GFP标记的重组新城疫病毒HN基因乳酸菌表达载体的构建及原核表达

为构建具有示踪特性的新城疫病毒(NDV)HN基因乳酸菌穿梭表达载体,采用PCR方法扩增NDV HN基因与绿色荧光蛋白(GFP)基因,将两基因克隆至乳酸菌表达载体pW425et中,转化入表达宿主菌BL21(DE3)后利用IPTG诱导表达。用荧光显微镜检查重组菌的绿色荧光效应,采用SDS-PAGE和Western-blotting检测其在大肠杆菌中的表达情况。结果显示,NDV HN和GFP基因与表达载体pW425et正确重组。荧光显微镜下可见阳性重组菌落的绿色荧光,且该重组菌传代30代次以上,荧光效应依然稳定。SDS-PAGE显示表达出约63ku的条带,与已知表达的HN蛋白大小相符。Western-blotting进一步证实该蛋白能被NDV阳性血清所识别,具有反应原性。构建了GFP标记的重组NDV HN基因乳酸菌穿梭表达载体且能在大肠杆菌中表达。     

新城疫病毒F48E9株M NP F和HN基因的真核表达

将新城疫病毒(NDV)F48E9株的M、NP、F和HN基因克隆到真核细胞表达载体 pCAGG上,经酶切、PCR鉴定和序列分析,分别筛选出了含有M、NP、F和HN基因的重组质粒, 命名为pCAGG-M、pCAGG-NP、pCAGG-F和pCAGG-HN。纯化后的重组质粒通过脂质体单独转染HeLa细胞,经间接免疫荧光试验检测到了M、NP、F和HN蛋白的表达。pCAGG-M、 pCAGG-NP、pCAGG-F和pCAGG-HN重组质粒组合共转染HeLa细胞48 h后,可以观察到明显的细胞融合现象。试验结果表明,NDV F48E9株的M、NP、F和HN蛋白均在HeLa细胞内得到了成功表达,同时证明在该表达系统中F蛋白不足以诱导细胞融合。     

新城疫病毒F48E9株V基因的表达及其抗血清的制备

采用PCR方法从鸡源新城疫病毒(NDV)强毒F48E9株P基因重组质粒中扩增出了V 基因全长cDNA,并引进相应的突变位点,将其克隆到pMD18-T载体,然后亚克隆到原核表达载体 pET-30c上,重组质粒经酶切、PCR鉴定及测序,筛选出阳性重组质粒,并命名为pET-30c-V。将 pET-30c-V转化大肠埃希氏菌BL21(DE3),用1 mmol／L IPTG 37℃过夜诱导表达,SDS-PAGE 及Western-blotting分析结果表明,所表达的NDV V重组蛋白主要以包涵体形式存在,分子质量约28 ku,与理论值大小相符。将包涵体用8 mol／L脲变性,经Ni-NTA柱纯化,透析复性,得到纯化的V蛋白。用复性后的V蛋白免疫21日龄SPF鸡(300 μg／只),成功制备了抗鸡NDV V蛋白的抗血清。     

鹅Ⅰ型禽副粘病毒融合蛋白基因3′端cDNA片段的分子克隆

参考禽副粘病毒的融合蛋白基因 (F基固 )cDNA序列 ,设计并合成了 1对引物 ,以分离到对鹅有致病力的Ⅰ型禽副粘病毒GPMV/QY97 1株的核酸 (RNA)为模板 ,用逆转录聚合酶链反应 (RT PCR)对其融合蛋白基因 3′端进行扩增 ,获得了预计的 884bp左右的片段。将该片段克隆进 pGEM TEasy质粒载体 ,获得重组质粒T GPMVF3′ ,采用限制性内切酶和PCR方法对该重组质粒进行鉴定 ,证明所克隆的片段即为目的基因片段 ,这为进一步开展鹅Ⅰ型禽副粘病毒的分子生物学研究奠定了基础     

重组鹅源新城疫病毒HN基因乳酸菌的构建

构建了重组鹅源新城疫病毒(NDV)HN基因乳酸杆菌后,将HN基因亚克隆至可在乳酸杆菌和大肠杆菌中穿梭表达的载体pSIP409中。此后,将构建的阳性重组体pSIP409-HN采用电转化方法转化至植物乳酸杆菌感受态细胞中。利用SDS-PAGE和Western-blot检测HN蛋白的表达情况。为明确HN蛋白的表达位置,利用流式细胞术检测了重组菌细胞是否有HN蛋白的表达。结果显示,克隆了NDV HN基因,构建了阳性重组质粒pSIP409-HN;鉴定结果表明,阳性重组质粒pSIP409-HN被成功电转化至乳酸杆菌感受态细胞中。SDS-PAGE和Western-blot分析结果表明,构建的重组菌可以表达与HN蛋白已知大小相符的条带(66ku),且该蛋白能与NDV阳性抗体反应,具有反应原性。流式细胞术检测结果表明,HN蛋白被表达于菌体细胞表面,可作为黏膜疫苗的候选抗原。     

