猪伪狂犬病病毒SL株gK基因的生物信息学分析

对猪伪狂犬病病毒(PRV)四川分离株(SL株)gK基因进行分子克隆,并利用生物信息学软件对gK基因进行了同源性、遗传进化树、密码子偏向性、蛋白质二级结构预测及抗原表位分析。结果显示,成功克隆了PRVSL株gK全基因,其编码区长939bp,编码313个氨基酸残基,与其他PRV分离株核苷酸序列同源性为97.6%～99.9%,与国外分离株的同源性略高于国内分离株。gK基因存在4个跨膜区及1个明显的CpG岛。表明成功克隆了PRVSL株gK基因,该基因具有潜在的抗原性。     

伪狂犬病病毒Bartha-K61株TK基因的分离鉴定

提取伪狂犬病病毒(PRV)Bartha-K61株基因组DNA,用限制性内切酶KpnⅠ充分消化,回收5.9×103b片段(J片段),将其克隆于质粒pUC119 KpnⅠ位点上,获得pBKJ.用一对针对PRV TK基因的特异性引物对重组质粒进行PCR鉴定,证明其中含有PRV TK基因.然后用KpnⅠ、PstⅠ和BamHⅠ等限制性内切酶对其进行酶切分析,确定了克隆片段的物理图谱.进一步研究证实TK基因位于其中的KpnⅠ-BamHⅠ或KpnⅠ-Pst Ⅰ片段中.然后亚克隆此KpnⅠPstⅠ片段,并进行了序列测定.     

伪狂犬病病毒分子生物学的研究进展

介绍了伪狂犬病病毒基因组的特点及编码蛋白,论述了伪狂犬病病毒分子生物学诊断方法,包括核酸探针诊断方法、PCR诊断方法、LAMP诊断方法、鉴别诊断方法,并就其基因工程疫苗方面的研究进行了着重阐述。     

猪伪狂犬病病毒gC基因的克隆及其部分生物学特性的分析

采用PCR方法扩增出12株伪狂犬病病毒(PRV)的gC基因全序列,并测序,使用生物学软件对这12株PRV gC基因序列和GenBank上登录的6条gC基因序列进行了生物信息学分析和预测.结果显示,PRV gC基因开放阅读框的核苷酸长度为1437～1464 bp,编码478～487个氨基酸.在遗传进化关系上,四川省流行的PRV毒株与日本、欧洲、美洲分离株的亲缘关系较近,而与我国其他地区的分离株亲缘关系较远.这些毒株的蛋白疏水性、抗原表位和高级结构等具有相似性,但也存在一些变化和差异.表明,PRV gC基因具有较高的保守性,但可能存在抗原漂移现象.     

伪狂犬病病毒感染对ST细胞生长及ATP酶活性的影响

以伪狂犬病病毒(PRV)容A株体外感染ST细胞为模型,观察PRV对ST细胞生长状态以及胞内Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶和总ATP酶活性的影响。根据ST细胞对PRV的敏感剂量,接种ST细胞后第2、12、24、36和48小时观察细胞的生长状态,MTT法检测细胞的增殖能力,用试剂盒检测细胞的ATP酶(Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶和总ATP酶)活性。结果,与对照组相比,在感染后第24小时之前试验组ST细胞的生长状态较好;24h后,细胞活性降低,逐渐发生细胞凋亡。Na+-K+-ATP酶活性、Ca2+-Mg2+-ATP酶活性和总ATP酶活性在PRV感染过程中变化趋势相似,PRV感染后第24小时之前,Na+-K+-ATP酶活性、Ca2+-Mg2+-ATP酶活性和总ATP酶活性略高于对照组;第36小时,细胞ATP酶总体活性水平明显低于对照组(P<0.05);第48小时两组之间ATP酶活性差异极显著(P<0.01),其中Ca2+-Mg2+-ATP酶活性较为敏感。     

伪狂犬病病毒Min-A株gE基因的克隆及序列分析

参考GenBank中伪狂犬病病毒 (PRV) gE基因的序列设计了 1对引物 ,对PRVMin A株进行了PCR扩增 ,扩增产物克隆于 pGEM TEasy载体。对重组质粒进行限制性内切酶分析和基因测序 ,证实了克隆片段的可靠性。测序结果表明 ,目的片段包含 1个 174 0bp的开放性阅读框(ORF) ,编码由 5 79个氨基酸组成的多肽。同源性分析表明 ,PRVMin A株与PRVEa株、SH株gE基因的核苷酸同源性分别为 99.2 %、98.7% ;推导氨基酸的同源性分别为 98.6 %、97.2 %。     

伪狂犬病病毒Bartha K61株Us区缺失片段的鉴定

为利用PCR技术对伪狂犬病病毒(PRV)Bartha K61株Us区的具体缺失情况进行分析,根据已发表的PRV全基因组序列设计了4对引物,以PRV双城株基因组作为对照,对Us区进行扩增.对扩增片段的序列分析表明,Bartha K61株基因组的Us区缺失了3 489 bp,为第122560～126049位核苷酸,其间包括部分gI基因、全部的gE和Us9基因以及部分Us2基因.     

