鸭疫里氏杆菌敏感烈性噬菌体RAP44的生物学特性

为了解鸭疫里氏杆菌烈性噬菌体RAP44的临床应用潜力,按常规方法对其生物学特性进行了测定。结果显示,该噬菌体在pH5～pH9的环境中稳定;55℃以下作用30min仍可保持较高裂解活性;加入15mmol/L的Mg2+或20mmol/L的Ca2+后噬菌体RAP44的出斑率分别提高61.9%和53.8%;最佳感染复数为1/40;潜伏期为10min,裂解期为40min,裂解量为83;SDS-PAGE分析结果显示,有2种主要的衣壳蛋白,分子质量分别为40ku和17ku;其基因组约为40kb。表明,噬菌体RAP44潜伏期短,裂解量大,可作为生物防治鸭疫里氏杆菌的候选噬菌体株。     

一种改进的高效模拟抗原表位噬菌体的筛选方法

以抗红斑丹毒丝菌多克隆抗体为研究对象,首先加入噬菌体与抗体作用,保证目的噬菌体与抗体的高效结合,再通过蛋白A和蛋白G能快速、高亲和力吸附抗体Fc段的特性,将抗体-噬菌体复合物固定在酶标孔中;经洗涤和洗脱后将筛选的噬菌体稀释,分装到10块96孔培养板中扩增。第1轮筛选所获得的噬菌体种类一般少于1×104个,经约1 000倍稀释后,每个酶标孔中扩增的噬菌体少于10个,这将极大地降低噬菌体因竞争扩增而丢失的概率,甚至无噬菌体丢失。结果显示,相比于传统方法从224个样品中获得36个多肽,本次从100个样品中就获得了72个多肽。同时,为满足大量噬菌体样品的验证工作,采用加入40 m L/L吐温-80的培养基在10 m L离心管中以2 m L体积扩增噬菌体,最终的噬菌体效价提高了317%,总量超过8×1010,足以满足后续试验的要求。该改进的方法可以显著提高噬菌体筛选的效率,可操作性强,具有广泛的普遍适用性。     

一株奶牛乳腺炎金黄色葡萄球菌噬菌体的分离鉴定及其生物学特性的研究

本研究旨在分离鉴定奶牛乳腺炎金黄色葡萄球菌噬菌体,并研究其生物学特性。利用双层琼脂噬菌斑法从生活污水中分离金黄色葡萄球菌噬菌体;通过核酸酶处理分析核酸类型;采用负染法电镜观察噬菌体的形态和大小;同时测定其最佳感染复数、一步生长曲线和裂解谱。结果显示,本研究分离到1株烈性金黄色葡萄球菌dsDNA噬菌体,命名为噬菌体SAGD1。该噬菌体头部呈二十面体,直径约98nm,有一带伸缩尾鞘的长尾,大小约14nm×200nm,属于肌尾噬菌体科。该噬菌体的最佳感染复数为0.01;感染宿主菌潜伏期约20min,裂解期约30min,裂解量为80。且该噬菌体能裂解1株表皮葡萄球菌及35株金黄色葡萄球菌。结果表明,本研究分离的烈性噬菌体具有金黄色葡萄球菌生物抑菌剂的应用潜力。     

