柔嫩艾美耳球虫SSADH基因的克隆原核表达与序列分析

为研究柔嫩艾美耳球虫琥珀酸半醛脱氢酶(SSADH)的生物学功能,参考已公布的柔嫩艾美耳球虫SSADH(EtSSADH)的基因序列设计特异性引物,运用RT-PCR方法扩增EtSSADH基因序列,将扩增产物克隆入pGEX-4T-1载体进行诱导表达。同时,利用在线软件对该基因编码蛋白的氨基酸序列进行生物信息学分析。结果显示,EtSSADH基因的ORF序列长1896 bp,编码631个氨基酸;该编码蛋白主要定位于线粒体,不含信号肽,无跨膜结构域;将EtSSADH与不同物种SSADH氨基酸序列进行比对,发现该蛋白氨基酸序列之间具有较强的保守性。诱导表达后获得分子质量约91.18 ku的重组蛋白。EtSSADH基因的成功克隆与表达为该酶的功能研究奠定了基础。     

柔嫩艾美耳球虫SSADH基因的克隆原核表达与序列分析

为研究柔嫩艾美耳球虫琥珀酸半醛脱氢酶(SSADH)的生物学功能,参考已公布的柔嫩艾美耳球虫SSADH(Et SSADH)的基因序列设计特异性引物,运用RT-PCR方法扩增Et SSADH基因序列,将扩增产物克隆入p GEX-4T-1载体进行诱导表达。同时,利用在线软件对该基因编码蛋白的氨基酸序列进行生物信息学分析。结果显示,Et SSADH基因的ORF序列长1 896 bp,编码631个氨基酸;该编码蛋白主要定位于线粒体,不含信号肽,无跨膜结构域;将Et SSADH与不同物种SSADH氨基酸序列进行比对,发现该蛋白的氨基酸序列之间具有较强的保守性。诱导表达后获得分子质量约91.18 ku的重组蛋白。Et SSADH基因的成功克隆与表达为该酶的功能研究奠定了基础。     

柔嫩艾美耳球虫杨凌株TA4基因的克隆和原核表达

根据国外报道的序列设计1对引物,以纯化的柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)杨凌(YL)株孢子化卵囊的总RNA为模板,用RT-PCR方法扩增出E.tenella YL株的TA4基因.序列分析表明,该序列全长741 bp,开放阅读框(ORF)为651 bp,共编码217个氨基酸,与E.tenella HT株、E.tenella BJ株和E.tenella ZJ株的TA4基因ORF序列同源性分别为99.8%、99.8%和99.27%.由此确定所获得的目的基因为E.tenella YL株TA4基因.利用生物信息学和分子生物学软件对TA4基因编码的蛋白进行结构预测,结果表明,该蛋白为一结构松散的球状蛋白.将TA4基因克隆到表达载体pET-32a中,构建重组质粒pET-TA4并在大肠杆菌BL21中进行表达,表达产物的SDS-PAGE分析结果表明,成功地表达了分子质量为41 ku的融合蛋白.     

柔嫩艾美球虫杨凌株表面抗原SAG10基因的克隆与原核表达

从柔嫩艾美球虫第二代裂殖子总RNA中扩增EtSAG10基因,与pGEM-T Easy载体连接后转化大肠杆菌(E.coli)DH5α,筛选阳性克隆,扩增不含N端信号肽的编码序列,分别插入表达载体pET-32a( )和pMAL-c2X,转化至E.coliRosetta,以IPTG诱导表达。结果表明,pET-32a( )-EtSAG10在E.coliRosetta中的表达产物约占菌体总蛋白的43%,融合蛋白分子质量约为47 ku,以包涵体形式存在;而pMAL-c2X-EtSAG10在E.coliRosetta中表达的重组蛋白为可溶性,表达产物约占菌体总蛋白的35%,融合蛋白分子质量约为69 ku。以表达的可溶性EtSAG10重组蛋白100μg/只肌肉注射免疫雏鸡,攻虫后以盲肠病变计分、盲肠卵囊数(OPG)、相对增重率和抗球虫指数(ACI)评价,免疫组相对盲肠卵囊产量为47.7%,抗球虫指数由86.79提高至152.13。提示,重组表达的EtSAG10可诱导雏鸡产生一定的抗球虫免疫保护。     

