产气荚膜梭菌EF-Tu基因的原核表达及其多克隆抗体的制备

通过PCR方法扩增产气荚膜梭菌ATCC13124株EF-Tu基因,利用原核表达载体pGEX-6P-1构建重组质粒pGEX-EF,经双酶切和测序鉴定正确后转化E.coli Rosseta,进行IPTG诱导表达,表达产物纯化后免疫大白兔制备多克隆抗体,应用间接ELISA、Western-blot和间接免疫荧光方法对所得抗体进行检测。结果显示,经1.0mmol/L IPTG诱导5h后蛋白表达量最高,并且主要以包涵体的形式存在,分子质量为69ku。间接ELISA方法检测的多抗血清效价为1∶262 144。Western-blot结果证实,重组蛋白与产气荚膜梭菌ATCC13124株制备的多克隆抗体发生特异性结合,具有良好的免疫原性。Western-blot和间接免疫荧光结果表明,多抗血清能分别与pGEX-EF重组蛋白、ATCC13124菌体裂解液、pcDNA3.1-EF-Tu瞬时转染后的BHK-21细胞及ATCC13124感染的小鼠肠组织中菌体发生特异性结合反应。上述结果表明,此多克隆抗体能够应用于临床诊断。     

产气荚膜梭菌α毒素的原核表达及间接ELISA的建立与应用

根据Gen Bank已登录的产气荚膜梭菌α毒素基因序列,设计并合成针对成熟肽的特异性引物。以C型产气荚膜梭菌总DNA为模板,PCR扩增α毒素成熟肽基因片段,构建原核表达重组质粒p ET-28a(+)-α。通过PCR鉴定、双酶切鉴定及测序鉴定后,将阳性质粒转化至BL21(DE3)感受态细胞。经IPTG诱导表达、镍柱亲和层析纯化蛋白、尿素梯度透析复性后,Western-blot鉴定表达产物。使用复性的重组蛋白作为包被抗原,通过优化间接ELISA的试验条件,确定最佳反应条件。正交试验结果表明,抗原最佳包被浓度为5.0 g/m L,血清的最佳稀释度为1∶50,酶标二抗的最佳稀释度为1∶5 000。采用已确定的间接ELISA的反应条件,对108份阴性血清的检测结果进行统计学分析,确定了间接ELISA的判定标准,即D450≥0.393为阳性,D4500.393为阴性。采用已建立的间接ELISA对58份阴性血清和50份阳性血清进行检测,结果表明建立的间接ELISA的特异性为96.5%,敏感性为98%。采用本试验建立的产气荚膜梭菌α毒素抗体间接ELISA对陕西省不同山羊场的521份山羊血清进行了检测,阳性率为92.7%。上述结果表明,该间接ELISA抗体检测方法的建立及初步应用为产气荚膜梭菌α毒素抗体检测试剂盒的研制奠定了基础。     

产气荚膜梭菌α毒素和ε毒素的共表达及其免疫原性的研究

利用PCR技术从D型产气荚膜梭菌标准株C60-2基因组中扩增出α毒素基因CPA和ε毒素基因ETX。然后将CPA、ETX分别插到双表达载体pETDuet-1上,成功构建重组质粒pETDuet-1-CPAETX。将重组质粒pETDuet-1-CPA-ETX转化入大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导,菌体蛋白样品经SDS-PAGE分析,可见43ku和34ku两条特异性条带,表明插入基因得到了表达。Western-blot结果显示,共表达的α毒素和ε毒素蛋白均能与抗毒素抗体发生反应,具有很好的反应原性。用共表达的α、ε毒素蛋白免疫小鼠,可使其血清中产生较高浓度的中和抗体,且能抵抗D型产气荚膜梭菌培养液上清的攻击,免疫保护效果明显优于ε毒素蛋白单独免疫的保护效果。以上结果表明,本研究构建的产气荚膜梭菌α、ε毒素蛋白共表达体系可以用于D型产气荚膜梭菌毒素疫苗的制备,为预防多血清型病原的多价疫苗的研制提供了思路。     