一株铜绿假单胞菌噬菌体的分离鉴定及其生物学特性研究

为控制铜绿假单胞菌的感染或污染提供生物制剂,分离到1株新的铜绿假单胞菌噬菌体,并研究其生物学特性。以铜绿假单胞菌为宿主细菌,从山西太谷某养鸡场的污水粪便混合物中分离出噬菌体。采用双层琼脂法对该噬菌体进行了分离和表征鉴定,用透射电镜（TEM）观察噬菌体的形态和大小,同时测定了噬菌体滴度、感染复数（MOI）、体外抑菌活性、一步生长曲线、温度、pH和氯仿稳定性。提取分离的噬菌体DNA,通过测序方法进行序列分析。结果显示,本研究分离出1株铜绿假单胞菌的烈性噬菌体,透射电镜显示该噬菌体属于肌病毒科,命名为v B＿PaeM＿TG2。噬菌斑大小为1～2 mm,最佳MOI为0.1,潜伏期约为10 min,暴发期约为30 min。v B＿PaeM＿TG2对温度、氯仿和pH具有良好的耐受性。v B＿PaeM＿TG2是双链环状DNA,基因组大小为206 910 bp,平均GC含量为62.07%,预测有387个开放阅读框。结果表明,分离的铜绿假单胞菌噬菌体v B＿PaeM＿TG2潜伏期较短,裂解能力强,在高温、高氯仿浓度和宽pH范围下比较稳定。本研究为铜绿假单胞杆菌病的防治提供了新的理论支持。     

鸡传染性腔上囊病病毒的提纯和检测

在人工感染IBDV 鸡的腔上囊组织液中加入氯仿,经4000 r/ min 离心30 min ,除去腔上囊组织蛋白,然后用硫酸铵沉淀病毒。提纯后的病毒颗粒直径为60 n m 左右,无囊膜。用紫外分光光度计测定,病毒蛋白含量为4 .0 m g/ m L;用琼脂扩散试验检测,其效价为1∶16 ;用IBDELISA 快速诊断盒检测,其效价为1∶320 。     

沙门菌烈性噬菌体的分离鉴定及其生物学特性的研究

以1株肠炎沙门菌(CICC21482)为宿主菌,从湖北省某规模化养猪场的污水中分离得到1株烈性沙门菌噬菌体,命名为SP01,并对其生物学特性进行了初步研究。采用双层平板法筛选并纯化噬菌体,观察噬菌斑的形态;采用透射电镜观察SP01颗粒;酚-氯仿法提取SP01核酸,酶切分析其核酸类型。同时对噬菌体SP01的最佳感染复数(multiplicity of infection,MOI)、一步生长曲线、热稳定性、p H稳定性、噬菌体SP01对细菌的裂解曲线及裂解谱等生物学特性进行了研究。结果,噬菌体SP01噬菌斑形态呈圆形、透亮,边界清晰,无晕环,直径约为1~2 mm;电镜下可见噬菌体SP01有一正多面体立体对称头部,直径约63 nm,含非收缩性尾部,尾长约158 nm,为长尾科噬菌体;提取基因组,酶切鉴定该噬菌体核酸类型为双链DNA;当MOI=0.1时,子代噬菌体滴度较高;噬菌体SP01除对本身宿主菌产生裂解外,还裂解猪霍乱沙门菌和都柏林沙门菌;一步生长曲线试验结果显示,其感染宿主菌的潜伏期约为20 min,裂解期约为60 min,平均裂解量约为120 PFU/cell;噬菌体SP01在20~40℃稳定,在p H=4.0~11.0稳定;对体外培养的特定血清型的沙门菌具有良好的裂菌效果。上述结果表明,噬菌体SP01为1株沙门菌烈性噬菌体,对不同温度、p H的环境均有较强的适应能力且杀菌能力较强,具有开发为抗沙门菌制剂的潜力。     

禽呼肠孤病毒S1133株在LMH细胞系中增殖特征的研究

为研究禽呼肠孤病毒(ARV)在鸡肝癌细胞(LMH)中的增殖特性,本研究将ARV S1133毒株感染LMH细胞,连续传代3次,观察细胞病变(CPE),通过RT-PCR鉴定病毒,并进一步研究病毒的增殖特性。结果显示,ARV S1133毒株能够在LMH细胞中很好地增殖,并出现典型的CPE。一步生长曲线结果显示,S1133感染LMH细胞后的前12 h为潜伏期,12 h~24 h为快速增长期,第24小时的效价达到最大,TCID50为10-9.2/0.1 m L。本研究为进一步研究ARV的致病机理和研制细胞灭活疫苗提供了良好的操作平台。     