柔嫩艾美耳球虫感染对雏鸡肠道紧密连接相关蛋白表达的影响

为研究柔嫩艾美耳球虫感染对雏鸡肠道黏膜上皮组织Occludin和Claudin-1表达的影响,给14日龄雏鸡经嗉囊接种2×104个柔嫩艾美耳球虫的孢子化卵囊,分别于感染后第0、4、7、14和21天采集小肠和盲肠样本。用荧光定量PCR和Western-blotting分析感染后不同时间点雏鸡肠道黏膜上皮组织Occludin和Claudin-1的表达水平变化。结果显示:在m RNA水平上,相较于第0天,感染后第4天盲肠Occludin表达量极显著上升(P0.01),第7天则显著下降(P0.01),第14和21天表达量逐渐回升,但均无显著差异(P0.05);Claudin-1的表达量呈先下降后上升的变化趋势,但均无统计学差异(P0.05)。在蛋白水平上,相较于感染后第0天,小肠和盲肠的Occludin均在感染后第4天显著上升(P0.05),在感染后第7天表达量显著下降(P0.05),第14和21天表达量则显著升高(P0.01);盲肠Claudin-1的表达量在第7天显著下降(P0.01),小肠Claudin-1在第21天则显著上升(P0.01)。结果表明,球虫感染后的裂殖生殖阶段可能会引起机体的抗损伤反应,使得Occludin的表达量显著上升,感染后第7天雏鸡肠道紧密连接蛋白Occludin和Claudin-1的表达量下降,是肠上皮屏障受损的标志。     

鸡毒害艾美耳球虫小热休克蛋白基因EnsHsp20的克隆表达与蛋白定位

克隆、表达毒害艾美耳球虫小热休克蛋白基因EnsHsp20,检测其天然蛋白及其在虫体内的亚细胞定位。以毒害艾美耳球虫子孢子的总RNA为模板,用RT-PCR扩增EnsHsp20基因后,连接至pGEM-T Easy载体;测序后构建pET28a(+)-EnsHsp20表达载体,转化至大肠杆菌BL21(DE3);经双酶切和测序鉴定后,将重组菌诱导表达;表达产物经Western-blot鉴定、纯化与复性后,免疫BALB/c小鼠,制备小鼠抗rEnsHsp20多克隆抗体;利用多克隆抗体,分别用Western-blot和间接免疫荧光试验检测子孢子和第2代裂殖子中EnsHsp20的天然蛋白及其定位;最后,应用qRT-PCR分析EnsHsp20基因在未孢子化卵囊、子孢子和第2代裂殖子中的转录水平。结果显示,该基因全长549 bp,编码183个氨基酸,预测分子质量为20.3 ku;重组蛋白主要以包涵体形式存在,可以被6×His标签单抗和鸡抗毒害艾美耳球虫、抗柔嫩艾美耳球虫、抗堆型艾美耳球虫和抗巨型艾美耳球虫的阳性血清识别;在第2代裂殖子中检测到EnsHsp20的天然蛋白,分子质量约为36 ku;EnsHsp2...     

地克珠利对柔嫩艾美耳球虫SAG4表达的影响

建立地克珠利抗柔嫩艾美耳球虫感染鸡动物模型,收集获得柔嫩艾美耳球虫第2代裂殖子,采用PCR扩增柔嫩艾美耳球虫第2代裂殖子SAG4基因不含N端信号肽的编码序列,构建p ET-28a-SAG4表达质粒,转化至BL21(DE3)感受态细胞,用IPTG诱导表达融合蛋白,镍亲和层析柱法纯化蛋白,通过免疫BALB/c小鼠制备SAG4抗血清。用Real-time PCR检测SAG4 m RNA的表达,用Western-blot和免疫荧光技术检测SAG4蛋白的表达情况。结果显示,p ET-28a-SAG4表达的重组蛋白为可溶性蛋白,地克珠利显著降低了柔嫩艾美耳球虫第2代裂殖子SAG4基因m RNA和蛋白的表达。这提示SAG4基因可能与地克珠利抗球虫作用相关,这将为地克珠利抗球虫作用机理的阐述提供理论依据。     

杀球灵抗柔嫩艾美耳球虫的效力观察

我们受比利时杨森制药公司(Janssen Phar-maceutica)的委托,对该公司最近研制的杀球灵进行抗柔嫩艾美耳球虫效力试验,并进一步确定本品对中国北京白鸡的柔嫩艾美耳球虫虫株的抗球虫效果。(一)材料和方法1.试验药物:(1)杀球灵(Diclazuril):由比利时杨森公司提供,使用浓度为1ppm。(2)莫能菌素(Monensin):由北京农业大学生物学院提供,使用浓度为110ppm。(3)氨丙啉(Amprolium):系上海第二药厂生产,使用浓度为125ppm。     

