10个STR基因座荧光复合扩增体系的研制

目的建立10个STR基因座荧光标记复合扩增体系,并评价其法医学应用价值。方法在北京、山西、广东汉族,辽宁满族、西藏藏族群体中调查STR基因座遗传多态性,筛选出9个具有高度多态性和法医应用价值的STR基因座及性别基因座。构建四色荧光素标记复合扩增体系,制备等位基因分型标准物,编制分析软件,并对体系的种属特异性、灵敏度、稳定性、混合样本等检测能力进行考察。结果建立的复合扩增体系遗传稳定好,累积非父排除率可达0.999 96,累积个体识别率可达0.999 999 999 999 3;与CODIS系统均不存在连锁遗传;各基因座间布局合理、无杂峰、扩增结果清晰易辨,并可实现检测分析自动化。体系种属特异性较好,灵敏度为0.1ng,稳定性好,混合样本检出范围在2∶8～8∶2之间。实际案例检材检测结果好。结论本文建立的复合扩增体系在法医学实践中有较好的应用价值。     

FTA卡直接扩增缓冲增强剂的研制

目的研制一种能够配合非直接扩增试剂应用的PCR缓冲增强剂,实现对FTA卡保存样本的直接扩增。方法基于常规STR复合扩增试剂盒的扩增体系及引物组,加入增强剂对FTA卡类样本进行直接扩增。结果获得样本STR分型结果清晰、完整、平衡性好,无明显抑制现象存在。结论所研制的FTA卡直扩增强剂能达到FTA卡保存样本的直接扩增检验要求,可应用于法医STR检验。     

9色荧光STR复合扩增体系的构建及验证

构建一套包含39个常染色体基因座及Amelogenin性别基因的9色荧光STR复合扩增体系,并验证其在微量与降解检材中的应用效果。根据中国人群核心基因座推荐标准及实际办案需要,筛选出合适的候选基因座,设计引物并以9种荧光染料对其进行标记,构建复合扩增体系并优化;对该体系进行灵敏度、种属特异性、稳定性等确证实验,并通过检验案件样本做进一步评估。结果表明：一套包含39个常染色体STR基因座及Amelogenin性别基因座（其中28个基因座<300 bp）的9色荧光复合扩增体系构建成功。各基因座均衡性良好,灵敏度达0.125 ng,对常见PCR抑制剂具备一定的耐受能力。两性混合样本最低检测比例为1∶4;适用于不同类型案件样本检测,且与市场上其他同类试剂盒比对分型结果一致,种属特异性较好。所构建体系首次采用9色荧光标记技术制成复合扩增试剂,一次性检出基因座数量多,系统效能高;该体系构成以miniSTR为主,对于微量降解检材具有较高的实际应用价值。     

八色荧光复合扩增体系构建初探

目的建立八色荧光38个基因座的复合扩增体系。方法采用八色荧光标记技术,对38个基因座Amelogenin、D5S818、D21S11、D7S820、CSF1PO、D2S1338、D3S1358、vWA、 D8S1179、D16S539、D1S1677、PentaD、TPOX、TH01、D22S1045、D18S51、FGA、D6S1043、D13S317、D12S391、PentaE、D2S441、D1S1656、D19S433、D10S1248、D11S4463、D1S1627、D3S4529、D1GATA113、D17S974、D6S1017、D4S2408、D9S2157、D6S474、D2S1776、D18S853、D20S482及D14S1434进行复合扩增,应用GA118-24B遗传分析仪进行电泳检测,应用Gene Typer V1.0软件进行数据分析。结果本文成功建立了38个基因座的八色荧光复合扩增体系,基因座间均衡性良好,阳性对照分型结果准确。结论包含38个基因座的八色荧光复合扩增体系构建成功,为后续更多八色试剂盒的开发奠定了基础。在提高我国DNA检验试剂水平、遗传分析...     