鸭肠炎病毒gB N端(60～110aa)抗原优势区的原核表达及抗血清的制备

以本实验室已克隆的鸭肠炎病毒(DEV)C-KCE株ul27基因序列为模板,设计特异性引物,PCR扩增获得编码鸭肠炎病毒gB N端第60~110aa的目的基因片段,大小为150bp。将目的基因亚克隆至原核表达载体pET-32a(+)中,阳性质粒被命名为pET-32a(+)-gB-1。经IPTG诱导,SDS-PAGE分析表明,重组蛋白以包涵体形式表达,大小约为27ku。用Ni-NTA柱亲和层析获得纯化的重组蛋白,鸭抗DEV阳性血清经间接ELISA检测证实其具有抗原性,并以此为免疫原免疫家兔制备抗血清,经间接ELISA检测,抗血清效价为1∶25 600。应用间接免疫荧光及Western-blot分析制备的抗血清的反应性,均证实抗血清可特异性识别DEV gB蛋白。分别以重组蛋白和DEV超离病毒为检测抗原进行间接ELISA,检测DEV免疫鸭的抗体消长规律,结果显示两者的抗体变化趋势一致。以上结果表明,制备的抗血清可作为DEV检测的候选试剂,表达的重组蛋白可作为DEV抗体检测的诊断抗原。     

产气荚膜梭菌β毒素和ε毒素以及腐败梭菌α毒素三联基因工程灭活疫苗的制备与免疫效力评价

为了获得高表达量的重组C型产气荚膜梭菌β毒素,鉴定其致死性和反应原性,并评价其与D型产气荚膜梭菌ε毒素和腐败梭菌α毒素共表达产物联合制成三联基因工程灭活疫苗的免疫保护效力。设计含不同酶切位点的2对引物,PCR扩增C型产气荚膜梭菌β毒素基因cpb1和cpb2,将二者克隆至pRSFDuet-1质粒,转化大肠杆菌BL21 (DE3),自诱导培养基诱导2段基因共表达。用SDS-PAGE和Western-blot以及小鼠毒性试验、抗毒素血清和中和试验对表达产物进行鉴定。将诱导收获的大肠杆菌以及D型产气荚膜梭菌ε毒素和腐败梭菌α毒素的共表达产物1∶2配比灭活制成三联灭活铝佐剂疫苗,以每只1 m L剂量皮下免疫家兔2次后,测定血清中和抗体效价,用1 MLD的C、D型产气荚膜梭菌毒素和腐败梭菌毒素分别攻击。结果显示,所构建的重组大肠杆菌BL21(pRSFDuet-cpb1-cpb2)能够表达重组β毒素,产物能够与C型产气荚膜梭菌抗毒素血清反应,且具有小鼠致死毒性,抗毒素血清可以将其毒性中和;制成联合疫苗免疫家兔,免疫血清对C型产气荚膜梭菌毒素的中和抗体效价为8 MLD/0.1 m L,对D型产气荚膜梭菌毒素的中和抗体效价为45 MLD/0.1 m L,对腐败梭菌毒素的中和抗体效价为1.5 MLD/0.1 m L;用3种毒素攻击免疫组家兔均全部保护,对照组全部死亡,达到《中华人民共和国兽药典三部(2015版)》效力检验标准。本研究为羊猝狙、肠毒血症和快疫三联疫苗的研制提供了试验基础。     