安徽省五株柔嫩艾美耳球虫的RAPD分析

通过比较柔嫩艾美耳球虫敏感株与耐药株之间DNA条带的差异来分析耐药性,寻找鸡球虫耐药性虫株的分子标记。采用随机扩增多态性DNA(RAPD)技术对安徽省阜南、舒城、和县、全椒、凤台这5个地区的柔嫩艾美耳球虫和2株敏感株进行遗传多样性分析,同时用5种常用抗球虫药分别对这5个野外分离株进行鸡体试验,5个虫株对上述5种药物均有不同程度的耐药性。RAPD结果显示:5个样品都有相似而清晰的主带,每个泳道有1~25条带不等,大小为2 kb以下。南京敏感株与上海敏感株之间的相似性最高,为78.57%,全椒株与和县株最低且上海敏感株和凤台株最低,均为40.00%,其余虫株之间的相似性处于两者之间,株间平均值为53.85%。5个地理株与2个敏感株之间的SI值也处于较低水平,表明耐药虫株的基因处于较高的变异水平,存在丰富的遗传多样性。     

脆弱艾美耳球虫、波氏艾美耳球虫和堆型艾美耳球虫在培养细胞里的发育

在培养细胞里培养了鸡艾美耳球虫、波氏艾美耳球虫和堆型艾美耳球虫,观察了它们的生长形态和培养条件。已获得的结果摘要如下。 (一)脆弱艾美耳球虫在用孢子体接种的细胞培养中发育成卵囊,波氏艾美耳球虫发育到成熟的第二代裂殖体。没有发现处于生长期的堆型艾美耳球虫。 (二)在培养脆弱艾美耳球虫第二世代裂殖体时,只有少数裂殖子侵入培养细胞,不过没观察到进一步的发育。 (三)裂殖体区分为三种形态学类型。第一种类型的裂殖体跟在活体里发现的形态一样。第二种类型裂殖体的细胞质分裂成大小不一的团块。每一团块包含一个或较多的细胞核。第三种类型裂殖体同细胞里的孢子体相似,尽管它们在量度上比后者明显大些。它们有一个折光体,一个大细胞核和丰满的细胞质。 (四)在裂殖子形成过程中看到三种不同的方法。裂殖子是由第一种类型的裂殖体,第二种类型裂殖体的球形体和第三种类型裂殖体的球状物的表面分裂而形成的。 (五)在试管里培养脆弱艾美耳球虫的最适条件在于应用鸡肾细胞和含有0.2％酵母浸出物的No.199培养基,并置40℃培养。当应用鸡胚成纤维细胞和把培养物保存在Eagle's最小必需量培养基里并在40℃孵育波氏艾美耳球虫时取得了满意的结果。     

柔嫩艾美耳球虫NADP特异性谷氨酸脱氢酶特性分析

为了研究柔嫩艾美耳球虫NADP特异性谷氨酸脱氢酶(EtNADP-GDH)的分子特性,对该基因进行了克隆和生物信息学分析,利用间接免疫荧光定位、体外入侵抑制、实时荧光定量PCR、Western-blot和体外酶活性检测等方法分析其生物学特性。结果显示,成功获得了EtNADP-GDH基因,该基因编码的蛋白富含包括NAD结合位点在内的多种功能位点。该蛋白主要分布在虫体的表面和细胞质中,抗rENADP-GDH多克隆抗体能抑制子孢子入侵DF-1细胞,抑制率约为45%,表明其参与了虫体入侵宿主细胞。荧光定量PCR结果显示,该基因在未孢子化卵囊阶段的转录水平最高;转录、翻译水平分析发现,与敏感株相比,2个耐药株(地克珠利耐药株和马杜拉霉素耐药株)中EtNADP-GDH的转录水平显著提高,而翻译水平无明显差异;酶活性分析结果显示,耐药株和敏感株差异不明显。结果表明,该蛋白可能对虫体在宿主细胞内的生长发育起作用并参与了子孢子入侵宿主细胞的过程。     

鸡柔嫩艾美耳球虫活虫苗免疫预防的研究

鸡柔嫩艾美耳球虫活虫苗免疫预防的研究陈明勇蒋金书汪明（中国农业大学动物医学院北京１０００９４）鸡球虫病是一种危害极大、世界性分布的寄生性原虫病，常给养鸡业带来巨大的经济损失。对该病的药物防治常因抗球虫药物耐药周期的日益缩短、药物更新缓慢及生产费用的增...     

