靶向脑心肌炎病毒VP1基因的shRNA对脑心肌炎病毒复制的抑制作用

选择脑心肌炎病毒(EMCV)VP1基因,探讨了shRNA对EMCV复制的影响。设计合成4对编码siRNA的VP1基因的DNA序列,分别构建pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR干扰载体X109-1、X109-2、X109-3和X109-4,脂质体介导转染至BHK21细胞,接种EMCV。病毒TCID50和实时荧光定量PCR结果表明,4种重组EMCV VP1shRNA对EMCV的复制均有抑制作用,其中X109-2的抑制作用最显著。X109-2转染BHK21细胞后分别接种EMCV、口蹄疫病毒(FMDV)、乙型脑炎病毒(JEV),EMCV的lgTCID50为3.5,FMDV和JEV的lgTCID50均在7.0以上,说明重组shRNA质粒对EMCV复制的抑制具有明确的特异性和干扰的靶向性。X109-2和pEGFP-VP1真核表达载体共转染CHO-K1细胞后,RT-PCR和Western-blot检测结果表明,VP1shRNA可抑制pEGFP-VP1在细胞中的蛋白表达,进一步证明了干扰载体的靶向性。上述结果为进一步研究EMCV的感染和复制机制奠定了基础。     

脑心肌炎病毒VP1结构蛋白的可溶性表达及鉴定

为获得可溶性表达的脑心肌炎病毒(EMCV)结构蛋白VP1片段,将EMCV VP1基因克隆到原核表达载体pGEX-4T-1中,并转化大肠杆菌BL21(DE3)表达菌中。采用不同温度、不同IPTG浓度及不同诱导时间诱导目的蛋白表达,以筛选VP1融合蛋白可溶性表达的最佳条件,并通过Western-blotting检测最佳条件下表达蛋白的免疫活性。PCR、酶切鉴定及测序结果表明,VP1基因已克隆入pGEX-4T-1质粒。经优化,确定VP1融合蛋白可溶性表达的最佳条件为:当D600nm值为0.4～0.6时,以0.25mmol/L IPTG于25℃条件下诱导表达12h。Western-blotting结果显示,诱导表达的蛋白具有免疫活性。     

表达鹅细小病毒VP3基因的重组腺病毒的构建及其免疫原性分析

为构建表达鹅细小病毒(GPV)VP3基因的重组腺病毒,并检测其对雏鹅的免疫效果,将GPV VP3基因克隆至腺病毒表达系统穿梭质粒,构建了重组穿梭质粒pacAd-VP3;将经PacⅠ酶切线性化的重组穿梭质粒与骨架质粒共转染HEK293AD细胞,得到重组腺病毒rAd-VP3。采用RT-PCR、Western-blot和间接免疫荧光试验鉴定GPV VP3基因在真核细胞中的表达,用rAd-VP3免疫1月龄雏鹅,检测血清抗GPV蛋白抗体水平。结果显示,重组腺病毒rAd-VP3能感染HEK293AD和GEF细胞并表达GPV VP3蛋白,增殖至第6代重组病毒的效价可达108.23 TCID50/0.1mL;rAd-VP3能诱导雏鹅产生抗GPV特异抗体,免疫后第28天血清中抗GPV VP3蛋白抗体仍维持较高水平。结果表明,rAd-VP3具有良好的免疫原性,可作为一种安全有效的病毒活载体疫苗用于鹅细小病毒病的免疫预防。     