伪狂犬病病毒上海株gE基因克隆及其含GFP基因质粒载体的构建

根据已发表的伪狂犬病病毒(PRV)gE基因序列设计1对引物,用PCR法扩增了PRV上海株(PRV-SH)的gE基因,并克隆入pUC18中.利用gE基因中限制性酶切位点,把绿色荧光蛋白(GFP)的基因表达盒插入gE基因中,构建了含GFP的载体pUCgE-GFP.     

伪狂犬病病毒gE/gB PCR鉴别方法的建立及其应用

为了检测伪狂犬病病毒(PRV)潜伏感染及确定病毒潜伏的主要部位,建立了能鉴别PRV野毒株和gE基因缺失疫苗株gE/gB的PCR诊断方法。结果表明,所建立的PCR 特异性强、敏感性高、稳定性好,能用于病毒潜伏感染的检测;同时还确定PRV潜伏感染的主要部位是三叉神经节、扁桃体、嗅球、脑干、脑桥和咽黏膜。     

伪狂犬病病毒Ea株糖蛋白基因gL的克隆和序列分析

根据已发表的基因序列设计了 1对PCR引物 ,以伪狂犬病病毒Ea株 (pseudorabiesvirusEa ,PRVEa)基因组DNA为模板 ,扩增出一大小为 5 11bp的片段。通过酶切和测序证实 ,该基因为伪狂犬病病毒Ea株的又一糖蛋白基因 ,即gL基因。Blast软件分析表明 ,该基因与Kaplan株核苷酸序列的同源性为 94% ,氨基酸序列的同源性为 95 %。将测序结果输入GenBank ,获得登录号AF44 845 6。     

猪伪狂犬病病毒GZ-Z1株的分离鉴定

为获得1株猪伪狂犬病病毒贵州分离株,将贵阳市某猪场送检的流产胎儿病料经一系列处理后接种Vero细胞,并对分离毒株分别进行了病毒理化特性、电镜形态观察、中和试验、动物接种试验、核酸检测等鉴定。当盲传至第3代时,出现细胞变圆变亮、脱落、呈拉网状特征的细胞病变;分离毒不耐酸和热,对5-碘脱氧尿核苷和有机溶剂氯仿敏感,能被伪狂犬病病毒标准阳性血清中和;透射电镜下可见位于囊泡中呈近圆形、有囊膜、150～180 nm大小的成熟病毒粒子,在胞核中可见衣壳呈晶格状排列的病毒包涵体以及空心、实心2种无囊膜的病毒粒子;将分离毒株接种家兔,能引起家兔奇痒、麻痹死亡;PCR扩增产物经测序证明系PRV gD基因的部分序列。结果表明,成功分离获得了1株猪伪狂犬病病毒贵州株。     

用重组腺病毒免疫方法制备伪狂犬病病毒gC蛋白单克隆抗体

将表达伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)gC基因的重组腺病毒经肌肉免疫BALB/c小鼠,测试了重组腺病毒免疫小鼠制备抗目的蛋白单克隆抗体的效果。ELISA分析表明,BALB/c小鼠接种重组腺病毒后能产生针对gC蛋白的特异性抗体。给BALB/c小鼠用大肠杆菌表达的gC融合蛋白MBP-gC-NC加强免疫后第3 d,取小鼠脾细胞与SP2/0小鼠骨髓瘤细胞在PEG4000作用下进行杂交融合,经筛选、克隆,获得了3株稳定分泌抗PRV gC蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为1B4、1H4和2C8。单抗特性分析结果表明,1B4、2C8属IgG2a亚类,1H4属IgG1亚类;腹水抗体的ELISA效价为1∶2×105~1∶2×106;3株单抗都具有间接免疫荧光试验(IFA)和免疫印迹试验(Western-blotting)反应特性,能够特异地识别PRV gC蛋白。证实重组腺病毒免疫可用于制备目的蛋白单克隆抗体,为制备单抗提供了一种新的方法。     

猪伪狂犬病油乳剂灭活疫苗免疫效力和保存期试验

用华中农业大学畜牧兽医学院病毒研究室研制的猪伪狂犬病(PR)油乳剂灭活疫苗中试产品(9701、9702、9703、9704批)免疫1月龄断奶仔猪,免疫后42 d中和抗体指数到达高峰,180 d后中和抗体效价仍为阳性;于第1次免疫后56 d加强免疫,出现较高的中和抗体并持续至270 d.疫苗置20～25℃3个月、4～8℃18个月,物理性状保持不变,效力试验仍能获得较高抗体水平,对伪狂犬病病毒(PRV)鄂A株强毒的保护率为100%.     

