蛋白分别与佐剂混匀免疫BALB/c小鼠后,检测血清中特异性抗体水平变化,并检测重组蛋白体外刺激小鼠脾淋巴细胞所产生的细胞因子水平;在强化免疫小鼠后,通过攻虫试验检测并比较7 d成虫和35 d肌幼虫减虫率,以及免疫小鼠在攻虫后第7、14、21、35天产生的细胞因子水平。结果,各试验组小鼠血清中IgG1(Th2)为主的抗体水平上升,而且IL-4和IL-10水平在攻虫后第14天达到最高,IFN-γ和IL-12水平在攻虫后第7天达到最高。攻虫试验后TsGLS组、TsGAD组、TsGLS+TsGAD组的小鼠中旋毛虫成虫和肌幼虫减虫率分别为35.55%、49.24%、37.34%和47.05%、60.01%、46.55%。上述研究结果表明,TsGLS和TsGAD重组蛋白均能诱导小鼠获得免疫保护效果,且TsGAD重组蛋白免疫效果更佳。     

表达猪流行性腹泻病毒中和抗原位点的重组干酪乳杆菌免疫小鼠诱导的免疫应答

为研究猪流行性腹泻病毒中和抗原位点(COE)基因在乳酸菌中的表达情况,进而探讨重组乳酸菌的免疫原性。将COE基因插入干酪乳杆菌细胞表面表达载体pPG-1中,构建重组表达载体pPG-1-COE,并将其电转化入干酪乳杆菌Lactobacilluscasei393中,应用Western-blotting、间接免疫荧光染色和全细胞ELISA检测重组蛋白的表达情况,用重组干酪乳杆菌口服免疫小鼠,测定免疫应答水平。结果表明,COE可在构建的重组干酪乳杆菌表达系统中表达,目的蛋白定位于细胞表面。在免疫组小鼠血清、粪便中检测到较高水平的特异性IgG、sIgA(P0.01);血清具有中和活性(1∶12);脾淋巴细胞增殖指数明显高于对照组,IL-4和IFN-γ水平显著提高(P0.01)。证实,该重组干酪乳杆菌表达系统可诱导小鼠产生对猪流行性腹泻病毒特异的黏膜免疫应答和系统免疫应答。     

山羊IFN-γ和TNF-α基因SYBR GreenⅠ实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用

根据GenBank中山羊γ-干扰素(IFN-γ)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的基因序列,设计特异引物扩增目的基因。将IFN-γ、TNF-α基因克隆至p MD-19-T载体,得到各自阳性克隆质粒,以2种阳性质粒为标准品建立标准曲线并进行熔解曲线分析以及灵敏性、特异性和重复性试验。应用所建立的方法检测刀豆蛋白A(Con A)刺激健康山羊外周血单核细胞(PBMC)后不同时间点IFN-γ、TNF-α基因转录量。结果表明,当质粒标准品稀释度为1×10~9copies/L~1×10~5copies/L时,扩增曲线的Ct值与浓度间具有良好的线性关系,相关系数分别为0.999和1.000;熔解曲线分析表明,产物为特异性单峰且重复性较好。IFN-γ在第2小时和第48小时这两个时间点出现mRNA转录高峰,在第2小时检测到IFN-γ转录量为1.26×10~5copies/L,第48小时检测到转录量为8.56×10~4copies/L;TNF-α在0~24 h呈现下调的表达趋势,第48小时出现mRNA转录高峰,转录量为2.73×10~5copies/L;研究结果将为IFN-γ、TNF-α的定量分析提供技术平台。     

鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白FliC的表达纯化及其生物学特性的研究

为研究鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白FliC的生物学特性,利用PCR方法扩增鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白FliC基因,构建重组表达质粒p ET-32a-FliC,经大肠杆菌Rosetta(DE3)表达、镍离子亲和层析法纯化后用SDS-PAGE和Western-blot方法分析。重组蛋白与巨噬细胞RAW264.7共孵育,ELISA和CCK-8法分别检测巨噬细胞细胞因子和巨噬细胞增殖情况。重组蛋白免疫小鼠后不同时间点检测血清抗体效价和细胞因子水平。结果显示,鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白FliC在大肠杆菌中呈可溶性表达,且可获得纯度较高的重组鞭毛蛋白。50 ng/m L和500 ng/m L重组鞭毛蛋白可刺激巨噬细胞增殖,同时促进巨噬细胞分泌IL-1、IL-4、IL-6、IL-8、IFN-γ和TNF-α。重组蛋白免疫小鼠后效价在第3周达到1∶128 000,同时小鼠血清细胞因子的分泌量呈倒V型变化。研究结果为后续进一步研究FliC蛋白在细菌感染、侵袭和免疫方面的作用研究提供了参考数据。     

旋毛虫感染小鼠后TNF-α诱导心肌细胞凋亡的试验观察

为探讨旋毛虫致小鼠心肌损伤发生的主要致病因子及其信号传导途径,分别取感染前后不同时期小鼠心肌,应用半定量RT-PCR法检测心肌中炎性细胞因子TNF-α及细胞凋亡与抗凋亡基因mRNA表达量,并应用TUNEL法对心肌细胞凋亡形态进行了检测。结果显示,旋毛虫感染后第9天,TNF-αmRNA的相对表达量由感染前的0.02迅速增加到0.88,心肌细胞凋亡增加,凋亡指数为10.70%;TNF-α表达量约于感染后第19～24天达到峰值,此时凋亡指数达29.79%,细胞凋亡明显(P<0.05);第42天TNF-α表达量逐渐下降至0.29,细胞凋亡逐渐减少,凋亡指数降至10.46%。TNFR 1、FADD、Caspase 8和Caspase 3mRNA的相对表达量的变化趋势与TNF-α相似。     

猪流感病毒NS1蛋白关键氨基酸位点突变对蛋白定位及细胞因子水平的影响

为探析猪流感病毒NS1蛋白中影响细胞定位和拮抗干扰素表达的关键氨基酸位点,本研究利用点突变技术扩增A/swine/Shanghai/1/2007(H1N2)分离株NS1突变基因,并构建重组表达质粒pCAGGS-NS1及突变体pCAGGS-NS1_(S42P)、pCAGGS-NS1D_(92E)、pCAGGS-NS1_(S42P/D92E)。将重组真核表达质粒转染细胞,SDS-PAGE和Western-blot均证实NS1蛋白及其突变体蛋白在A549和293T细胞中成功表达。间接免疫荧光试验表明,NS1及其突变体蛋白均主要分布在A549细胞核中,仅有少量分布于细胞浆。此外,试验证明另一株A/swine/Shanghai/3/2014(H1N1)分离株的NS1及其突变体蛋白也主要分布于细胞核中,说明点突变不影响SIV NS1蛋白的细胞定位。进一步利用荧光定量PCR和ELISA方法检测A/swine/Shanghai/1/2007(H1N2)分离株NS1点突变蛋白拮抗细胞中干扰素表达的影响,结果表明,pCAGGS-NS1_(S42P)转染组能够明显增强IFN-βmRNA、IFN-αmRNA转录水平(P0.01;0.01P0.05),但对TNF-αmRNA转录水平无明显影响(P0.05)。而pCAGGS-NS1D_(92E)和pCAGGS-NS1S_(42P/D92E_转染组细胞IFN-α、IFN-β和TNF-αmRNA转录水平均无明显变化(P0.05)。试验证实NS1蛋白第42位氨基酸对拮抗宿主细胞中IFN-α/β表达具有重要作用。