脑心肌炎病毒VP1基因重组腺病毒的构建及对小鼠免疫效果的研究

为构建脑心肌炎病毒(EM CV)VP1基因的重组腺病毒,以期为EMCV疫苗研制提供试验依据。扩增EMCV VP1基因并与载体p Yr-adshuttle-4连接构建p Yr-ads-4-VP1穿梭载体;穿梭质粒通过体外重组与腺病毒载体进行重组,获得p Ad-VP1-EG FP重组腺病毒载体,将此载体于H EK 293细胞中包装最终成功获得r Ad-VP1-EGFP重组腺病毒,并测定其TCID50;构建的重组腺病毒感染细胞后在基因水平、蛋白水平对VP1进行检测;最后通过对小鼠免疫重组腺病毒后进行EMCV攻毒试验,验证其免疫效果。结果显示,成功构建了EMCV VP1基因重组腺病毒r Ad-VP1-EGFP,测得其TCID50为10-8.5/m L;感染细胞后基因水平及蛋白水平均可检测到VP1基因的表达;重组腺病毒免疫小鼠后的存活情况表明,重组腺病毒对小鼠有较好的免疫效果,且二次免疫后保护率显著高于单次免疫。结果表明,本试验成功制备了EMCV基因重组腺病毒,且对小鼠具有较好的免疫效果,可为进一步开发EMCV基因工程疫苗奠定基础。     

A型塞内卡病毒P12A-3C基因真核表达质粒的构建及其免疫效力的研究

为构建A型塞内卡病毒(SVA)P12A-3C基因的真核表达质粒,提取SVACH-FJ-2017株的RNA,经RT-PCR方法扩增得到衣壳前体蛋白P12A基因和蛋白酶3C基因,利用融合PCR方法获得P12A-3C基因并将其构建到真核表达质粒pc DNA~(TM)3.1/myc-His(-)上,获得表达质粒pCD-P12A-3C,用脂质体Lipofectamine~(TM)2000将该质粒转染293T细胞后,进行间接免疫荧光(IFA)检测;且用Myc单抗和SVA VP1单抗进行Western-blot分析;大量提取并纯化表达质粒,免疫小鼠后用间接ELISA法检测抗体水平变化情况。结果,SVA真核表达质粒pCD-P12A-3C经酶切及测序鉴定证明构建正确,转染293T细胞后IFA可见明显的绿色荧光,表明P12A-3C基因可在细胞内表达;将转染细胞裂解后进行Western-blot分析,结果显示该质粒可表达3C蛋白,且表达产物可与SVA VP1单抗发生特异性反应;免疫小鼠后抗体检测结果表明,二免后第14天,免疫小鼠抗体水平比对照组明显增高;该结果表明本研究构建的真核表达质粒pCD-P12A-3C可正确表达相应蛋白,且所表达的蛋白具有良好的反应原性和免疫原性。结论:本研究成功构建了A型塞内卡病毒P12A-3C基因真核表达质粒并进行了免疫效力初步验证,为A型塞内卡核酸疫苗的研制奠定了基础。     

猪脑心肌炎病毒非结构蛋白2C的原核表达及其反应原性

针对猪脑心肌炎病毒(EMCV)非结构蛋白2C基因设计合成了1对特异性引物,通过RT-PCR扩增得到了2C基因片段.将2C基因定向克隆入原核表达载体pGEX-6P-1中,构建了重组原核表达质粒GEX-6P-2C,并将其转化大肠杆菌BL21感受态细胞,经用0.1 mmo1/L IPTG诱导,成功表达了62 ku的目的重组蛋白.Western-b1ot分析表明,表达的2C重组蛋白可以分别被猪源或兔源抗EMCV阳性血清识别;以浓度为0.5μg/mL的重组蛋白包被聚苯乙烯微量反应板,能够特异性地检测到猪抗EMCV抗体.证明表达的EMCV重组非结构蛋白2C具有良好的反应原性,可以替代EMCV全病毒进行安全、特异、敏感的基于重组诊断抗原的猪脑心肌炎血清学检测技术研究.     