抗己烯雌酚噬菌体单链抗体库的构建

利用噬菌体表面展示技术、绕过杂交瘤技术,提取经DES-BSA免疫的BALB/c小鼠脾细胞总RNA,用相应引物扩增小鼠免疫球蛋白VH基因和VL基因,构建VH、VL抗体库.通过重叠延伸PCR(SOE-PCR),以(Gly4Ser)3为连接肽,将VH基因和VL基因连接成VH-Linker-VL,在Sfi Ⅰ+Not Ⅰ酶切位点定向插入pCANTAB-5E噬菌体载体,转化大肠杆菌TG1后,经M13K07辅助噬菌体拯救,构建成了全套抗己烯雌酚单链抗体表面展示文库.噬菌体中scFv基因的插入率为87.5%,经M13K07超感染后,其噬斑计数的效价为2.2×1011PFU/mL.结果表明,抗己烯雌酚的单链抗体库的构建,为进一步富集筛选并表达己烯雌酚单链抗体奠定了基础.     

猪瘟兔化弱毒疫苗不同免疫方法的免疫效果试验

将猪瘟兔化弱毒疫苗按后海穴和常规肌肉免疫注射,对免疫效果进行比较试验。选60 日龄健康三元杂交猪100 头,分为4 组。A 组:后海穴全量注射疫苗2 m L/ 头,30 头;B 组:后海穴半量注射疫苗1 m L/ 头,30 头;C 组:肌肉全量注射疫苗2 m L/ 头,30 头;D 组:不注射疫苗健康对照,10 头。免疫后30 d 测定血凝( HA) 效价,结果显示,A 组与C 组相比,差异极显著( P< 0 .01) ;B 组与C 组相比,差异显著( P< 0 .05) ;A 组与B 组相比,差异极显著( P< 0 .01) 。试验结果还表明,后海穴穴位注射安全可靠,免疫猪无不良反应,免疫后血清抗体效价显著提高。     

肉食兽类细小病毒TaqMan-MGB荧光定量PCR方法的建立与应用

为建立检测肉食兽类细小病毒荧光定量PCR方法和探索细小病毒基因组拷贝数与病毒含量之间的相关性,在肉食兽类细小病毒VP2基因区分别设计了1对保守引物和1条TaqMan-MGB标记的水解探针,通过对貉细小病毒(RDPV)LN10-1株VP2基因上的长度为92bp的保守片段进行PCR扩增,构建标准重组质粒,由已知浓度的重组质粒通过荧光定量PCR体系建立标准曲线,建立了检测肉食兽类细小病毒基因组拷贝数的荧光定量PCR方法。结果显示,该检测方法在3.50×102～3.50×107 copies/μL范围内与Cp值呈良好的线性关系(R2可达0.999),最低检测浓度为35.0copies/μL。通过标准曲线得出RDPVLN10-1株样品的目标片段拷贝数,将拷贝数值与TCID50值进行相关性分析;分析结果显示,基因组拷贝数值与病毒TCID50值之间存在极显著的正相关关系(P<0.01),血凝效价与病毒TCID50值存在显著的正相关关系(P<0.05)。结果表明,与用血凝效价测定病毒含量的方法相比,用本试验建立的荧光定量PCR技术测得的病毒拷贝数值更能准确地代表活病毒的含量。     

