柔嫩艾美耳球虫NADP特异性谷氨酸脱氢酶特性分析

为了研究柔嫩艾美耳球虫NADP特异性谷氨酸脱氢酶(EtNADP-GDH)的分子特性,对该基因进行了克隆和生物信息学分析,利用间接免疫荧光定位、体外入侵抑制、实时荧光定量PCR、Western-blot和体外酶活性检测等方法分析其生物学特性。结果显示,成功获得了EtNADP-GDH基因,该基因编码的蛋白富含包括NAD结合位点在内的多种功能位点。该蛋白主要分布在虫体的表面和细胞质中,抗rENADP-GDH多克隆抗体能抑制子孢子入侵DF-1细胞,抑制率约为45%,表明其参与了虫体入侵宿主细胞。荧光定量PCR结果显示,该基因在未孢子化卵囊阶段的转录水平最高;转录、翻译水平分析发现,与敏感株相比,2个耐药株(地克珠利耐药株和马杜拉霉素耐药株)中EtNADP-GDH的转录水平显著提高,而翻译水平无明显差异;酶活性分析结果显示,耐药株和敏感株差异不明显。结果表明,该蛋白可能对虫体在宿主细胞内的生长发育起作用并参与了子孢子入侵宿主细胞的过程。     

乳酸菌复合制剂对柔嫩艾美耳球虫感染雏鸡免疫水平的影响及免疫保护效果评价

为探究乳酸菌等益生菌在雏鸡抗柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)感染中的作用,本研究以150只1日龄肉雏鸡为试验动物,以2×10~8CFU/200 L鼠李糖乳杆菌、乳酸片球菌和植物乳杆菌复合制剂饲喂雏鸡,并设红、白对照组。于攻虫前后检测细胞因子IFN-γ和IL-2、IgG和SIgA水平,雏鸡血液中淋巴细胞增殖情况和外周血CD4~+和CD8~+T淋巴细胞数量,并对攻虫期间增重情况、卵囊排出数量和盲肠病变情况进行检测。结果显示,该制剂显著提高了IFN-γ、IL-2、IgG、SIgA水平和外周血中T淋巴细胞数量,从而增强了机体细胞和体液免疫水平(P0.05)。此外,该制剂可以显著减轻球虫感染对雏鸡增重的影响,降低卵囊排出量和盲肠病理损伤(P0.05),ACI值达到中等抗球虫效果,有望成为鸡球虫病新的防治手段。     

鸡柔嫩艾美耳球虫活虫苗免疫预防的研究

鸡柔嫩艾美耳球虫活虫苗免疫预防的研究陈明勇蒋金书汪明（中国农业大学动物医学院北京１０００９４）鸡球虫病是一种危害极大、世界性分布的寄生性原虫病，常给养鸡业带来巨大的经济损失。对该病的药物防治常因抗球虫药物耐药周期的日益缩短、药物更新缓慢及生产费用的增...     

安徽省五株柔嫩艾美耳球虫的RAPD分析

通过比较柔嫩艾美耳球虫敏感株与耐药株之间DNA条带的差异来分析耐药性,寻找鸡球虫耐药性虫株的分子标记。采用随机扩增多态性DNA(RAPD)技术对安徽省阜南、舒城、和县、全椒、凤台这5个地区的柔嫩艾美耳球虫和2株敏感株进行遗传多样性分析,同时用5种常用抗球虫药分别对这5个野外分离株进行鸡体试验,5个虫株对上述5种药物均有不同程度的耐药性。RAPD结果显示:5个样品都有相似而清晰的主带,每个泳道有1~25条带不等,大小为2 kb以下。南京敏感株与上海敏感株之间的相似性最高,为78.57%,全椒株与和县株最低且上海敏感株和凤台株最低,均为40.00%,其余虫株之间的相似性处于两者之间,株间平均值为53.85%。5个地理株与2个敏感株之间的SI值也处于较低水平,表明耐药虫株的基因处于较高的变异水平,存在丰富的遗传多样性。     

杀球灵抗柔嫩艾美耳球虫的效力观察

我们受比利时杨森制药公司(Janssen Phar-maceutica)的委托,对该公司最近研制的杀球灵进行抗柔嫩艾美耳球虫效力试验,并进一步确定本品对中国北京白鸡的柔嫩艾美耳球虫虫株的抗球虫效果。(一)材料和方法1.试验药物:(1)杀球灵(Diclazuril):由比利时杨森公司提供,使用浓度为1ppm。(2)莫能菌素(Monensin):由北京农业大学生物学院提供,使用浓度为110ppm。(3)氨丙啉(Amprolium):系上海第二药厂生产,使用浓度为125ppm。     