猪脑心肌炎病毒P1和P12A3C基因重组腺病毒的构建及其在小鼠体内的免疫应答

为研制脑心肌炎病毒(EMCV)新型活载体疫苗,首先将病毒核衣壳前体多肽P1与P12A3C串联基因分别插入穿梭质粒pDC316中,构建得到了重组穿梭质粒pDC316-P1和pDC316-P12A3C。将其分别与辅助质粒pBHGloxΔE1、3Cre共转染293细胞,成功包装出重组腺病毒Ad-P1和Ad-P12A3C。免疫过氧化物酶单层试验确证,重组腺病毒可表达目的蛋白。分1次和2次肌肉注射免疫小鼠,然后通过间接ELISA试验和中和试验评价其诱导的特异性体液免疫水平。结果,Ad-P1诱导的VP1特异总抗体IgG水平显著高于Ad-P12A3C,但不能检测到明显的中和抗体(<1∶8);Ad-P12A3C能诱导产生良好的中和抗体(1∶32~1∶128),用1×108TCID50剂量EMCV BJC3株攻毒,Ad-P12A3C免疫组能获得100%的保护,而Ad-P1免疫组仅能获得部分保护。以上结果表明,Ad-P12A3C可作为良好的EMCV腺病毒活载体疫苗。     

Asia 1型口蹄疫病毒多抗原表位真核表达质粒的构建及表达

为了构建Asia 1型口蹄疫病毒多抗原表位真核表达质粒,采用多表位基因串联策略,合成包括口蹄疫病毒T细胞和B细胞表位基因的基因片段F,该基因片段由结构蛋白VP1上的2个B细胞表位(VP1135-159aa、VP1194-211aa)基因、非结构蛋白3A和3D上的T细胞表位(3A21-35aa、3D795-803aa)基因组成。利用限制性内切酶HindⅢ、XbaⅠ将基因片段F克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+)。经酶切鉴定、序列分析正确后,利用LipofectamineTM2000将阳性重组质粒pc-F转染至BHK-21细胞。Western-blot和IFA分析结果显示,所表达的蛋白大小约25.4ku,能够与Asia 1型口蹄疫病毒标准兔抗血清发生特异性反应,证实所表达的蛋白具有较好的反应原性。结果表明,Asia 1型口蹄疫病毒多抗原表位真核表达质粒pc-F构建成功,且能在BHK-21细胞中正确表达。     

蓝舌病毒VP6蛋白的原核表达及抗体制备

本试验首先利用RT-PCR技术扩增获得了蓝舌病毒1型(BTV1)的VP6基因,然后将其克隆到表达载体pPRoEx-HTb上,构建重组表达质粒pPro-VP6,转化大肠杆菌BL21感受态细胞后用IPTG诱导表达,优化表达条件,纯化重组表达的VP6蛋白,免疫新西兰白兔制备抗VP6蛋白的多克隆抗体,利用Western-blot和细胞免疫荧光试验检测抗体的特异性及VP6蛋白在BTV1感染细胞中的分布。结果显示,重组VP6蛋白在大肠杆菌中以包涵体的形式表达,利用组氨酸标签纯化树脂获得了高纯度的VP6蛋白;制备的抗VP6多克隆抗体不仅可与重组表达的VP6蛋白反应,而且可与BTV1感染细胞中的天然VP6蛋白发生特异性反应;在BTV1感染的BHK21细胞中检测到了VP6蛋白的特异表达,且分布于整个细胞质中。本研究成功表达了BTV重组VP6蛋白并制备了相应的特异抗体,为进一步揭示VP6蛋白的特性和功能奠定了基础。     

口疮病毒VEGF基因的原核表达及亚细胞定位

为了对口疮病毒(ORFV)VEGF基因进行原核表达和亚细胞定位研究,PCR扩增VEGF基因,并将其分别克隆至原核表达载体p ET-32a(+)和真核表达载体p EGFP-C3中。将原核表达重组质粒转化至E.coli Rosseta感受态细胞中,经IPTG诱导表达目的蛋白。将表达产物纯化后免疫BALB/c小鼠,制备多克隆抗体血清,并利用琼脂扩散试验检测其效价。将真核表达重组质粒转染BHK21细胞,利用激光共聚焦观察VEGF蛋白在BHK21细胞中的亚细胞定位。结果表明:VEGF蛋白在大肠杆菌中获得了高效表达,主要以包涵体形式表达,蛋白分子质量大小约为33 ku。Western-blot结果表明,VEGF蛋白具有良好的反应原性,制备的多克隆抗体效价达1∶8。VEGF蛋白在转染BHK21细胞后主要在细胞质中表达,且能够与制备的多抗血清反应。本研究为进一步研究该蛋白的功能奠定了一定的基础。     