产志贺毒素大肠杆菌噬菌体vB_EcoM_PHB05的生物学特性及全基因组分析

产志贺毒素大肠杆菌又称产Vero细胞毒素大肠杆菌,是一种可引起水样腹泻、溶血性尿毒综合征、出血性结肠炎等的人兽共患肠道致病菌。以一株产志贺毒素大肠杆菌为宿主菌,从湖北某规模化养猪场的污水中分离得到一株烈性产志贺毒素大肠杆菌噬菌体,命名为v B_Eco M_PHB05。采用双层平板法筛选并纯化得到一株噬菌体,采用透射电镜观察噬菌体颗粒;使用Ion Torrent测序平台进行噬菌体全基因组测序,同时对噬菌体最佳感染复数(MOI)、一步生长曲线、裂解谱等生物学特性进行研究。结果表明,噬菌体v B_Eco M_PHB05在电镜下可见有一正多面体立体对称头部(直径约72 nm),含收缩性尾部(尾长约45 nm,尾宽20 nm),为肌尾科噬菌体;提取基因组,酶切鉴定该噬菌体核酸类型为双链DNA;其最佳感染复数为0.1;一步生长曲线试验结果显示,噬菌体v B_Eco M_PHB05潜伏期约为20 min,平均裂解量约58 PFU/cell;基因测序结果表明,该噬菌体全基因组全长147 659 bp,G+C含量37.5%。噬菌体v B_Eco M_PHB05除对本身宿主菌产志贺毒素大肠杆菌(Escherichia coli O34)产生裂解外,还裂解其它产志贺毒素大肠杆菌和沙门菌。噬菌体v B_Eco M_PHB05为一株广谱烈性噬菌体,其基因组中不含耐药基因及毒力基因,具有开发为抗产志贺毒素大肠杆菌制剂的潜力。     

猪传染性胃肠炎病毒间接免疫荧光检测方法的建立

为建立猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)直观、特异和快速的检测方法,将TGEV接种PK-15细胞后,以抗TGEV N蛋白的单克隆抗体为一抗,荧光素FITC标记的山羊抗小鼠Ig G为二抗,建立了TGEV的间接免疫荧光(IFA)检测方法。结果显示,TGEV的最佳接种效价为1×102TCID50,培养时间为24 h,细胞最佳固定液为40 m L/L多聚甲醛,最佳封闭条件为10 g/L BSA 37℃封闭30 min,一抗的最佳使用浓度为1 ng/L,二抗的最佳稀释度为1∶100。对常见的猪流行性腹泻病毒、猪轮状病毒和猪圆环病毒2型等猪病病原检测均为阴性。结果表明,建立的检测方法对TGEV具有良好的特异性。本研究建立的方法为TGEV的实验室诊断及TGEV在感染细胞中的定位和动态分布提供了有效的检测手段。     

β-玉米赤霉烯醇单克隆抗体的研制及CiELISA检测方法的建立

为建立一种针对β-玉米赤霉烯醇(β-ZOL)快速准确的检测方法,笔者用活性酯法将β-ZOL与牛血清白蛋白(BSA)和卵清白蛋白(OVA)偶联合成人工完全抗原,纯化鉴定后免疫BALB/c小鼠。经筛选最终获得1株稳定分泌抗β-ZOL抗体的细胞株1F5。利用该抗体建立检测β-ZOL的间接竞争酶联免疫吸附试验(CiELISA)方法。结果显示,β-ZOL的药物抑制标准曲线在浓度为5～500 ng/m L时线性关系良好,标准曲线方程为y=0.406 3x-0.204 2(R~2=0.990 4),IC_(50)为53.19 ng/m L,检测下限(LOD)为6 ng/m L。该单克隆抗体对β-ZOL的抑制率为100%,与α-玉米赤霉烯醇、玉米赤霉烯酮、β-雌二醇、呕吐毒素、伏马毒素等基本无交叉反应。牛奶样品β-ZOL添加回收试验显示,β-ZOL的回收率为91.24%～110.07%,变异系数为6.17%～8.73%。说明建立的检测β-ZOL的CiELISA方法稳定可靠。     