新城疫病毒广东分离株HN基因的克隆与序列分析

用RT PCR方法从6个新城疫病毒(NDV)广东分离株中扩增HN基因cDNA片段,并将其克隆至pGEM T Easy载体进行核苷酸序列测定。结果表明,6个NDV分离株 HN基因片段长度均为1 704 bp,编码568个氨基酸;彼此间核苷酸和氨基酸同源性分别为 96.0%~99.8%和98.6%~100%,与其他基因Ⅶ型毒株的氨基酸序列同源性为 96.8%~98.4%;但与其他基因型毒株如D26、Ulster/67、B1、LaSota以及GB Texas的氨基酸同源性较低,为88.2%~91.0%。     

环形泰勒虫裂殖体表面蛋白基因高免疫原性区片段的克隆及其表达

根据环形泰勒虫TaA12 72 1株裂殖体表面抗原 (TaSP)基因的序列设计了 1对引物 ,用PCR扩增出该基因长为 393bp的高免疫原性区片段 (SBxp)。将扩增产物连接到 pGEM TEasy载体上 ,转化入大肠埃希氏菌JM 10 9中进行克隆。随后将重组质粒 pGEM SBxp和表达载体 pGEX 4T 1分别以BamHⅠ、XhoⅠ酶切后 ,将酶切的目的片段SBxp亚克隆到原核表达载体中构建了重组表达载体 pGEX 4T 1 SBxp ,并将其转化到BL2 1宿主菌中。提取重组质粒经BamHⅠ、XhoⅠ酶切、PCR鉴定和测序确证后 ,阳性克隆用IPTG诱导表达。收集不同时间的菌液进行SDS PAGE电泳和Westernblotting检测。结果 ,SBxp基因在大肠埃希氏菌中成功表达 ,其表达产物为分子质量 4 3ku的融合蛋白 ,该产物能被牛环形泰勒虫阳性血清所识别。     

口蹄疫病毒3C基因与增强型绿色荧光蛋白基因的真核共表达

为验证siRNAs对口蹄疫病毒(FMDV)复制的抑制效果,用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增Asia 1型口蹄疫病毒Jiangsu/China/2005株的3C基因,克隆入增强型绿色荧光蛋白(EGFP)表达载体pEGFP-N1中,并进行双酶切、PCR及测序鉴定。将阳性重组质粒转染PK-15细胞,检测EGFP的表达和3C基因转录水平。结果显示,经PCR及双酶切鉴定,目的基因片段大小与预期相符,测序结果与Jiangsu/China/2005株相应序列一致。荧光显微镜和流式细胞仪均检测到细胞内有EGFP表达,实时荧光定量PCR检测到细胞内有3C基因的转录。证实,成功构建了FMDV 3C基因与EGFP共表达质粒并在PK-15细胞中获得了表达。     

鹅Ⅰ型禽副粘病毒融合蛋白基因3''''端cDNA片段的分子克隆

参考禽副粘病毒的融合蛋白基因(F基固)cDNA序列,设计并合成了1对引物,以分离到对鹅有致病力的Ⅰ型禽副粘病毒GPMV/QY97-1株的核酸(RNA)为模板,用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)对其融合蛋白基因3'端进行扩增,获得了预计的884 bp左右的片段.将该片段克隆进pGEM-T Easy质粒载体,获得重组质粒T-GPMVF3',采用限制性内切酶和PCR方法对该重组质粒进行鉴定,证明所克隆的片段即为目的基因片段,这为进一步开展鹅Ⅰ型禽副粘病毒的分子生物学研究奠定了基础.     

新城疫病毒HN基因在毕赤酵母中的表达及其表达产物的免疫原性

应用RT-PCR获得新城疫病毒(NDV)La Sota株的血凝素-神经氨酸酶(HN)基因片段,将HN基因片段定向插入毕赤酵母表达载体pPICZaA,构建了分泌型表达载体pPICZaA-HN,将其用Sac I线性化后电转化入P.pastoris X-33.经高抗性及阳性转化子筛选得到重组菌株X-33/pPICZaA-HN,甲醇诱导后,表达产物的上清液经SDS-PAGE、Western-blot和血凝活性检测,结果约在97 ku处有目的条带.比预期分子质量大,占总蛋白的53%,与NDV阳性血清发生特异性免疫反应,并具有较高的血凝活性.表明,HN基因在毕赤酵母中成功地进行了表达且表达产物具有良好的免疫原性.     