耐氯羟吡啶柔嫩艾美耳球虫株的鉴定

鸡球虫病的防治主要依赖于抗球虫药，但用药失败的现象时有发生，其中主要原因是耐药性虫株的出现。检测耐药虫株出现的时间及范围对指导合理用药，提高疗效极为重要。河北省张家口市某鸡场连续五年用氯羟吡啶防治鸡球虫病效果良好，但1993年夏用该药防治失败，爆发鸡球虫病，造成严重经济损失。现将从该场分离到的一株柔嫩艾美耳球虫耐氯羟吡啶株的鉴定过程报告如下。（一）材料和方法1.实验鸡:刚出壳的艾维茵雏鸡200只，饲养在火焰消毒的铁丝笼内，饲料经80℃干烤4小时，饮水煮沸消毒。至12日龄开始试验。2.药物：盐霉素（钙）预混剂，含…     

柔嫩艾美耳球虫地克珠利与马杜拉霉素抗药株的基因重组选育

将柔嫩艾美耳球虫地克珠利抗药株与马杜拉霉素抗药株等剂量同时感染无球虫鸡,再将得到的杂交后代经饲喂了地克珠利与马杜拉霉素的鸡筛选获得重组体,对该重组体的部分生物学特性进行了研究,旨在采用基因重组方法筛选出具有双重抗性的重组抗药株。结果显示,该重组体的重组率为0.4%;对地克珠利与马杜拉霉素具有完全抗性,而对氯苯胍与尼卡巴嗪完全敏感;卵囊繁殖能力介于两母株之间,致病性与母株无显著性差异。表明,用基因重组法首次成功筛选出了对地克珠利与马杜拉霉素同时具有抗性的柔嫩艾美耳球虫抗药株。     

地克珠利对柔嫩艾美耳球虫丝氨酸/苏氨酸磷酸酶5表达的影响

建立地克珠利抗柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)感染鸡动物模型,收集获得E. tenella第2代裂殖子,通过PCR扩增E. tenella第2代裂殖子丝氨酸/苏氨酸磷酸酶5(serine/threonine protein phosphatase type 5,Et PP5)基因编码序列,构建pET-28a-Et PP5表达质粒,转化至BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达融合蛋白,镍亲和层析柱法纯化表达蛋白并免疫BABL/c小鼠制备Et PP5抗血清。采用免疫荧光和Western-blot技术检测第2代裂殖子Et PP5蛋白的表达。结果显示,30℃时,用1 mmol/L的IPTG诱导pET-28a-Et PP5表达的融合蛋白大多以包涵体形式存在。Et PP5主要分布在E. tenella第2代裂殖子的细胞质中,细胞核也有少量分布。经地克珠利处理后,E. tenella第2代裂殖子Et PP5蛋白表达降低了47.65%(P0.01)。提示,地克珠利可能通过作用Et PP5发挥抗球虫作用,这为地克珠利抗球虫作用机理的阐述提供了理论依据。     

柔嫩艾美耳球虫DF-1细胞培养体系的建立及应用

为了建立柔嫩艾美耳球虫的鸡胚成纤维传代细胞(DF-1)培养体系,并应用于柔嫩艾美耳球虫子孢子的细胞入侵活力检测,将CFDA-SE标记的子孢子接入DF-1细胞,利用流式细胞仪测定子孢子的细胞入侵活力。比较了37℃和41℃培养温度下,子孢子对DF-1、MDBK、Vero、BHK、MDCK五种细胞的入侵活力。优化了在子孢子入侵活力检测时,DF-1细胞最佳培养条件。结果表明,柔嫩艾美耳球虫子孢子在DF-1细胞中可发育为第一代裂殖子。在不同培养温度下,子孢子对DF-1细胞的入侵活力均高于其他细胞。优化后的DF-1细胞培养体系的培养程序为:用含100mL/L胎牛血清的DMEM稀释DF-1细胞,以每孔1×105个细胞铺被24孔板,37℃、50mL/L CO2培养24h后,用含50mL/L胎牛血清的DMEM换液后,每孔接入3×105个子孢子,41℃、50mL/L CO2培养8～12h,收集细胞进行检测。     