6个五核苷酸STR基因座荧光复合扩增体系的建立

目的 构建6个五核苷酸STR基因座荧光复合扩增体系。方法筛选6个多态性程度较高的五核苷酸STR基因座D10S2325、Penta B、Penta W、PentaX、Penta D和PentaE,按照复合扩增引物设计要求,重新设计引物并标记荧光染料,经反复调整和优化,构建6基因座荧光复合扩增体系,并用该复合扩增体系对239名武汉汉族无关个体进行分型。结果6个五核苷酸STR基因座荧光复合扩增体系分型稳定,可重复性好,与各自相应单基因座分型结果完全一致;累积个人识别率达0．999999988,累积非父排除率达0．998063807。结论本文构建的6个五核苷酸STR基因座荧光复合扩增体系具有很高的法医学实用价值,可作为商品化试剂盒的有效补充。     

荧光标记8个 miniSTR 及 Amelogenin 复合扩增体系的建立

目的建立非CODIS系统miniSTR以及Amelogenin基因座的荧光复合扩增体系。方法筛选8个多态性高的非CODIS系统miniSTR基因座（D20S1082、D6s474、D12ATA63、D9S1122、D2S1776、D1S1627、D3$4529、D2S441）,并结合Amelogenin基因座设计荧光标记引物,优化反应条件,建立复合扩增体系。应用该体系对204份广州地区汉族血样,30个家系样本,及30份降解检材进行检测。结果建立的荧光标记8个miniSTR及Amelogenin复合扩增体系分型结果明确,稳定性好,且所有片段长度均少于200bp,提高了降解检材的分型成功率。在广州汉族人群的累积个人识别率为0．99999993,累积非父排除率为0．992287。结论构建的miniSTR荧光复合扩增体系,操作简便,分型准确,重复性好,对降解检材有效,易于在法医实验室推广应用,可对现有试剂盒起补充作用。     

荧光标记复合扩增检测4个STR基因座多态性

目的建立荧光标记复合扩增D1S2142,D13S1492,D14S306,D15S659基因座检测分型方法,并对成都汉族群体4个基因座的遗传多态性进行调查。方法用6-FAM标记D1S2142和D15S659引物,HEX、TMR分别标记D14S306和D13S1492引物,PCR复合扩增,310基因分析仪电泳自动收集电泳结果数据,GeneScan Analysis Software3.7NT软件计算扩增产物片段相对大小,Genotyper(3.7NT软件进行样本基因型分型,建立了荧光标记复合扩增检测4个STR基因座基因型的方法,对145名成都汉族无关个体样本进行分型。结果荧光标记复合扩增D1S2142,D13S1492,D14S306,D15S659基因座,每个STR基因座都获得了清晰的基因型分型结果。145份样本,4个STR基因座分别检出10,14,7,12个等位基因和22,54,21,39种基因型,其基因型分布均符合Hardy-W e inberg平衡。4个基因座在成都汉族群体的杂合度分别依次为0.7793,0.8345,0.7793和0.8345;多态信息含量分别依次为:0.7656,0.8730,0.7470和0.8312。累计非父排除率为0.9783,累计个人识别机率为0.9999 917。结论荧光标记复合扩增D1S2142,D13S1492,D14S306,D15S659基因座,可实现对每个基因座准确分型;成都汉族群体该4个基因座的遗传学数据,可为群体遗传学和法医学研究与应用提供基础资料。     

23个STR基因座荧光复合扩增体系的法医学应用评估

目的评估新建立的23个STR复合扩增体系EX23的法医学应用价值。方法使用磁珠法提取样本DNA,应用23个STR复合扩增体系进行扩增,ABI3130XL遗传分析仪对扩增产物进行电泳,GeneMapperID 3.2软件进行基因分型,对法医学应用参数、灵敏度、种属、脱落细胞检材及降级检材分型效果进行观察,并与Sinofiler试剂盒比较。结果 DNA模板量在0.05~1.00ng时,各基因座分型结果清晰准确,均衡性好、特异性强。应用该复合扩增体系检验混合样本、降解检材及脱落细胞检材,均能获得正确的分型结果。统计结果显示该23个STR基因座累计个人识别（TDP）率达0.999999999,三联体累计非父排除率（CPE）达0.999999997。结论新建立的23个STR复合扩增体系分型效果良好,在广东地区汉族人群中具有高度多态性,可满足日常法医鉴定的需要。     