中国荷斯坦奶牛MD-2基因在HEK293细胞中的表达及稳定细胞系的构建

将中国荷斯坦奶牛髓样分化蛋白-2 (myeloid differentiation protein-2,MD-2) cDNA全长克隆至pEGFP-N1真核表达载体,利用双酶切与测序进行鉴定。经脂质体2000,将pMD-2-EGFP重组质粒转染至HEK293细胞中,应用倒置荧光显微镜、流式细胞术和Western-blot分别检测融合蛋白的表达,利用极限稀释的方法获取单细胞,并利用G418抗性筛选,获取稳定细胞系。结果发现,目的基因含有一个483 bp的开放阅读框,编码160个氨基酸。双酶切鉴定和测序结果均表明,MD-2基因编码区正确插入pEGFP-N1真核表达载体,读码框架正确,MD-2-EGFP融合蛋白在HEK293细胞中,能够成功表达;极限稀释获取单细胞,用250?g/mL的G418筛选得到的细胞系,经流式细胞术和Western-blot检测,在pMD-2-EGFP稳定细胞系组,分子质量约为46 ku处,发现了特异性条带,而pEGFP-N1空载稳定细胞组,以及空白的HEK293细胞对照组,均未发现条带。综上所述,本研究成功构建了真核表达载体pMD-2-EGFP,并在HEK293细胞中能够成功表达;经极限稀释,并利用G418抗性筛选,成功获得了pMD-2-EGFP和pEGFP-N1稳定细胞系,这为进一步研究中国荷斯坦奶牛奶牛MD-2基因的生物学功能奠定基础。     

猪瘟病毒T细胞表位与猪细小病毒VP2融合基因在重组杆状病毒中的表达

将猪细小病毒分离株LJL12 VP2基因和猪瘟病毒多肽基因E290克隆至真核表达载体pMel Ba-cA,将该重组质粒与Bac-N-Blue DNA共转染昆虫细胞,并对表达产物进行分析,构建了表达猪瘟病毒T细胞表位和猪细小病毒VP2融合蛋白的重组杆状病毒。结果显示,获得了含VP2基因和E290基因的重组质粒pM-VP2-E290,昆虫细胞sf9的表达产物经SDS-PAGE、Western-blot检测后确定所表达的蛋白质分子质量大小约为67 ku,且具有天然蛋白的抗原特性。免疫电镜观察可见表达产物形成的病毒样颗粒。证实,成功构建了同时含有PPV VP2基因和CSFV特异性T细胞表位基因的重组杆状病毒,并在昆虫细胞中得到了高效表达。     

新型环形病毒AGV2的VP3基因的克隆表达及多抗制备

新型环形病毒AGV2最早于2011年报道。为建立AGV2血清学诊断方法,并探究其VP 3基因功能,本研究对AGV2的VP3基因进行了克隆、表达及多抗制备。通过将AGV2 VP3基因克隆进pGEX-6p-1原核表达载体,获得了可溶性GST-VP3融合表达产物,并利用纯化的GST-VP3蛋白制备了小鼠抗GST-VP3多克隆抗体。同时构建获得了pcDNA3.1-VP3以及EGFP-VP3两个AGV2 VP 3基因真核表达载体。间接免疫荧光试验以及EGFP观察发现,AGV2的VP3蛋白及其EGFP融合蛋白EGFP-VP3在HCT116肿瘤细胞中的表达集中于细胞核,且呈散在点状分布,类似凋亡小体。这些AGV2 VP3表达载体的构建,表达产物、小鼠多克隆抗体的获得及其在肿瘤细胞中的表达分布,为进一步研制AGV2血清学诊断方法提供了材料,为深入探究AGV2 VP3的生物学功能打下了基础。     