传染性喉气管炎病毒王岗株gB基因gC基因和gD基因的真核表达

将传染性喉气管炎病毒(ILTV)王岗(WG)株的gB、gC、gD基因分别克隆到真核表达载体pCAGGS的EcoRⅠ位点,经过酶切、测序分析,筛选鉴定出含有gB、gC、gD基因的重组质粒,分别命名为pCAGGgB、pCAGGgC、pCAGGgD。用质粒纯化试剂盒对重组质粒进行了纯化,将纯化后的质粒转染293T细胞,用间接免疫荧光技术检测了目的蛋白的表达情况。检测结果表明,目的蛋白得到了真实的表达。     

鹅副黏病毒QY分离株F基因和HN基因的克隆与序列分析

根据已发表的鹅副黏病毒基因组序列,设计并合成了扩增F基因和HN基因的5对引物,利用RT-PCR的特异性扩增出了广东省清远分离株(QY株)的F基因和HN基因。然后将其克隆入pMD 18-T载体,经鉴定、测序及拼接,QY株的F基因和HN基因全序列长度分别为1 662bp和1 716 bp,分别编码553个和571个氨基酸。经与GenBank登录的几株参考毒株F基因和HN基因编码区的核苷酸序列进行比较;结果,QY株与参考毒株SF02株和LaSota株F基因的核苷酸序列同源性分别为98.3%和82.4%,HN基因的核苷酸序列同源性分别为97.2%和75.9%。     

两株家鸭禽流感病毒H3N1亚型分离株的致病性及其表面糖蛋白基因序列分析

测定了2株禽流感病毒(AIV)Dk/YZ/231/02和Dk/YZ/3/04对SPF鸡和BALB/c小鼠的致病性；对其血凝素(HA)基因和神经氨酸酶(NA)基因的序列进行了测定,并与GenBank中收录的其他序列进行了比较。结果,此2株AIV对SPF鸡具有较低的致病性,而对BALB/c小鼠无致病性；Dk/YZ/231/02株的HA基因与Dk/Ukraine/1/63(H3N8)株的同源率最高,Dk/YZ/3/ 04株的HA基因与Petbird/HK/1559/99(H3N8)株的同源率最高；而Dk/YZ/231/02株的NA基因与Dk/Fujian/17/2001(H5N1)株的同源率最高,Dk/YZ/3/04株的NA基因与Gs/Guangdong/ 1/96(H5N1)株的同源率最高。进化分析结果表明,Dk/YZ/231/02和Dk/YZ/3/04株的NA基因均可能起源于水禽源H5N1亚型AIV,这可能是不同亚型AIV在水禽体内基因重组的结果。推导的氨基酸剪切位点序列均为PEKQTR,属于非高致病性AIV的特征序列。     

鸡传染性支气管炎病毒HN株5a 5b及N基因的遗传变异分析

从河南省某鸡场中疑似鸡传染性支气管炎(IB)的雏鸡病料中分离到1 株鸡传染性支气管炎病毒(IBV),暂命名为HN,鉴定为IBV。从接种HN毒株的鸡胚尿囊液中提取单股RNA后应用反转录聚合酶链反应(RT PCR)技术扩增得到包含IBV HN株5a、5b蛋白及N蛋白基因的约1 600 bp片段;将克隆测序的5a、5b及N基因分别与GenBank中11 株国内外参考毒株相应基因进行序列比较与遗传变异分析,发现IBV HN株变异独特,明显不同于国内外参考毒株。     

乳牛前脂肪细胞原代培养过程中ADPN基因和HSL基因表达水平的检测

选取犊牛大网膜脂肪组织,进行牛前脂肪细胞的单层贴壁培养,在细胞接种后第4、6、8、10、12、141、6 d分别提取细胞总RNA,采用实时荧光定量RT-PCR方法,检测了体外培养的犊牛前脂肪细胞不同时期ADPN基因mRNA和HSL基因mRNA的表达情况。结果表明,单层培养的脂肪细胞在第4、6、8、10、12、141、6 d,ADPN基因mRNA的表达水平呈先下降后升高的趋势,而HSL基因mRNA的表达水平则呈下降趋势。     