马波沙星在多杀性巴氏杆菌感染的小鼠体内的药动学研究

本试验通过建立多杀性巴氏杆菌感染的小鼠肺炎模型,研究马波沙星在肺部感染小鼠体内的血浆、肺组织、上皮细胞衬液的药动学。小鼠肺部感染多杀性巴氏杆菌后,单剂量皮下注射10 mg/kg的马波沙星。采用高效液相色谱法测定血浆、肺组织、支气管肺泡灌洗液中的药物浓度,用WinNonLin5.2.1软件提供的非房室模型处理药物浓度—时间数据。结果显示,血浆中的主要药代动力学参数达峰时间(t_(max))为0.5 h,达峰浓度(C_(max))为3.58 g/m L,药时曲线下面积(AUC0-24h)为6.91 g/(mL·h),消除半衰期(t1/2β)为2.87 h;肺组织中的主要药代动力学参数tmax为0.25 h,C_(max)为8.14 g/m L,AUC0-24 h为15.89 g/(m L·h),t1/2β为3.56 h;上皮细胞衬液(ELF)中的主要药代动力学参数tmax为0.5 h,Cmax为3.89 g/m L,AUC0-24h为9.58 g/(m L·h),t_(1/2β)为1.98 h,ELF中AUC与血浆游离药物AUC的比值为1.98。结果表明,马波沙星在肺部渗透能力较强,这为马波沙星治疗呼吸道感染提供了实验依据。     

马动脉炎病毒的血凝性研究

在RK-13细胞上培养的马动脉炎病毒(Equine viral arteritis,EAV)在4℃、室温和37℃条件下,用多种动物的红细胞进行血凝试验,病毒在不同温度下均可凝集小鼠和鸡的红细胞,但不能凝集牛、绵羊、山羊、马、猪、豚鼠、仓鼠、兔及鹅的红细胞.将病毒用吐温-80和乙醚处理后,血凝活力会显著增强,其HA效价比未经处理的病毒高4-8倍,且血凝像更加清晰.处理病毒的最适条件是在冰浴状态下用终浓度0.6-1.25 mL/L吐温-80振荡处理15-60 min,再加1/2体积的乙醚振荡作用5-15 min.     

妊娠期牦牛子宫肉阜上皮细胞的培养

为建立一种稳定、简便地获得较高纯度的牦牛子宫肉阜上皮细胞的方法,分别采用组织块种植法和联合消化法对妊娠8～10周龄牦牛的子宫肉阜上皮细胞进行原代培养及分离纯化,测试其培养的最适FBS浓度及pH值,并观察其大体形态等。结果显示,胎盘组织样品在37℃下,采用胰蛋白酶和胶原酶1∶1联合消化排除法分离子宫肉阜上皮细胞的效果好。pH6.8～7.0、含150mL/L FBS的DMEM/F12培养基适宜牦牛子宫肉阜上皮细胞的原代培养,pH6.8～7.0、含100mL/L FBS的DMEM/F12培养基较适宜传代培养。传代5次后经透视显微镜观察发现,细胞为上皮样形态,呈片状铺石路样生长。表明,用联合消化排除法可简单、有效地获得较高纯度的牦牛子宫肉阜上皮细胞。     

钙敏感受体参与镉致原代大鼠成骨细胞损伤

为探究钙敏感受体(CaSR)在镉致原代大鼠成骨细胞损伤中的作用,本研究用不同浓度的镉(1、2、5和10μmol/L)处理原代大鼠成骨细胞3 h,或用2μmol/L镉处理成骨细胞不同时间(10 min、30 min、1 h、3 h、6 h和12 h),或用2μmol/L镉与CaSR抑制剂/激活剂共处理成骨细胞3 h。通过Western-blot检测CaSR蛋白表达水平,q RT-PCR检测CaSR基因转录水平,Hoechst33258染色观察细胞核形态变化。结果显示,不同浓度的镉处理以及2μmol/L镉处理成骨细胞不同时间,均能显著增强成骨细胞中CaSR蛋白的表达水平;镉处理显著升高成骨细胞中CaSR基因的转录水平;CaSR抑制剂可缓解镉对成骨细胞细胞核的损伤,CaSR激活剂加剧镉对成骨细胞细胞核的损伤。上述结果表明,Ca SR在镉致原代大鼠成骨细胞损伤过程中发挥着重要作用。     