表面展示柔嫩艾美耳球虫EtMIC2蛋白的侵入型乳酸菌的免疫特性研究

为了研究表达pgsA′-EtMIC2融合蛋白的侵入型乳酸菌的免疫特性,将pgsA′-EtMIC2基因片段插入到载体pSIP409-FnBPA中,得到pSIP409-FnBPA-pgsA′-EtMIC2重组质粒,并用电转化的方式转入植物乳杆菌NC8感受态细胞中,构建表面展示EtMIC2蛋白的侵入型乳酸菌。通过检测免疫雏鸡外周血淋巴细胞中CD3~+CD4~+、CD3~+CD8~+T淋巴细胞的发育情况,血清中EtMIC2抗体、IL-4、IL-18、IFN-γ的含量以及肠道灌洗液中IgA的分泌量来评价该侵入型乳酸菌对雏鸡的免疫特性。结果显示,成功构建出携带pSIP409-FnBPA-pgsA′-EtMIC2质粒的重组乳酸菌;雏鸡免疫后外周血淋巴细胞中CD3~+CD4~+、CD3~+CD8~+T淋巴细胞含量明显升高;EtMIC2抗体、IL-18、IFN-γ细胞因子及IgA产生的水平均显著上升,表明该侵入型乳酸菌具有一定的免疫效力,为后期研究抗球虫的免疫保护效果奠定了基础。     

柔嫩艾美耳球虫AMA1蛋白多克隆抗体的制备及在乳酸乳球菌中的表达

将柔嫩艾美耳球虫子孢子顶膜抗原AMA1胞外域基因片段(EtAMA1)克隆入原核表达载体pET-30a(+)中,构建重组质粒pET-30a(+)-EtAMA1。质粒经鉴定正确后转化入大肠杆菌中筛选阳性菌,阳性菌经IPTG诱导后采用Western-blot检测目的蛋白的表达情况。用表达的重组蛋白免疫新西兰白兔制备多克隆抗体。应用间接ELISA测定抗体效价,并采用Western-blot检测抗体特异性。将EtAMA1克隆入乳酸菌表达载体pTX8048中构建阳性质粒pTX8048-EtAMA1,质粒电转化入宿主菌乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)NZ9000中筛选阳性菌pTX8048-EtAMA1-L.lactis NZ9000。阳性菌经Nisin诱导后采用Western-blot检测目的蛋白的表达情况。结果表明,EtAMA1在大肠杆菌中以包涵体形式表达。多克隆抗体的效价为218。Western-blot检测证实,制备的抗体可与子孢子反应。重组菌pTX8048-EtAMA1-L.lactis NZ9000经Nisin诱导后,采用Western-blot检测到约61ku的目的蛋白。上述研究结果为基于EtAMA1的鸡球虫病乳酸菌口服疫苗的研制提供了重要参考。     

口疮病毒VEGF基因的原核表达及亚细胞定位

为了对口疮病毒(ORFV)VEGF基因进行原核表达和亚细胞定位研究,PCR扩增VEGF基因,并将其分别克隆至原核表达载体p ET-32a(+)和真核表达载体p EGFP-C3中。将原核表达重组质粒转化至E.coli Rosseta感受态细胞中,经IPTG诱导表达目的蛋白。将表达产物纯化后免疫BALB/c小鼠,制备多克隆抗体血清,并利用琼脂扩散试验检测其效价。将真核表达重组质粒转染BHK21细胞,利用激光共聚焦观察VEGF蛋白在BHK21细胞中的亚细胞定位。结果表明:VEGF蛋白在大肠杆菌中获得了高效表达,主要以包涵体形式表达,蛋白分子质量大小约为33 ku。Western-blot结果表明,VEGF蛋白具有良好的反应原性,制备的多克隆抗体效价达1∶8。VEGF蛋白在转染BHK21细胞后主要在细胞质中表达,且能够与制备的多抗血清反应。本研究为进一步研究该蛋白的功能奠定了一定的基础。     

口疮病毒dUTPase基因的原核表达及亚细胞定位

为了对口疮病毒(orf virus,ORFV)的dUTPase基因进行原核表达和亚细胞定位研究,本研究利用PCR扩增获得dUTPase基因,通过亚克隆获得重组表达质粒p ET-32a-dUTPase和p EGFP-C3-dUTPase。p ET-32a-dUTPase经IPTG诱导表达出dUTPase蛋白。蛋白纯化后免疫BALB/c小鼠,制备多抗血清,并利用琼脂扩散试验检测其效价。p EGFP-C3-dUTPase转染BHK21细胞,利用荧光显微镜观察dUTPase蛋白的亚细胞定位。结果表明,dUTPase蛋白在大肠杆菌中获得了高效表达,分子质量大小约为35.7 ku,与预期相符。表达的dUTPase His融合蛋白能够与His标签的单克隆抗体发生特异性反应,具有良好的反应原性。琼脂扩散试验结果显示抗体效价为1∶8。真核表达的dUTPase蛋白在转染的BHK21细胞中主要分布在细胞质中。本研究结果为进一步研究dUTPase蛋白的功能奠定了一定的理论基础。