柔嫩艾美耳球虫感染对雏鸡肠道紧密连接相关蛋白表达的影响

为研究柔嫩艾美耳球虫感染对雏鸡肠道黏膜上皮组织Occludin和Claudin-1表达的影响,给14日龄雏鸡经嗉囊接种2×104个柔嫩艾美耳球虫的孢子化卵囊,分别于感染后第0、4、7、14和21天采集小肠和盲肠样本。用荧光定量PCR和Western-blotting分析感染后不同时间点雏鸡肠道黏膜上皮组织Occludin和Claudin-1的表达水平变化。结果显示:在m RNA水平上,相较于第0天,感染后第4天盲肠Occludin表达量极显著上升(P0.01),第7天则显著下降(P0.01),第14和21天表达量逐渐回升,但均无显著差异(P0.05);Claudin-1的表达量呈先下降后上升的变化趋势,但均无统计学差异(P0.05)。在蛋白水平上,相较于感染后第0天,小肠和盲肠的Occludin均在感染后第4天显著上升(P0.05),在感染后第7天表达量显著下降(P0.05),第14和21天表达量则显著升高(P0.01);盲肠Claudin-1的表达量在第7天显著下降(P0.01),小肠Claudin-1在第21天则显著上升(P0.01)。结果表明,球虫感染后的裂殖生殖阶段可能会引起机体的抗损伤反应,使得Occludin的表达量显著上升,感染后第7天雏鸡肠道紧密连接蛋白Occludin和Claudin-1的表达量下降,是肠上皮屏障受损的标志。     

耐氯羟吡啶柔嫩艾美耳球虫株的鉴定

鸡球虫病的防治主要依赖于抗球虫药，但用药失败的现象时有发生，其中主要原因是耐药性虫株的出现。检测耐药虫株出现的时间及范围对指导合理用药，提高疗效极为重要。河北省张家口市某鸡场连续五年用氯羟吡啶防治鸡球虫病效果良好，但1993年夏用该药防治失败，爆发鸡球虫病，造成严重经济损失。现将从该场分离到的一株柔嫩艾美耳球虫耐氯羟吡啶株的鉴定过程报告如下。（一）材料和方法1.实验鸡:刚出壳的艾维茵雏鸡200只，饲养在火焰消毒的铁丝笼内，饲料经80℃干烤4小时，饮水煮沸消毒。至12日龄开始试验。2.药物：盐霉素（钙）预混剂，含…     

牦牛艾美耳球虫的研究

寄生于牛的艾美耳球虫,在国内仅有少数病例报告。关于牦牛艾美耳球虫的报告更为少见。1982年7月,我们在四川省阿坝藏族自治州红原县,对牦牛的球虫进行一些调查研究工作,现报告如下:     

柔嫩艾美耳球虫穿孔素样蛋白基因的原核表达与亚细胞定位

为了研究柔嫩艾美耳球虫(E. tenella)穿孔素样蛋白(Et PLP)在球虫感染中与宿主相互作用关系,首次成功获得EtPLP1(1 932 bp)和EtPLP2(4 215 bp)2个目的基因。通过表达纯化得到2个大小分别为37和67ku的目的蛋白,Western-blot结果显示其反应原性良好。通过免疫荧光技术,观察到EtPLP1定位在子孢子顶端。m RNA转录水平检测结果显示,EtPLP1在子孢子阶段的表达量最高,其次是第1代裂殖子阶段,EtPLP2m RNA水平在第1代裂殖子阶段表达量最高,其次是第2代裂殖子阶段;它们在其他阶段表达量极低或不表达。结果表明EtPLP1和EtPLP2可能参与虫体入侵与逸出宿主细胞,为EtPLPs蛋白功能研究奠定了基础。     

中药体外抗柔嫩艾美球虫的研究

根据中兽医学理论和鸡球虫病的特点选用中药组方,进行体外抗球虫试验.结果所用中药组方具有明显抑制未孢子化卵囊的孢子化过程,且对已孢子化卵囊具有杀灭作用.     

