羧化胶乳凝集试验检测边缘无形体血清抗体的研究

利用边缘无形体可溶性抗原 ,以化学交联的方式致敏羧化胶乳制成胶乳抗原 ,成功地建立了一种检测牛边缘无形体血清抗体的胶乳凝集试验 (LAT)诊断方法。用制备的胶乳抗原分别检测瑟氏泰勒虫、双芽巴贝虫、衣原体、附红细胞体阳性血清 ,结果均为阴性 ;与边缘无形体标准阳性血清、免疫牛血清、流行区血清样品均呈明显的凝集反应。研究结果表明 ,LAT方法具有操作简单、快速、敏感性高、特异性强、成本低廉等优点 ,是一种特别适合于基层现场检测边缘无形体血清抗体的新方法。     

乳胶凝集试验检测猪伪狂犬病血清抗体的研究

用ＢＨＫ－２１细胞增殖猪伪狂犬病病毒（ＰＲＶ）鄂Ａ株,病毒培养上清液经硫酸铵沉淀、聚乙二醇浓缩后与等量经胰酶处理的乳胶制成凝集试验抗原。此抗原与伪狂犬病标准阳性血清、免疫猪血清和临床发病猪血清以及新鲜血清样品均呈现明显的凝集反应;与标准阴性血清和临床未感染ＰＲＶ的猪血清均不发生凝集反应;与猪瘟阳性血清、衣原体病阳性血清均呈阴性反应。证实所建立的乳胶凝集试验具有微量、简便、快速、敏感性高、特异性强的优点,可用于伪狂犬病抗体的定性和定量检测,特别适宜基层现场检疫应用。     

快速检测犬瘟热病毒的实时荧光RPA方法的建立

针对犬瘟热病毒(canine distemper virus,CDV)基因保守序列,设计特异性引物和荧光探针,并进行了敏感性和特异性试验,建立了CDV实时重组聚合酶等温扩增(real-time recombinase polymerase amplification,real-time RPA)检测方法。结果表明,该实时荧光RPA方法在39℃恒温反应25 min能特异性扩增目的基因,与其他犬病毒以及CDV同属的麻疹病毒均未出现交叉反应;该检测方法具有与RT-PCR一致的敏感性;通过对CDV阳性犬的组织样品、体表样品和不同时期分离鉴定的临床样本的检测,证实建立的实时荧光RPA方法具有良好的稳定性和可靠性。与现有的核酸检测方法相比,该实时荧光RPA检测方法在核酸上样25 min内即可判读结果,可满足CDV快速检疫的需要。     

狂犬病病毒抗体免疫金标检测试纸的制备及其应用

为了建立一种快速检测狂犬病病毒抗体水平的方法,用浓缩提纯的狂犬病病毒CVS11株作为胶体金标记抗原,以金黄色葡萄球菌A蛋白为检测线上的捕获抗原,制备狂犬病病毒抗体水平检测试纸条。应用该试纸条进行临床样品检测,结果表明,以稀释后的犬全血或血清作为检测样品,试纸条检测的灵敏度为0.002U/mL,特异性试验证明该试纸条与犬细小病毒、犬瘟热病毒、犬腺病毒2型犬科疾病阳性血清没有交叉反应,稳定性试验证明该试纸条在室温下保存的有效期为12个月,检测结果与快速荧光抑制试验的符合率为95.12%。证实该狂犬病病毒抗体免疫金标检测试纸可以方便、快速、灵敏、特异地检测狂犬病病毒的抗体水平。     

CDV和CPV及CCV多重纳米PCR检测方法的建立与应用

参考Gen Bank上登录的犬瘟热病毒(CDV)N基因序列、犬细小病毒(CPV)VP2基因序列和犬冠状病毒(CCV)M基因序列的保守型片段分别设计特异性引物,建立了CPV(193 bp)、CDV(500 bp)和CCV(780bp)的多重纳米PCR(nano-mPCR)检测方法,同时考查所建立nano-mPCR检测方法的特异性和敏感性。结果表明,该方法特异性和敏感性良好,对CPV、CDV和CCV的最低核酸检测量分别为1.39×10~2、6.0×10~2和6.7×10~2copies/L,其敏感性比普通PCR高100倍。临床样品的检测结果表明,nano-mPCR的建立为CDV、CPV和CCV的单独或混合感染进行早期快速、灵敏、准确的鉴别诊断提供了新方法。     