猪流行性腹泻病毒细胞适应毒LJB-03株在三种Vero细胞上增殖效果的比较

为探究猪流行性腹泻病毒(PEDV)细胞适应毒LJB-03株在3种Vero细胞上的增殖特性,分别以正常Vero细胞、适应无血清培养基的Vero细胞和稳定表达跨膜丝氨酸蛋白酶2 (TMPRSS2)的Vero/TMPRSS2细胞(繁殖PEDV时无须添加胰酶)为宿主细胞,繁殖PEDV LJB-03株,观察这3种细胞接毒后的病变特点和病变时间,利用空斑法比较其增殖特性,并以间接免疫荧光和电镜技术鉴定病毒的增殖。结果表明,PEDV LJB-03株在正常Vero细胞和适应无血清培养基的Vero细胞上增殖时需添加的胰酶最佳质量浓度为7ug/m L;在这3种细胞上增殖时的最佳感染复数均为0.01;PEDV LJB-03株在3种细胞上效价达到峰值的时间均为36 h,其中在正常Vero细胞上病毒效价最高为7.17×10~7PFU/m L,在Vero/TMPRSS2细胞上病毒效价为3.33×10~7PFU/m L,在无血清Vero细胞上的病毒效价为2.85×10~7PFU/m L。综上所述,正常Vero细胞上PEDV LJB-03株的病毒效价可达其他2种细胞的2倍以上,但在培养病毒时正常Vero细胞需添加胰酶和血清,因此,适应无血清培养基的Vero细胞与Vero/TMPRSS2细胞在培养PEDV LJB-03株时更具有潜力。     

鹅副黏病毒广西分离株生物学特性的研究

采用鸡胚接种和细胞培养的方法 ,从广西武鸣县某鹅场患病鹅脑、肝、脾中分离获得了 2株病毒 ;经RT PCR、HA和HI试验等研究 ,证实其为鹅副黏病毒。经测定 ,分离毒 2 3 7 F3株的ELD50 为 10 - 7.2 5/0 .1mL ,TCID50 为 10 - 6 /0 .1mL ,MDT为 38.8h ,ICPI为 2。将该分离毒 10倍稀释 ,接种鸡胚成纤维细胞 ,4 0h后出现细胞病变 ,证实该分离毒为强毒株。病毒能凝集鸡、番鸭、鸽、猪、山羊、兔、豚鼠、黄鳝及人O型红细胞。 5 6℃ 10min、6 0℃ 10min、pH 4溶液处理 1h均不能使该病毒灭活 ,而 5 0mL/L氯仿处理 10min、6 0℃水浴 30min能灭活该病毒。人工感染的 11日龄雏鸡全部发病和死亡 ;感染的 10日龄雏鹅 6 0 %发病 ,发病鹅全部死亡 ;感染的 30日龄肉鸽发病率达 83.3%(5 /6 ) ,死亡率 10 0 %。对 1日龄肉鸭无致病性     

一株羊肠道病毒的分离鉴定及其基因组特征分析

本研究利用宏基因组测序技术,从死亡湖羊淋巴组织中检测出小反刍兽疫病毒与羊肠道病毒混合感染,为了分离羊肠道病毒,采取病毒总RNA转染BHK21细胞方法,连续传代后,通过致细胞病变、测序、TCID50测定和病毒一步生长曲线、电镜观察等鉴定分离出病毒,并与参考毒株比对分析分离病毒的基因特征。结果显示,转染病毒总RNA的BHK21细胞传至第2代就出现了明显的致细胞病变效应,测序证明培养物中仅含羊肠道病毒,其基因组全长为7 446 nt,其中5′UTR长821 nt,3′UTR长109 nt,ORF长6 516 nt,与参考毒株比较可划分为G种肠道病毒,病毒粒子大小为20～30 nm,第6代细胞毒感染8 h时TCID50值最高,为10-4.2/0.1 m L,命名为JSNT/1/2022株。本研究首次利用组织病料RNA转染细胞的方法成功分离出1株羊肠道病毒,说明羊肠道病毒核酸具有感染性,为羊肠道病毒的分离鉴定探索了一种更为可靠的方法,也为羊肠道病毒相关基础与应用研究奠定了病原学基础。