地克珠利对柔嫩艾美耳球虫SAG4表达的影响

建立地克珠利抗柔嫩艾美耳球虫感染鸡动物模型,收集获得柔嫩艾美耳球虫第2代裂殖子,采用PCR扩增柔嫩艾美耳球虫第2代裂殖子SAG4基因不含N端信号肽的编码序列,构建p ET-28a-SAG4表达质粒,转化至BL21(DE3)感受态细胞,用IPTG诱导表达融合蛋白,镍亲和层析柱法纯化蛋白,通过免疫BALB/c小鼠制备SAG4抗血清。用Real-time PCR检测SAG4 m RNA的表达,用Western-blot和免疫荧光技术检测SAG4蛋白的表达情况。结果显示,p ET-28a-SAG4表达的重组蛋白为可溶性蛋白,地克珠利显著降低了柔嫩艾美耳球虫第2代裂殖子SAG4基因m RNA和蛋白的表达。这提示SAG4基因可能与地克珠利抗球虫作用相关,这将为地克珠利抗球虫作用机理的阐述提供理论依据。     

柔嫩艾美耳球虫DF-1细胞培养体系的建立及应用

为了建立柔嫩艾美耳球虫的鸡胚成纤维传代细胞(DF-1)培养体系,并应用于柔嫩艾美耳球虫子孢子的细胞入侵活力检测,将CFDA-SE标记的子孢子接入DF-1细胞,利用流式细胞仪测定子孢子的细胞入侵活力。比较了37℃和41℃培养温度下,子孢子对DF-1、MDBK、Vero、BHK、MDCK五种细胞的入侵活力。优化了在子孢子入侵活力检测时,DF-1细胞最佳培养条件。结果表明,柔嫩艾美耳球虫子孢子在DF-1细胞中可发育为第一代裂殖子。在不同培养温度下,子孢子对DF-1细胞的入侵活力均高于其他细胞。优化后的DF-1细胞培养体系的培养程序为:用含100mL/L胎牛血清的DMEM稀释DF-1细胞,以每孔1×105个细胞铺被24孔板,37℃、50mL/L CO2培养24h后,用含50mL/L胎牛血清的DMEM换液后,每孔接入3×105个子孢子,41℃、50mL/L CO2培养8～12h,收集细胞进行检测。     

脆弱艾美耳球虫、波氏艾美耳球虫和堆型艾美耳球虫在培养细胞里的发育

在培养细胞里培养了鸡艾美耳球虫、波氏艾美耳球虫和堆型艾美耳球虫,观察了它们的生长形态和培养条件。已获得的结果摘要如下。 (一)脆弱艾美耳球虫在用孢子体接种的细胞培养中发育成卵囊,波氏艾美耳球虫发育到成熟的第二代裂殖体。没有发现处于生长期的堆型艾美耳球虫。 (二)在培养脆弱艾美耳球虫第二世代裂殖体时,只有少数裂殖子侵入培养细胞,不过没观察到进一步的发育。 (三)裂殖体区分为三种形态学类型。第一种类型的裂殖体跟在活体里发现的形态一样。第二种类型裂殖体的细胞质分裂成大小不一的团块。每一团块包含一个或较多的细胞核。第三种类型裂殖体同细胞里的孢子体相似,尽管它们在量度上比后者明显大些。它们有一个折光体,一个大细胞核和丰满的细胞质。 (四)在裂殖子形成过程中看到三种不同的方法。裂殖子是由第一种类型的裂殖体,第二种类型裂殖体的球形体和第三种类型裂殖体的球状物的表面分裂而形成的。 (五)在试管里培养脆弱艾美耳球虫的最适条件在于应用鸡肾细胞和含有0.2％酵母浸出物的No.199培养基,并置40℃培养。当应用鸡胚成纤维细胞和把培养物保存在Eagle's最小必需量培养基里并在40℃孵育波氏艾美耳球虫时取得了满意的结果。     

用柔嫩艾美耳球虫感染鸡胚测定和评价抗球虫药的效力

用柔嫩艾美耳球虫感染鸡胚测定和评价抗球虫药的效力１）张勤赵洪明２）张晋江３）李华风４）张华莹（河北省畜牧兽医研究所保定０７１０００）由于球虫对药物极易产生抗药性，所以大多数抗球虫药的使用期限都较短，这样就需要不断地研制新的抗球虫药。在抗球虫药的研究中...     