猪伪狂犬病病毒变异株感染绵羊胚胎鼻甲上皮细胞的病毒形态发生和细胞超微结构观察

应用超薄切片和透射电子显微镜技术,研究猪伪狂犬病病毒(PRV)MQ18变异株感染绵羊胚胎鼻甲上皮细胞(OFTu)的病毒形态发生和超微结构变化。结果显示:病毒在细胞核内复制、增殖,形成核内包涵体,装配好的病毒通过核内膜获得初始囊膜,以出芽方式出核进入细胞质,在高尔基体区域进行加工修饰、二次获得囊膜后形成完整病毒粒子,以包裹有病毒粒子的空泡与细胞膜相互融合方式,将病毒释放到细胞外;细胞超微结构主要表现为细胞质内空泡增多,线粒体增生、肿大,空泡样变,粗面内质网扩张,高尔基体形态异常,细胞核染色质浓缩、边集,最后细胞破坏、裂解,可见细胞早期凋亡及自噬小体结构。本研究结果为阐明PRV的感染和致病机制提供了理论依据。     

口蹄疫A型灭活疫苗毒种和种子批的研究

为了保证制苗及攻毒用毒种的质量和稳定性,在对制苗和攻毒毒种的毒力、特异性、保存期、扩繁代次等进行研究的基础上,建立了口蹄疫A型灭活疫苗制苗和攻毒用毒种种子批。结果表明,原始毒种和基础毒种的扩繁代次均控制在5代以内,适宜的保存方法和保存期均为加含 500 mL／L甘油的PBS后在-30℃保存1年、-70℃保存2年;用于生产抗原的工作毒种,最高扩繁代次控制在15代以内,最佳保存方法和保存期为加保护剂后在-20℃保存半年、-70℃保存1 年;用于效力检验的攻毒毒种采用原始毒种。通过制苗和攻毒用毒种种子批的建立,规范了口蹄疫疫苗生产和检验过程中的毒种管理。     

鼻腔免疫禽流感灭活疫苗对鸡呼吸道肥大细胞分布的影响

用添加CpG的禽流感病毒(H5亚型)灭活疫苗对7日龄罗曼公鸡进行鼻腔免疫,14日龄加强免疫一次;分别于首免后第3、5、7周剖杀,取鼻腔、喉部、气管、气管叉及肺组织,通过甲苯胺蓝染色法显示肥大细胞,观察呼吸道各部位肥大细胞的分布及数量变化。结果显示,首免后第3周气管和气管叉黏膜中的肥大细胞数量显著增加(P<0.05),第5周时喉部和气管叉黏膜中的肥大细胞数量显著增加(P<0.05),气管黏膜中肥大细胞数量也极显著增加(P<0.01),第7周肺中的肥大细胞数量显著增加(P<0.05);肥大细胞的数量在喉部最多,气管叉次之,气管和肺较少。试验结果表明,局部黏膜免疫可增加呼吸道肥大细胞的数量,肥大细胞可能参与黏膜免疫反应。     

镉对小鼠生精细胞凋亡及bax和bcl-2基因表达的影响

将150只小鼠随机分成4个处理组和1个对照组,每组30只。给4个处理组小鼠分别一次性注射氯化镉1、2、4、6 mg/kg(按体重给药),对照组小鼠注射等体积的生理盐水。于注射后第3、6和9 d用原位末端标记法(TUNEL)测定睾丸内生精细胞的凋亡率,并用免疫组织化学方法检测bax和bcl-2基因的表达水平。结果显示,各染毒组小鼠的生精细胞凋亡率明显升高,与对照组相比差异显著(P<0.05),并具有剂量-反应关系和时间-反应关系。bax基因的表达水平明显上升,而bcl-2基因的表达水平明显下降。表明,镉可以诱导小鼠生精细胞凋亡,其机制可能与bax基因上调和bcl-2基因下调有关。     

犊牛血清对高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒增殖及其活疫苗的影响

为了研究在同一培养条件下,不同含量犊牛血清(FCS)对高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)JXA1-R株病毒含量的影响,以及用其生产的疫苗质量、免疫效果的变化情况,采用4个不同含量的FCS对HP-PRRSV JXA1-R株进行了繁殖,并测定病毒毒价及疫苗样品的效价,监测免疫猪的体温变化,用ELISA方法检测免疫猪PRRSV特异性抗体水平。结果显示,用15～30mL/L犊牛血清培养的病毒的含量没有较大变化,但是随血清含量的增加而略有增高。样品疫苗的病毒含量没有明显变化,但是在免疫后测温过程中发现,血清含量高的样品疫苗在接种后第2～4天体温有短暂的高温波动,随后正常。采血检测抗体发现,血清含量高的样品疫苗产生的抗体也早3～5d。本试验结果可以为HP-PRRSV的培养及疫苗工艺的改进提供有效的参考数据。     

甘肃省庆阳地区肝片吸虫中间宿主的感染及种类调查

用从甘南绵羊和合水山羊胆囊中收集的肝片吸虫虫卵孵化出毛蚴,实验感染采自合水的各种淡水螺,并用从阳性螺收集的囊蚴感染家兔,确证小土蜗(Galba pervia)和梯状土蜗(G.laticallosiformis)为该地区肝片吸虫的中间宿主。