19个常染色体与4个Y染色体STR复合扩增体系的建立

目的建立19个常染色体STR及Amelogenin和4个Y染色体STR基因座复合扩增体系,并对其效能进行评估。方法用五色荧光标记20+4Y-STR基因座,建立同步扩增检测体系,用ABI 3130XL遗传分析仪对扩增产物进行电泳,GeneMapperID 3.2软件进行基因分型;检测体系的灵敏度、均衡性、稳定性、特异性、同一性和稳定性,并观察混合、降解及微量检材的分型情况。结果采用本文体系,DNA模板量在0.05~1.00ng时,分型准确,均衡性、特异性好;混合、降解及微量检材分型正确。该19个常染色体STR基因座的累计个人识别率大于0.999 999 999,三联体累计非父排除率达0.999 999 985,Y-STR单倍型多态性为0.592。结论本文建立的复合扩增体系分型准确,稳定,在法医学案件检验及数据库建设等方面有良好的应用前景。     

2组miniSTR复合扩增体系的建立

本文在参考文献的基础上，建立了两组荧光标记复合扩增体系，分别用于13个miniSTR基因座、1个性别基因座的分型检验，与minifiler试剂盒进行了对比，并对实际案例中微量、高度降解检材进行了检测。     

19个常染色体与4个Y染色体STR复合扩增体系的建立

目的建立19个常染色体STR及Amelogenin和4个Y染色体STR基因座复合扩增体系,并对其效能进行评估。方法用五色荧光标记20＋4Y—STR基因座,建立同步扩增检测体系,用ABI3130XL遗传分析仪对扩增产物进行电泳,GeneMapperID3．2软件进行基因分型;检测体系的灵敏度、均衡性、稳定性、特异性、同一性和稳定性,并观察混合、降解及微量检材的分型情况。结果采用本文体系,DNA模板量在0．05～1．00ng时,分型准确,均衡性、特异性好;混合、降解及微量检材分型正确。该19个常染色体STR基因座的累计个人识别率大于0．999999999,三联体累计非父排除率达0．999999985,Y—STR单倍型多态性为0．592。结论本文建立的复合扩增体系分型准确,稳定,在法医学案件检验及数据库建设等方面有良好的应用前景。     

五色荧光标记20个基因座复合扩增体系及法医学应用

目的建立20个基因座五色荧光标记复合扩增检测体系,并评价其法医学应用价值。方法收集368份无关人血样及55份实际案例样本(包括血斑、体液斑、组织及毛发),采用五色荧光素标记技术,对Amelogenin和19个STR基因座(D19S433、D5S818、D21S11、D18S51、D6S1043、D3S1358、D13S317、D7S820、D16S539、CSF1PO、Penta D、vWA、D8S1179、TPOX、Penta E、TH01、D12S391、D2S1338和FGA)进行基因型检测,并考察方法的一致性、灵敏度、种属特异性及检材适用性。结果本文五色荧光标记复合扩增检测体系可对所选20个基因座分型,结果稳定准确,且均衡性良好、无杂峰;群体调查显示累积个人识别率和累积非父排除率分别是0.999 999 999 999 999 999 999和0.999 999 99;灵敏度达125pg,种属特异性高,实际案例检材分型成功率高。结论本文五色荧光标记复合扩增检测体系各项指标可达到当前商品化试剂盒的检测水平,具有重要的法医学应用价值。     