柔嫩艾美耳球虫SSADH基因的克隆原核表达与序列分析

为研究柔嫩艾美耳球虫琥珀酸半醛脱氢酶(SSADH)的生物学功能,参考已公布的柔嫩艾美耳球虫SSADH(EtSSADH)的基因序列设计特异性引物,运用RT-PCR方法扩增EtSSADH基因序列,将扩增产物克隆入pGEX-4T-1载体进行诱导表达。同时,利用在线软件对该基因编码蛋白的氨基酸序列进行生物信息学分析。结果显示,EtSSADH基因的ORF序列长1896 bp,编码631个氨基酸;该编码蛋白主要定位于线粒体,不含信号肽,无跨膜结构域;将EtSSADH与不同物种SSADH氨基酸序列进行比对,发现该蛋白氨基酸序列之间具有较强的保守性。诱导表达后获得分子质量约91.18 ku的重组蛋白。EtSSADH基因的成功克隆与表达为该酶的功能研究奠定了基础。     

柔嫩艾美耳球虫SSADH基因的克隆原核表达与序列分析

为研究柔嫩艾美耳球虫琥珀酸半醛脱氢酶(SSADH)的生物学功能,参考已公布的柔嫩艾美耳球虫SSADH(Et SSADH)的基因序列设计特异性引物,运用RT-PCR方法扩增Et SSADH基因序列,将扩增产物克隆入p GEX-4T-1载体进行诱导表达。同时,利用在线软件对该基因编码蛋白的氨基酸序列进行生物信息学分析。结果显示,Et SSADH基因的ORF序列长1 896 bp,编码631个氨基酸;该编码蛋白主要定位于线粒体,不含信号肽,无跨膜结构域;将Et SSADH与不同物种SSADH氨基酸序列进行比对,发现该蛋白的氨基酸序列之间具有较强的保守性。诱导表达后获得分子质量约91.18 ku的重组蛋白。Et SSADH基因的成功克隆与表达为该酶的功能研究奠定了基础。     

马杜霉素水溶剂抗鸡柔嫩艾美耳球虫的效力试验

马杜霉素水溶剂抗鸡柔嫩艾美耳球虫的效力试验张勤，刘素巧，李瑞学，张晋江，刘珏如（河北省畜牧兽医研究所保定０７１０００）（石家庄市动物检疫站）（河北省畜牧兽医站）马杜霉素（Ｍａｄｕｒａｍｙｃｉｎ）是一种新的聚醚类抗生素，属于离子载体型抗球虫剂。在这类抗...     

柔嫩艾美球虫对复方抗球虫制剂抗药性的诱导

柔嫩艾美球虫(Eimeriatenella)敏感株在复方抗球虫制剂剂量递增的情况下,经过10次传代,诱导出其对复方抗球虫制剂的抗药性;经过8次传代,诱导出柔嫩艾美球虫抗氯嗪苯乙氰株对复方抗球虫制剂的抗药性。与单一用药相比,柔嫩艾美球虫对复方抗球虫制剂的抗药性产生较慢,复方抗球虫制剂控制柔嫩艾美球虫敏感株的效果比控制抗氯嗪苯乙氰株的效果要好。     

柔嫩艾美球虫裂殖子的分离纯化

采用标准分样筛过滤、离心洗涤、差速离心和DEAE 5 2纤维素柱层析法对球虫裂殖子进行了纯化 ,并对不同填充高度的DEAE 5 2纤维素层析柱的纯化效果进行了比较。结果表明 ,采用填充高度为 14cm的层析柱分离纯化效果较好 ,操作程序较简单 ,从 30只鸡的盲肠黏膜中纯化裂殖子 1.85× 10 7个 ,平均每只鸡获得裂殖子 6 .17× 10 5个 ,所获得的裂殖子杂质极少 ,其纯度适用于mRNA差异显示等分子生物学研究。     

柔嫩艾美耳球虫杨凌株TA4基因的克隆和原核表达

根据国外报道的序列设计1对引物,以纯化的柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)杨凌(YL)株孢子化卵囊的总RNA为模板,用RT-PCR方法扩增出E.tenella YL株的TA4基因.序列分析表明,该序列全长741 bp,开放阅读框(ORF)为651 bp,共编码217个氨基酸,与E.tenella HT株、E.tenella BJ株和E.tenella ZJ株的TA4基因ORF序列同源性分别为99.8%、99.8%和99.27%.由此确定所获得的目的基因为E.tenella YL株TA4基因.利用生物信息学和分子生物学软件对TA4基因编码的蛋白进行结构预测,结果表明,该蛋白为一结构松散的球状蛋白.将TA4基因克隆到表达载体pET-32a中,构建重组质粒pET-TA4并在大肠杆菌BL21中进行表达,表达产物的SDS-PAGE分析结果表明,成功地表达了分子质量为41 ku的融合蛋白.