犬瘟热病毒RT-PCR检测方法的建立

根据GenBank中登录的犬瘟热病毒(CDV)核衣壳蛋白基因序列,设计合成了1对特异性引物,以CDV疫苗株ONP为模板,通过对反应条件进行优化,建立了一种快速检测CDV的RT-PCR方法。结果显示,以该引物进行RT-PCR扩增,能得到与理论设计值大小一致的242bp的特异性条带;该方法最低可以检测出约20pg含量的CDV;对已知CDV阳性和阴性病料进行重复性和稳定性试验,结果均一致;用该方法检测犬细小病毒(CPV)、犬冠状病毒(CCV)、狂犬病病毒(RV)和同为副黏病毒科的新城疫病毒(NDV),均无交叉反应;对32份临床病料进行检测,并与免疫胶体金抗原检测试纸检测结果进行比较,符合率为93.75%。结果表明,此方法特异性强,敏感性高,重复性和稳定性均好,可用于犬瘟热病毒的临床诊断和试验研究。     

基于金纳米颗粒标记非洲猪瘟病毒p30蛋白免疫层析检测方法的建立

为建立一种用于非洲猪瘟病毒(ASFV)抗体的快速检测方法,本研究将特异性高、抗原性强的重组ASFV p30蛋白用金纳米颗粒标记,制成捕获金标抗原;将p30蛋白及其多克隆抗体(ASFV-p30-Ab)包被在硝酸纤维素膜(NC)上,分别作为检测线(T线)和质控线(C线),制备ASFV p30金纳米颗粒免疫层析抗体检测试纸条,并对该方法开展了初步评价。结果表明,该试纸条可在5-10 min完成检测;以健康猪血清、口蹄疫病毒(FMDV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV-2)等阳性血清作为对照,该方法仅特异性的检出ASFV感染的血清阳性样品,与各对照组血清无交叉反应;以进口ASFV抗体ELISA检测试剂盒作为金标准对阴、阳性样品进行对比检验,该试纸条检出的敏感性和特异性分别为92.52%和92.00%,说明本研究制备的ASFV p30抗体金纳米颗粒检测试纸条具有较高的敏感性和特异性,具备操作简便、检测快速和结果判断容易等特点,具有ASF现场检测的实际应用价值。     

牛蓝舌病病毒VP7抗体胶体金试纸条检测方法的建立

为建立一种快速检测牛蓝舌病病毒抗体的免疫层析方法,本研究通过胶体金标记蓝舌病病毒VP7蛋白,以兔抗牛IgG作为检测线,抗蓝舌病毒VP7蛋白单克隆抗体作为质控线,采用间接法制备了胶体金免疫层析试纸条。结果显示,该胶体金试纸条在蓝舌病病毒抗体阳性血清稀释度为1∶64时仍可检出;该试纸条与牛结核病、牛布鲁氏菌病、牛病毒性腹泻、牛巴氏杆菌病、牛地方流行性白血病的阳性血清均无交叉反应;与国外商品化试剂盒相比较,该试纸条检测结果与ELISA检测试剂盒(IDEXX)的符合率为92.7%(51/55)。结果表明,本试验初步建立的牛蓝舌病病毒抗体的胶体金免疫层析检测方法具有较好的特异性和稳定性,整个检测过程可在10 min内完成,能够快速检测样品血清,适用于现场快速检测。     

牛地方流行性白血病液相蛋白芯片检测方法的建立

应用xMAP液相芯片技术原理,以原核表达的重组牛白血病病毒gp51蛋白为抗原,建立了检测牛白血病病毒抗体的LiquiChip液相蛋白芯片检测方法,并进行了特异性、敏感性、重复性与稳定性试验。结果表明,该方法对牛白血病病毒阳性血清检测阳性,对其他常见牛病毒阳性血清检测阴性,表明特异性好;液相蛋白芯片方法对牛白血病病毒抗体的检测敏感性可达119.7ng/μL,对多份牛白血病病毒阳性血清的检测结果显示该方法的检测敏感性与商品化ELISA试剂盒无显著差异;对3份牛白血病病毒阳性血清进行4次重复检测,批内、批间的变异系数均低于10%。所制备的偶联微球芯片保存3个月,其检测结果无显著差异。采用该方法对169份临床牛血清样品进行检测,检出阳性率达57.4%,该检测结果与瑞典进口ELISA试剂盒检测结果的符合率为94.67%。本方法为牛地方流行性白血病的进出境检疫、疫病监测和流行学调查研究提供了一种特异、敏感的新型快速检测技术。     