帕利亚姆病毒VP7蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备

本研究将帕利亚姆病毒(PALV)VP7蛋白的编码区序列插入原核表达质粒pET-32a(+),构建出重组质粒pET32-PALV-VP7,转化大肠杆菌Rosetta(DE3),以异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)进行重组蛋白的诱导表达。采用镍离子亲和层析进行重组蛋白的纯化,通过透析进行纯化蛋白的复性,采用Western-blot对复性后的蛋白进行鉴定。将纯化后的蛋白免疫家兔制备多克隆抗体,采用间接ELISA、Western-blot与间接免疫荧光对多克隆抗体的效价与反应原性进行分析。结果显示,在37℃与0.1 mmol/L IPTG诱导条件下,PALVVP7重组蛋白在大肠杆菌中得以高效表达,其分子质量约为43 ku,以包涵体形式存在,占菌体蛋白总量的30.4%。重组蛋白经纯化与复性处理后纯度达94.1%,Western-blot结果显示,复性后的重组蛋白可与PALV阳性血清发生特异性结合。ELISA检测结果显示,制备的家兔抗PALVVP7多克隆抗体效价可达1∶12 000。使用该多克隆抗体为一抗,可通过免疫荧光与Western-blot检测到PALV感染细胞中的VP7蛋白,表明抗体可特异性结合PALV的VP7蛋白。本研究成功在大肠杆菌中表达PALV VP7重组蛋白,并制备获得多克隆抗体,为PALV诊断试剂的开发奠定了基础。     

小反刍兽疫病毒N蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备

为开发可用于小反刍兽疫病毒(PPRV)诊断及其抗原的检测方法,参考GenBank中PPRV Nigeria75/1株N基因序列设计引物,采用RT-PCR方法获得目的基因后连接到载体pCzn1中,转化到大肠杆菌DH5α克隆菌株,经PCR和双酶切鉴定测序后,将阳性克隆转化至大肠杆菌BL21 (DE3)菌株后采用IPTG进行诱导表达。结果表明,成功地构建了含有小反刍兽疫病毒N基因的重组质粒pCzn1-N;诱导条件经过优化后N蛋白为可溶性表达,重组蛋白大小约为64 ku,能够与PPRV阳性血清较好地反应;制备的家兔多克隆抗体效价为1∶128 000,经过纯化后抗体效价为1∶64 000且具有较高的结合特异性;用间接ELISA和Western-blot对N蛋白纯化后制备的家兔多克隆抗体进行分析,发现重组N蛋白的免疫原性良好,且制备的多克隆抗体特异性良好。这表明重组的N蛋白具有较高的特异性及反应活性。     

A型产气荚膜梭菌重组α毒素对小鼠的致病性研究

为了研究A型产气荚膜梭菌α毒素(PLC)的致病性,采用PCR扩增编码产气荚膜梭菌α毒素去除信号肽的plc基因片段,构建重组质粒pGEX-plc,经IPTG诱导表达获得重组蛋白PLC。对纯化鉴定后的PLC蛋白进行细胞毒性试验,结果显示,感染后第4小时Hela细胞开始出现病变,并随时间延长而逐渐严重,说明α毒素对Hela细胞有毒性作用。进一步建立小鼠病理模型,重组PLC蛋白接种组与阳性细菌感染组的病理变化显示,小鼠发病迅速,腹部膨大,肠道臌气明显;组织学观察结果显示,被感染小鼠内脏器官出现不同程度的病理变化,以小肠各段尤为明显,表现为肠黏膜损伤、绒毛脱落等。上述结果为A型产气荚膜梭菌致病机制的研究奠定了基础。     