猪PD-1分子及其配体的实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

根据猪程序性死亡因子PD-I及其配体PD-LI和PD-L2的基因序列,分别设计了特异性引物和TaqMan探针,以10倍系列稀释的重组质粒pMD-PD-1、pMD-PD-L1和pMD-PD-L2为标准品,对实时荧光定量PCR的条件进行优化,以建立定量检测这3个基因的方法.结果表明,建立的方法在1×10~2～1×10~8copies/μL模板范围内具有良好的线性关系(r~2>0.99),扩增效率均高于96%,可检测至少100 copies的阳性标准品.利用该方法对猪外周血单核细胞中这3个基因的表达情况进行了检测,结果也表明该方法具有良好的敏感性、特异性和重复性,可应用于临床样品的检测.     

犬新孢子虫不同靶基因PCR检测方法的比较

为筛选出检测犬新孢子虫更为特异、敏感的PCR方法,分别以MAG1、SAG1和Nc5为靶基因进行PCR检测,并从敏感性、特异性和临床样本检出率等方面进行了比较。结果显示,以Nc5为靶基因的PCR方法敏感性最高,最小检测DNA量为17.8fg/μL;以MAG1为靶基因的PCR方法敏感性最低,最小检测DNA量为17.8pg/μL;而以SAG1为靶基因的PCR方法的最低检测量为178fg/μL;3种靶基因引物均扩增不出刚地弓形虫、牛瑟氏泰勒虫、猪附红细胞体等基因片段,具有较好的特异性;对28份已攻犬新孢子虫标准株的BALB/c小鼠组织样本的检测结果表明,以Nc5基因设计的引物检出率最高,为75.0%(21/28),明显高于SAG1基因的67.9%(19/28)和MAG1基因的53.6%(15/28)。本试验为新孢子虫病的诊断及流行病学调查提供了更为敏感、特异的检测技术。     

2017—2019年猪流行性腹泻病毒广西流行毒株遗传多样性分析

为掌握广西猪流行性腹泻病毒(PEDV)流行毒株的遗传变异情况,本研究对2017-2019年从广西各地采集的腹泻样品,应用RT-PCR方法进行检测,并随机选取部分PEDV阳性样品进行S、M、N基因的扩增、测序和分析。结果显示,共获得PEDV S基因序列23株、M基因和N基因序列各25株。同源性分析显示,广西流行毒株间核苷酸和氨基酸序列同源性在S基因为90.6%~100%和89.6%~100%,在M基因为97.0%~100%和96.9%~100%,在N基因为95.9%~100%和95.9%~100%。序列比对显示,广西流行毒株S1基因的氨基酸序列存在缺失、突变和插入现象,且各毒株之间存在差异。基于S、M、N基因绘制遗传进化树,获得相似的拓扑结构图,广西流行毒株主要分布在S基因的GⅠb、GⅡa亚群,M基因的GⅡa、GⅡb亚群,N基因的GⅢ亚群。遗传进化速率测算显示,广西流行毒株及国内外参考毒株S、M、N基因的平均进化速率分别为7.39×10-4、1.43×10-4和2.96×10-4substitutions/site/year,S基因的变异速度最快。表明PEDV广西流行毒株存在遗传多样性,应加强病原监测和流行病学调查,为有效防控PED提供基础数据。     

肾型传染性支气管炎病毒的鉴定和结构蛋白的表达

对分离自江苏省某发病蛋鸡群中1株病毒(Ck/Jiangsu/DS10/2008,DS10)进行了生物学特性鉴定。同时利用RT-PCR扩增该病毒的S基因、M基因和E基因并进行测序,与GenBank中其他参考株构建进化树,进行比对分析,研究其遗传进化关系。另将S基因、M基因和E基因克隆至杆状病毒表达系统pFastBac 1载体并转染Sf9细胞进行表达,用间接免疫荧光鉴定其表达,用琼扩试验验证表达产物的反应性。经生物学特性鉴定,DS10病毒为嗜肾型传染性支气管炎病毒(IBV)。遗传进化分析表明,各基因之间的遗传进化关系无明显相关性。间接免疫荧光检测表明,S蛋白、M蛋白和E蛋白在Sf9细胞中得到表达。琼扩试验证实,S基因和M基因的表达产物具有良好的反应性,而E蛋白未发现与阳性血清反应所产生的特异沉淀线,表明所表达的S蛋白和M蛋白具有良好的生物学活性,E蛋白可能因其自身分子质量小,在病毒中的含量较少相关。研究结果提示,现有传染性支气管炎疫苗对流行株保护效果不佳,表达的S蛋白、M