6个Y-STR荧光复合扩增系统的建立及应用

目的建立6个Y-STR荧光复合扩增体系,评价其法医学应用价值。方法设计DYS444,GATA-A7.2,GATA-A10,DYS390,GATA-A7.1,DYS443荧光复合扩增引物,扩增总体积20μL,内含模板DNA0.5～10ng,PCR产物用3130遗传分析仪电泳,GenemapperID v 3.2分析结果,根据等位基因标准命名各等位基因,并评价该系统的特异性、准确性、均衡性、灵敏度及对混合血样的分析能力。结果当dNTP、Mg2+分别为200μmol/L、1.5mmol/L时扩增效果最佳,0.5～10ngDNA模板量均能获得较好的扩增效果,各基因座分型结果清晰,扩增均衡,特异性强,重现性好,基本满足实际应用的性能要求。对湖北汉族群体进行遗传学调查,结果GD值0.580 3～0.722 3,共检出158种单倍型,其多样性为0.995 8。结论本文6个Y-STR扩增系统分型可靠,配合常用Y-STR分型试剂盒,可进一步提高个体识别能力。     

多重置换扩增技术及其法医学应用展望

多重置换扩增技术(multiple displacement amplification,MDA)是一种新型的全基因组扩增技术,具有操作简单、产物质量好、产物量稳定和扩增较均衡的优点,可以扩增低拷贝、混合、降解、含抑制物的DNA检材,为后续分析提供良好的高质量的扩增产物,在法医物证学领域具有很大的应用潜力,本文对该项技术的研究进展及应用前景进行综述。     

DNA数据库建设中批量样本直接扩增检验法的应用

目的研究批量样本直接扩增法在DNA数据库建设中的应用。方法打孔机打取血滤纸600份,剪取芝麻大小的口腔拭子300份,放入96孔扩增板,加入扩增试剂后直接扩增,并对其中200份血滤纸用磁珠法,100份口腔拭子用96孔板Chelex-100法,经DNA提取后扩增检验进行比较。结果血滤纸采用直接扩增法及磁珠法STR检测成功率均为100%;口腔拭子采用直接扩增法的成功率为95%,采用96孔板Chelex-100法的成功率为94%。结论血滤纸和口腔拭子通过直接扩增均能获得很好的DNA分型结果,该方法省时省力,可用于DNA数据库建设。     

ABO基因分型与多重STR联合检测在法医学中的应用

目的建立ABO基因型和Goldeneye16A试剂盒联合检测的方法,并评价其在法医学实践中的应用价值。方法将6种ABO基因型(A/A,A/O,B/B,B/O,A/B,O/O)的序列特异性引物(PCR-SSP)检测方法与Goldeneye16A试剂盒相整合进行同步分型。通过对460份男性个体血痕样本、9947A DNA及90份案件样本进行检测,考察方法的一致性、灵敏度及对法庭科学检材的适用性。结果应用本文方法可同时检出6种ABO基因型和15个常染色体STR基因座及性别决定基因座,检测灵敏度为125pg,其中ABO基因检测灵敏度达63pg。460份男性血痕和90份案件检材证实该联合分型方法用于各类检材结果准确、稳定。结论本文ABO基因分型与多重STR联合检测方法,适用于各类含有核细胞的生物检材,在法庭科学DNA鉴定中有较好的应用前景。     

法医SNP复合检测体系的构建及应用

目的构建48-SNP位点复合检测体系,用于个体识别、性别鉴定、ABO基因分型。方法采集225份无关个体样本(血斑及口腔拭子),18份案例样本(不同组织及体液斑),选择43个常染色体位点、4个ABO基因位点和1个性别鉴定位点,根据单碱基延伸技术通过GenomeLabTMSNPstream基因分型系统进行SNP分型;并检测体系灵敏度、同一个体不同组织同一性及模拟腐败检材。结果 48-SNP体系分型结果与测序结果的一致性为100%,最小DNA检出量为0.25ng,不同组织来源样本检测同一性很好;利用该体系检测225名无关汉族个体,所有位点均符合Hardy-Weinberg平衡,整个系统的随机匹配概率为9.4×10-18,累积非父排除率(CEP)为0.999 788,累积个体识别率大于0.999 999 999 999 999 99。结论本文48-SNP体系能同时进行个体识别、ABO基因分型和性别鉴定,可以作为现有STR检验体系的补充。