柔嫩艾美耳球虫AMA1蛋白多克隆抗体的制备及在乳酸乳球菌中的表达

将柔嫩艾美耳球虫子孢子顶膜抗原AMA1胞外域基因片段(EtAMA1)克隆入原核表达载体pET-30a(+)中,构建重组质粒pET-30a(+)-EtAMA1。质粒经鉴定正确后转化入大肠杆菌中筛选阳性菌,阳性菌经IPTG诱导后采用Western-blot检测目的蛋白的表达情况。用表达的重组蛋白免疫新西兰白兔制备多克隆抗体。应用间接ELISA测定抗体效价,并采用Western-blot检测抗体特异性。将EtAMA1克隆入乳酸菌表达载体pTX8048中构建阳性质粒pTX8048-EtAMA1,质粒电转化入宿主菌乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)NZ9000中筛选阳性菌pTX8048-EtAMA1-L.lactis NZ9000。阳性菌经Nisin诱导后采用Western-blot检测目的蛋白的表达情况。结果表明,EtAMA1在大肠杆菌中以包涵体形式表达。多克隆抗体的效价为218。Western-blot检测证实,制备的抗体可与子孢子反应。重组菌pTX8048-EtAMA1-L.lactis NZ9000经Nisin诱导后,采用Western-blot检测到约61ku的目的蛋白。上述研究结果为基于EtAMA1的鸡球虫病乳酸菌口服疫苗的研制提供了重要参考。     

牛结节性皮肤病病毒ORF006蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备

为探究牛结节性皮肤病病毒（LSDV）ORF006蛋白的生物学功能,制备了ORF006基因的多克隆抗体,用PCR技术获得LSDV ORF006的基因片段克隆至pET-28a原核表达载体,并转化至大肠杆菌BL21(DE3)后进行IPTG诱导表达,将纯化后的蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体。结果显示,LSDV ORF006基因全长约696 bp;pET-28a-ORF006重组质粒在大肠杆菌中于37℃经1 mmol/L的IPTG诱导12 h,成功表达约28.0 ku目的蛋白;ELISA结果显示,制备的多克隆抗体效价为1∶102 400;Western-blot结果显示,制备的多克隆抗体能特异性识别ORF006蛋白;间接免疫荧光试验表明,制备的多克隆抗体能够特异性识别LSDV感染MDBK细胞表达的ORF006蛋白。本研究为进一步探究LSDV ORF006蛋白生物学功能奠定了基础。     

简论苏联干部委任制的形成

苏联的干部委任制始于列宁时期 ,形成于斯大林时期。委任制作为俄国文化的积淀在苏联一定历史时期的存在 ,有其合理性。但是委任制毕竟要被现代社会所抛弃。斯大林非但未能及时进行改革 ,反使之登峰造极 ,最后给后代留下了遗患。     

从苏共亡党的教训看中共第四代领导集体的党风廉政策略

中国正处于国内经济体制深化改革、社会结构深刻变动、利益格局深入调整、思想观念深度更新之中，党的作风建设和反腐倡廉工作的长期性、艰巨性、复杂性日益突显出来。在这样的背景下，来重新审视苏共亡党的原因对我国当前的党风廉政实践具有重要的价值。从苏共亡党教训可知，党风廉政建设是立党之本。     

苏联解体原因研究综述

1917年11月7日,斯莫尔尼宫沸腾的欢呼声向全世界宣布了第一个社会主义国家的诞生;1991年12月25日,镰刀锤头国旗的悄然降落宣告了社会主义苏联从地球上的消失.短短74年转瞬即逝,苏联于一夜之间突然崩塌,让整个世界为之震惊和不解,同时也为中外学者研究这一20世纪的"历史之谜"留下了永恒的课题.     

伊朗巴列维王朝覆灭根源探析

巴列维国王的白色革命动摇了在伊朗乡村长期占统治地位的封建生产关系 ,促进了资本主义生产关系在伊朗的发展。伊朗传统的社会结构也因白色革命的成功推进而发生了激烈变革。经济现代化的长足进步客观上要求政治领域进行相应变革。巴列维无视这些变化 ,继续强化君主专制 ,推行独裁统治 ,致使新兴的社会阶层无权分享政治权力 ,传统的社会力量被摧毁。巴列维国王的独裁统治引起伊朗社会各阶层的普遍不满 ,推翻巴列维王朝成为伊朗社会各阶层共同的战斗目标。因此 ,白色革命后伊朗经济现代化进步趋向与政治领域滞后状态之间的矛盾构成巴列维王朝覆灭的根源     