猪流感病毒M2多肽抗体间接ELISA检测方法的建立

为建立快速检测猪流感病毒抗体的血清学方法,利用合成的甲型流感病毒M2蛋白多肽作为包被抗原,建立了检测猪流感病毒血清抗体的间接ELISA,并对各种检测条件进行了优化。结果显示,优化后确定的抗原最适包被量为250ng/孔,血清最佳稀释度为1∶100,酶标二抗最佳稀释度为1∶4 000。在优化条件下,阴阳性临界值的判定标准为0.249。用建立的间接ELISA对CSFV、PRRSV、PCV2、PPV、PRV、FMDV、JEV阳性血清进行了检测,均无交叉反应。用该方法对280份冬季采集的猪血清样品进行检测,有60份样品呈现阳性;同时用IDEXX甲型流感病毒抗体检测试剂盒进行平行检测,有61份样品呈现阳性,两者的符合率达到98.35%。结果表明,建立的ELISA具有良好的敏感性、特异性和可信度。本研究为猪流感的诊断和流行病学调查提供了一种准确、快速、简便的方法。     

布鲁氏菌血清抗体量子点荧光微球检测试纸条的研制

为研制一种现场快速筛查布鲁氏菌病的免疫层析试纸条,本研究以量子点荧光微球作为示踪物,共价偶联布鲁氏菌外膜蛋白OMP22,并将布鲁氏菌外膜蛋白OMP28和抗OMP22的单克隆抗体喷涂于硝酸纤维素膜上分别作为检测线和质控线,组装试纸条。结果显示,量子点荧光微球试纸条检测阳性血清的最大稀释度为1∶512,检测布鲁氏菌病阳性血清的敏感性为99%,特异性为98%,与虎红平板凝集试验(RBPT)的符合率为99%。且与结核病、蓝舌病、病毒性腹泻、口蹄疫及小反刍兽疫血清无交叉反应。上述结果表明量子点荧光微球免疫层析试纸条检测速度快、灵敏度高、特异性强且成本低,适用于布鲁氏菌病的现场筛查。     

鹿流行性出血病病毒VP7-ELISA抗体

以原核表达的鹿流行性出血病病毒(epizootic hemorrhagic disease virus of deer,EHDV)VP7蛋白为包被抗原,用HRP标记的兔抗羊IgG作为二抗,建立了检测EHDV群特异性抗体的间接ELISA方法(VP7-ELISA).用VP7-ELISA方法检测EHDV阳性血清、其他病毒阳性血清及健康羊血清,结果表明,VP7-ELISA方法具有良好的特异性;用VP7-ELISA和琼脂扩散试验(AGID)检测EHDV阳性血清抗体效价,结果表明,VP7-ELISA的敏感性相当于AGID的8～16倍.用VP7-ELISA和AGID同时检测临床样品188份,VP7-ELISA的特异性和敏感性分别为95.9%和100%,两种方法的符合率为96.3%.表明VP7-ELISA可以代替AGID用于EHDV抗体检测.     

猪鼻支原体抗体间接ELISA检测方法的建立及应用

为了检测猪血清中猪鼻支原体(Mhr)的抗体水平,采用脱氧胆酸钠提取Mhr膜蛋白作为包被抗原,建立了间接ELISA,并采用该方法检测了60份SPF阴性猪血清和45份Mhr阳性猪血清样品。结果显示,该方法的特异性为90.5%,敏感性为98.0%。除猪肺炎支原体(Mhp)外,该方法与几种猪病毒阳性血清及副猪嗜血杆菌Ⅳ型阳性参考血清均无交叉反应。对Mhr DL菌株感染的巴马猪血清抗体的检测结果显示,Mhr感染后第3天血清抗体阳转,第35天抗体水平达到高峰,抗体效价为1∶6 400。用该方法与IDEXX猪肺炎支原体抗体检测试剂盒平行检测138份现地血清样品,Mhr和Mhp的阳性检出率分别为71.0%和44.9%。用该方法对黑龙江、吉林、山东等地临床送检的457份血清的检测结果显示,Mhr阳性率为70.3%,表明我国猪群Mhr感染十分普遍。上述结果表明,本研究建立的间接ELISA具有良好的特异性和敏感性,为Mhr抗体检测提供了技术手段。     