一株猪源脑心肌炎病毒的分离与鉴定

将江苏省某规模化猪场疑似脑心肌炎仔猪病料接种BHK-21细胞,并采用间接免疫荧光试验(IFA)、基因序列测定和动物人工感染试验进行鉴定,结果显示,BHK-21细胞接种病料样品后盲传3代出现细胞病变,病毒TCID50为10-9.2/mL;用脑心肌炎病毒(EMCV)单克隆抗体-IFA检测,在感染细胞的胞浆中可见特异性荧光;分离物的PCR扩增产物的基因序列与GenBank中的EMCV VP1基因的同源性为85.7%~99.8%;BALB/c小鼠人工感染该分离株后出现明显的临床症状和EMCV的典型病理变化,免疫组织化学试验证明,试验鼠脑组织中含有EMCV抗原,商品仔猪人工感染后未出现明显的临床症状及病理变化,证明该分离病毒为EMCV(NJ08株),且对BALB/c小鼠具有较强的致病作用。     

猪圆环病毒2型ORF2基因插入猪细小病毒VP2基因3'端对病毒样颗粒形成的影响

以猪细小病毒(PPV)四川分离株SC-1的VP2基因3'端为靶点,在第1215和1216位之间插入长约700 bp的猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2基因片段,将重组后的PPV VP2-PCV2 ORF2克隆到真核表达载体pEGFP-C1中,构建了重组质粒pEGFP.VO;经酶切和PCR鉴定后,采用脂质体介导法将重组质粒pEGFP.VO转染COS-7细胞,应用倒置荧光显微镜、电镜、免疫荧光以及生物信息学技术对表达产物进行观察分析.结果显示,重组质粒pEGFP.VO在COS-7细胞中得到表达,但在电镜下没有观察到病毒样颗粒.通过对PPV衣壳蛋白的三维结构分析及免疫荧光检测发现,PCV2 ORF2基因的插入位点位于PPVVP2基因的3'端,相应表达产物则位于VP2蛋白多肽的C端,且被其包裹在内,这可能影响了病毒样颗粒的形成,表明,PPV VP2基因3'端不适合外源基因插入构建重组病毒样颗粒.     

鹅细小病毒结构蛋白VP3优势抗原表位区的原核表达及其表达产物免疫原性的研究

为了构建鹅细小病毒亚单位疫苗候选菌株,通过软件优化分析预测鹅细小病毒结构蛋白VP3的抗原表位分布,并设计抗原表位富集区的引物,PCR扩增获得目的片段,双酶切定向连接于pET-30a表达载体,转化BL21表达菌株诱导表达,获得目的蛋白,使用该蛋白免疫SPF鸡,制备抗血清,使用鹅胚成纤维细胞原代细胞进行中和效价的测定。结果显示,成功构建了原核表达载体pET-30a-VP3,通过条件优化蛋白以可溶性形式存在,免疫制备的抗血清中和效价能够达到-2.608。结论:本研究以可溶性形式成功表达了鹅细小病毒结构蛋白VP3优势抗原表位区,且该蛋白作为免疫原具有很好的产生中和抗体的能力。     