论苏联失败的经济根源

苏联的崩溃无疑是一种社会性失败,社会性失败必须从经济基础找原因,根本的原因在于苏联的基本经济制度--计划经济制度.苏联计划经济制度的种种弊端实际是这一制度内在的不可克服的矛盾的反映,这一矛盾就是计划的指令性与个人消费的不可计划性之间的矛盾.把社会再生产的各个环节--生产、交换、分配、消费纳入统一计划,是苏联计划经济制度的存在前提.个人消费的选择性特征,决定了个人消费不可能由社会统一计划.由此便形成了否定苏联计划经济存在前提的计划与个人消费的对立.在苏联计划经济制度下,解决这一矛盾的惟一办法是压制个人消费,用供应短缺方式使原本不可能由社会统一计划的个人消费变成可以统一计划的,这实际上并没有消除这种对立.计划与个人消费的对立对社会再生产产生了致命的影响,使社会经济陷入危机循环,而危机积累到一定程度就会以猛烈的形式爆发出来,最终导致经济基础乃至整个苏联社会的崩溃.压制个人消费是苏联计划经济赖以存在的内部条件,与外部世界的制度性隔绝是其存在的外部条件,从长期看这些条件都是难以为继的.     

在拉美所"2006年拉美大选的影响与拉美左派的发展" 研讨会上的讲话

2007年1月11日,“2006年拉美国家大选及其政治走向”课题结项暨拉美大选的影响与左派发展问题研讨会在拉美所召开。中国社会科学院副院长李慎民与会并发表主旨演讲,深刻分析了当前的世界格局和政治走向,拉美左派的发展对该地区形势的影响。现全文发表如下。     

世纪之初俄罗斯经济迅速反弹的原因分析

1999年以来 ,俄罗斯经济走势一改经济转轨以来连续下滑的颓势 ,出现触底反弹并持续增长的积极迹象 ,引起国际社会的广泛关注。这种增长主要的仍是经济严重危机后的恢复性增长 ,由于制约经济增长的结构性因素的存在 ,俄罗斯经济增长的基础并不牢固。从俄罗斯转轨以来的经济走势我们可以看出俄罗斯经济持续好转的原因及经济增长前景 ,这对我国的经济发展是有一定启示的。     

纪念辛亥革命百年为促进祖国统一尽力

1911年（农历辛亥年）,在经过4月广州起义、10月武昌起义之后,爆发了全国规模的辛亥革命。两个月内即有鄂、湘、陕、赣、晋、滇、黔、苏、浙、桂、皖、粤、闽、川等省宣布独立,清政府迅速垮台。12月,孙中山先生出任中华民国临时大总统,成立中华民国临时政府,清帝被迫宣告退位。     

南海局势与应对海洋法的新发展

今年以来,南海局势发生了很大变化。菲律宾国会通过了"领海基线法案",把中国的黄岩岛和南沙群岛部分岛礁划为菲律宾领土;马来西亚前总理巴达维登上南沙群岛的弹丸礁、光星仔礁宣示主权等。这些情况的出现与海洋法的新发展有着密切的联系。因此,如何应对海洋法的新发展就成了捍卫领土主权、维护合法海洋权益的关键。     

东北经济落后原因诸说评析

振兴东北经济必须准确找出其落后的原因。现学术界提出的“结构说”、“体制说”、“国企比重过大说”、“项目怪圈说”及“东北人观念落后说” ,都有一定的合理性 ,但又都不很全面、完整 ,尚有其他原因需加以分析说明。国家在改革、发展战略与政策抉择上“失算” ,使东北地区收入过低 ,人才大量流失 ;在东北改革与发展的关键时期 ,缺乏必要的资金补偿与支持 ,这都是造成东北经济落后的决定性因素。只有全面科学地找出东北经济落后的真正原因 ,才能保证应对方针策略的正确性和有效性。