鉴别犬瘟热病毒野毒株与疫苗株的SYBR Green Ⅰ real-time PCR方法的建立

本研究针对野毒株与疫苗株的H基因设计特异性引物,通过优化反应体系和反应程序,建立了一种鉴别犬瘟热病毒(CDV)野毒株与疫苗株的SYBR GreenⅠ实时荧光定量方法。检测结果表明,该方法能特异性地检测CDV野毒株,与CDV疫苗株、犬细小病毒、犬腺病毒、犬冠状病毒和犬副流感病毒均无交叉反应。其标准曲线的相关系数达0.987。检出敏感性达6.22×101copes/L,比常规PCR检测方法高100倍。应用本方法检测了42份临床疑似CD样品,其中41份为野毒株感染,随机选取15份阳性样本进行H基因克隆测序,通过进化树分析显示它们均属于Asia-Ⅰ型,与疫苗株H基因相比同源性较低,核苷酸的同源性在90.3%~91.3%之间,氨基酸同源性在96.3%~97.2%之间。该方法的建立为临床上CDV的鉴别检测提供了依据。     

猪捷申病毒8型rVP1-ELISA检测方法的建立

为建立猪捷申病毒(PTV)抗体的间接ELISA检测方法,将PTV-8VP1基因克隆至原核表达载体pET-30a中,重组质粒转化大肠杆菌Rosetta表达重组的VP1蛋白。SDS-PAGE及Western-blot分析结果表明,表达的重组蛋白分子质量约为36.2ku,且能被PTV-8阳性血清特异性识别。以纯化的重组蛋白包被ELISA反应板,建立了检测PTV抗体的间接ELISA方法。特异性试验结果表明,重组VP1蛋白与猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒2型和猪瘟病毒阳性血清不发生反应。敏感性试验结果表明血清稀释至1∶800时仍检测为阳性。该方法的批内、批间变异系数均小于10%,表明具有较好的重复性。利用建立的方法对633份临床样品进行检测,阳性率是88.10%。选取58份临床样品与间接免疫荧光方法作比对试验,两者的符合率是94.80%。     

猪盖塔病间接ELISA检测方法的建立与应用

为建立一种快速、准确、敏感性高、特异性好的猪盖塔病检测方法,采用超速离心纯化的灭活盖塔病毒(Getah virus,GETV)作为抗原包被ELISA板,分别用GETV免疫小鼠腹水和正常小鼠腹水作为阳性、阴性对照,建立检测猪盖塔病的间接ELISA方法。采用棋盘滴定法确定最佳抗原包被质量浓度,为7.795ng/mL;通过对70份阴性猪血清的检测,确定判定标准;特异性试验表明,该方法与同属病毒以及其他易感病毒之间无血清学交叉反应,具有良好的特异性;用所建立的ELISA方法与血清中和试验(SNT)、间接免疫荧光试验同时检测不同GETV抗体效价的猪血清,结果表明该间接ELISA敏感性最高,且检测用时最短;用金标准SNT检验所建立的ELISA方法,结果显示这2种方法的一致性为88.89%,Kappa为0.776,具有较高的一致性。用建立的GETV间接ELISA方法对双江县90份临床样品进行检测,阳性率为47.78%,提示双江县猪群中存在GETV感染,盖塔病对养猪业存在潜在风险。结果表明,成功建立了猪盖塔病间接ELISA检测方法。     