A型塞内卡病毒衣壳蛋白的原核表达及其五聚体的组装

为实现A型塞内卡病毒(SVA)衣壳蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达并组装为五聚体,本试验以带His标签和SUMO(小泛素样修饰系统)标签的pSMK及pSMA为载体,将塞内卡病毒衣壳蛋白基因VP0、VP1和VP3构建为重组质粒pSMA-VP0、pSMK-VP1、pSMK-VP3,在大肠杆菌原核表达系统中对其进行共表达并优化诱导表达条件,包括诱导温度、诱导剂IPTG浓度、诱导前细菌D_(600)值以及诱导时间,纯化后获得SVA衣壳蛋白后进行免疫印迹分析,之后利用His-SUMO蛋白酶切除标签蛋白,在体外进行组装和鉴定。结果,A型塞内卡病毒衣壳蛋白VP0、VP1、VP3在20℃下、D_(600)值为1.1、 IPTG浓度为0.4 mmol/L、诱导12 h后蛋白表达效果最好。经超声破碎、镍柱纯化后获得VP0、VP1、VP3蛋白,免疫印迹结果表明,目的蛋白能与SVA阳性血清发生特异性反应,证实该蛋白具有良好的反应原性。动态光散射和扫描电镜检测结果显示,去除His-MUMO后还原天然构象的目的蛋白可组装成五聚体。上述研究结果为制备SVA病毒样颗粒奠定了物质基础。     

基于昆虫细胞表达的鹅细小病毒VP3蛋白的VP3-ELISA诊断方法的建立

将鹅细小病毒EP22株VP3基因克隆到杆状病毒转移载体pFast-Bac-HTB中,酶切鉴定及测序筛选出阳性重组转座载体pFastBac-VP3,转化至含有杆状病毒穿梭载体Bacmid的DH10Bac感受态细胞,构建杆状病毒表达载体,获得重组转座子rBacmid-VP3,在脂质体介导下转染Sf9昆虫细胞,获得到含鹅细小病毒VP3基因的重组杆状病毒rBV-VP3。经SDS-PAGE、Western-blot以及免疫组化试验证实,VP3基因在Sf9细胞中成功表达。利用表达的VP3蛋白建立VP3-ELISA血清学检测方法并对130份鹅血清样品进行检测,以中和试验作为金标准进行对比试验。结果显示,VP3-ELISA检测方法的特异性为100%,敏感性为96.2%,并且VP3-ELISA与其他鹅病阳性血清间不出现交叉反应性。上述研究结果表明,本研究建立的VP3-ELISA是一种特异的、灵敏的血清学诊断方法。     

蓝舌病病毒NS3蛋白的截短表达及其多克隆抗体制备

首先利用RT-PCR技术扩增获得了蓝舌病病毒1型(BTV1)NS3基因的截短片段,将其克隆至表达载体pET-30a中,构建重组表达质粒pET-NS3,转化大肠杆菌BL21 (DE3)感受态细胞后用IPTG诱导表达,可溶性分析显示,重组NS3蛋白在大肠杆菌中以包涵体形式表达。纯化重组表达的NS3蛋白,免疫新西兰白兔制备抗NS3蛋白的多克隆抗体,利用免疫印迹和细胞免疫荧光试验检测该抗体的特异性及NS3蛋白在BTV感染细胞内的分布。结果显示,制备的抗NS3多克隆抗体不仅可与重组表达的NS3蛋白反应,而且可与BTV1感染细胞中的天然NS3/NS3A蛋白发生特异性反应;在BTV1感染的BHK21细胞以及KC细胞中均检测到了NS3/NS3A蛋白的特异性表达,且分布于整个细胞质中。本研究成功表达了BTV重组NS3蛋白并制备了相应的特异性抗体,为进一步研究NS3蛋白的特性和功能奠定了基础。     

山羊NLRP3基因的克隆及其在DF-1细胞中的表达

为了解山羊NLRP3基因及其编码蛋白的生物学信息,采用RT-PCR扩增了海南黑山羊NLRP3基因并进行了序列及其编码蛋白的结构分析,构建了pIRES2-EGFP-NLRP3真核表达载体,并将其转染至DF-1细胞中进行了表达。结果表明,NLRP3基因在物种内的同源性高,种间同源性低,编码的蛋白由1 031个氨基酸组成,存在3个潜在跨膜区,分别为第401~419、435~453和884~904位氨基酸,不含信号肽;辣根过氧化物酶单层细胞免疫化学检测证实,构建的真核表达载体pIRES2-EGFP-NLRP3在DF-1细胞中成功表达。本研究结果为建立NLRP3专性表达细胞系及深入研究NLRP3在山羊抗感染免疫的机制奠定了基础。