基于重组IBDV VP3蛋白的免疫磁珠间接ELISA抗体检测方法的建立及初步应用

本研究旨在毕赤酵母中表达鸡传染性法氏囊病毒(infectious bursal disease virus,IBDV)的VP3蛋白,以重组VP3蛋白作为包被抗原建立IBDV血清抗体免疫磁珠间接ELISA检测方法并进行初步应用。利用毕赤酵母表达系统获得约为39 ku的重组VP3蛋白,Western-blotting检测表明,重组VP3蛋白具有良好的特异性和反应原性。免疫磁珠间接ELISA的最佳反应条件:磁珠和抗原偶联的缓冲液是50 mmol/L MES(p H 8.0),偶联时间为3 h,抗原加入量为95μg,抗原与羧基磁珠最大偶联量为80μg。待检血清和酶标二抗的稀释度分别为1∶1 600和1∶4 000,血清孵育时间为30 min,酶标二抗孵育时间为20 min。在该优化条件下,阴性、阳性临界值判定标准为0.134。特异性试验显示,对抗AIV、IBV、MDV、NDV阳性血清检测结果均为阴性。敏感性试验显示,本试验所建立的检测方法敏感性高于商品化IBDV血清抗体检测试剂盒。重复性试验显示,批内和批间重复试验的最大变异系数分别为3.8%和5.9%。稳定性试验结果显示变异系数小于7%。用建立的检测方法和商品化IBDV血清抗体检测试剂盒同时检测50份血清,结果显示两种检测方法的相对敏感性为94.6%,相对特异性为92.3%,符合率为94.0%。本试验建立的检测方法具有敏感性高、特异性强、重复性好、稳定性高特点,为其应用于临床IBDV血清抗体的检测奠定了基础。     

猪圆环病毒1型抗体IPMA检测方法的建立及应用

建立了一种用于检测猪圆环病毒1型(PCV1)血清抗体的免疫过氧化物酶单层细胞试验(IPMA)方法.对该方法的反应条件、特异性、敏感性及重复性等进行了系统试验,并与用昆虫杆状病毒表达的PCV1-Cap重组蛋白抗原建立的间接ELISA的检测结果进行了比较.结果显示,用IPMA法对已知PCV1和猪圆环病毒2型(PCV2)参考阳性血清进行检测,血清稀释度≥1:100即可消除2种病毒间的低水平交叉反应,与其他几种猪病毒参考阳性血清无交叉反应;与用昆虫杆状病毒表达的PCV1-Cap重组蛋白抗原建立的间接ELISA的检测符合率为88.9%.用该方法对黑龙江省、吉林省、河北省、上海市、辽宁省等地猪场送检的257份血清样品进行检测,PCV1和PCV2血清抗体阳性检出率分别为19.1%和80.5%,PCV1抗体阳性猪中有95.9%为PCV2阳性,表明我国猪群已存在PCV1感染,在临床上PCV1与PCV2多以混合感染形式存在.建立的PCV1-IPMA方法具有操作简便、特异和敏感等特点,不失为PCV1流行病学调查及血清抗体检测的有效技术手段.     

粪肠球菌抗体间接ELISA检测方法的建立及应用

利用超声波裂解法制备粪肠球菌的裂解物作为抗原包被酶标反应板,通过棋盘滴定方法筛选最佳反应条件,成功地建立了检测致羔羊脑炎粪肠球菌抗体的间接ELISA.在此间接ELISA中,抗原最佳包被浓度为37.57μg/mL,被检血清的最佳稀释度为1100.建立的间接ELISA的灵敏度是微量凝集反应的25～100倍.交叉试验、阻断试验、重复性试验表明,该方法具有重复性好、特异性强、操作简便快速等特点.确立的检测ELISA效价的回归方程lg[1/ET]=1.275 2.730 D405mm,可用于抗体定量测定.利用此方法检测了来自未免疫绵羊场的50份成年绵羊的血清和50份羔羊的血清;结果,2份成年绵羊的血清为阳性,其他样品均为阴性.     

副猪嗜血杆菌抗体间接血凝检测方法的建立及应用

将副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,HPS)血清型4、5型分离菌株经超声波破碎处理后的产物致敏醛化红细胞,建立了检测HPS抗体的间接血凝试验方法。最适反应条件为绵羊红细胞30℃醛化5 h,4、5型菌株浓缩抗原以1∶8稀释致敏红细胞。免疫猪2周后检出率达89%。对15种HPS血清型阳性血清进行检测,结果均为阳性;对猪瘟病毒、口蹄疫病毒、猪圆环病毒、猪细小病毒、猪伪狂犬病病毒、猪生殖与呼吸综合征病毒、猪肺炎支原体、猪链球菌、猪肺疫巴氏杆菌、Ⅰ相支气管败血波氏杆菌及胸膜肺炎放线杆菌阳性血清进行检测,结果均为阴性。敏感性为琼脂扩散试验的16倍。对1 665份猪血清进行检测,阳性率为47.1%。结果表明,该方法敏感性较高,特异性强,重复性好,可用于疫苗免疫后抗体水平的检测及副猪嗜血杆菌的流行病学调查。