弓形虫RH株热应激蛋白40基因的克隆与原核表达

为研究弓形虫热应激蛋白40(TgHSP40)的生物学特性,采用RT-PCR方法从弓形虫RH株中扩增出TgHSP40基因片段,并将其克隆到原核表达载体pET-30a(+)后转化入表达菌BL21(DE3)进行IPTG诱导表达,应用Western-blot对重组蛋白的反应原性进行分析。结果显示,重组菌可表达出分子质量约46ku的重组融合蛋白,在37℃、IPTG浓度为1.0mmol/L、诱导6h的情况下表达效果最好。重组蛋白经纯化后进行的Western-blot分析证实,表达、纯化的弓形虫RH株HSP40蛋白具有良好的反应原性,与弓形虫基因Ⅰ型的RH株、基因Ⅱ型的PRU株以及基因型为ToxoDB9的TgC7株和GJS株的阳性血清均可发生特异性反应,预期可作为弓形虫病ELISA诊断方法的候选抗原。本研究结果为弓形虫病新型诊断方法的建立奠定了基础。     

残缘璃眼蜱subolesin基因的原核表达及表达产物的反应原性分析

为研究残缘璃眼蜱subolesin基因的生物学特性以及寻找新的抗蜱和蜱传病疫苗候选抗原,根据GenBank上登录的小亚璃眼蜱subolesin基因核苷酸序列设计特异性引物,以残缘璃眼蜱、亚洲璃眼蜱、微小牛蜱的饥饿成蜱cDNA为模板,扩增出subolesin基因的完整阅读框(ORF)。将残缘璃眼蜱subolesin基因的PCR产物经EcoRⅠ+NotⅠ双酶切后连接至表达载体pGEX-4T-1,把重组质粒pGEX-4T-1-subolesin导入感受态细胞BL21(DE3)中,在37℃、1mmol/L IPTG条件下诱导表达。利用SDS-PAGE分析subolesin基因的体外表达特征;用Western-blot分析Subolesin蛋白的反应原性。结果显示,残缘璃眼蜱、亚洲璃眼蜱、微小牛蜱subolesin基因的ORF长度分别为492、492、486bp,分别编码163、163、161个氨基酸。subolesin基因序列和推导的氨基酸序列的比对结果显示,残缘璃眼蜱、亚洲璃眼蜱、微小牛蜱与参考的小亚璃眼蜱的核苷酸序列同源性分别为98%、98%、89%,氨基酸序列同源性分别为98%、99%、93%。SDS-PAGE和Western-blot结果显示,重组残缘璃眼蜱Subolesin蛋白的分子质量为45ku,纯化的subolesin重组抗原可与抗残缘璃眼蜱全蜱血清、残缘璃眼蜱唾液腺、卵巢血清有较强的反应原性。     

弓形虫烯醇化酶2基因的原核表达与鉴定

为深入研究弓形虫烯醇化酶的生物学功能,根据已发表的eno2基因序列设计引物,通过RTPCR方法扩增弓形虫RH株的eno2基因。将eno2克隆到载体pET-28a(+)中后,重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导表达并优化表达条件,SDS-PAGE分析表达情况,并通过Western-blot和间接免疫荧光试验(IFA)鉴定其免疫活性。结果显示,eno2基因全长1 353bp,编码444个氨基酸,与GenBank中登录的弓形虫烯醇化酶基因的核苷酸序列及其推导的氨基酸序列的同源性均高达99.8%,与其他物种的烯醇化酶的同源性较低。在pH7.5、28℃和IPTG终浓度0.1mmol/L条件下,重组蛋白ENO2得到高效可溶性表达,分子质量约为55ku。Western-blot结果显示,重组蛋白能被感染弓形虫的犬阳性血清识别,说明ENO2具有较好的反应原性,可以作为血清学诊断抗原。IFA表明,NO2在弓形虫的细胞质和细胞核中均有分布。结果表明,本研究成功获得了可溶性、具有良好免疫活性的弓形虫重组蛋白ENO2,为深入研究其生物学功能奠定了基础。     

牛分枝杆菌融合基因hsp65-esat6的原核表达及产物的纯化

以牛分枝杆菌ValleeⅢ株基因组DNA为模板扩增hsp65和esat6基因,采用重叠延伸剪接技术(SOE)获得了融合基因hsp65-esat6,将hsp65-esat6连接到原核表达载体pET32a(+)上,构建重组质粒pET65-E6,将其转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,以IPTG诱导(终浓度为1 mmol/L),表达产物进行SDS-PAGE分析。以Ni2+亲和层析柱纯化表达的融合蛋白和Western-blot分析该融合蛋白的免疫活性。结果表明:Hsp65-ESAT6融合蛋白以包涵体形式表达。表达的融合蛋白裂解为两部分,即58 ku和30ku,二者相加与预测大小88 ku相符。纯化的融合蛋白能与抗牛分枝杆菌阳性血清发生反应。     

牛分枝杆菌mpb64和Ag85B融合基因在大肠埃希氏菌中的原核表达

以牛分枝杆菌Vallee株基因组DNA为模板,应用PCR扩增获得mpb64和Ag85B两个目的基因片段,采用重叠延伸剪接技术(SOE)剪接mpb64和Ag85B,得到融合基因mpb64-Ag85B;将融合基因片段先克隆于pMD 18-T载体,再亚克隆到表达载体pET32a( )中,得到重组质粒pET64-85。该重组质粒经核苷酸序列测定,显示其中的外源片段与期望的序列一致;其BL21(DE3)转化菌经IPTG诱导表达带有6个组氨酸标签的融合蛋白;用Ni2 螯合层析方法纯化融合蛋白,Western-blotting分析结果显示,该融合蛋白能与抗牛分枝杆菌阳性血清发生反应。     

弓形虫RH株ROP38基因的原核表达及其反应原性研究

为了研究弓形虫ROP38(TgROP38)蛋白的性质和反应原性,以弓形虫RH株基因组DNA为模板,应用聚合酶链反应(PCR)扩增TgROP38基因。测序后,将核苷酸序列翻译成氨基酸序列并利用生物信息学软件进行分析。将测序正确的片段连接至pET-30a(+)表达载体后,进行原核表达,并用Western-blot检测其反应原性。结果表明,成功扩增出大小约为1 600bp的TgROP38基因。将其翻译成氨基酸序列后,经生物信息学软件分析得出TgROP38蛋白是跨膜蛋白,含有多个亲水区域和B细胞表位。SDS-PAGE分析和Western-blot分析表明,TgROP38蛋白的大小约为66ku,且具有较好的反应原性。结果表明,TgROP38蛋白可作为抗弓形虫病疫苗候选分子研制弓形虫病亚单位疫苗及表位疫苗。     

犬瘟热病毒水貂分离株F基因的克隆及原核表达

根据GenBank中登录的犬瘟热病毒F基因序列设计了1对引物,以从水貂犬瘟热病毒中提取的RNA为模板,扩增出一约1 000 bp的F基因片段。将PCR产物按相应的阅读框架克隆到原核表达载体pET-32a中,并将重组质粒转化E.coliBL21(DE3),用1.0 mmol/L IPTG在30℃下诱导表达。结果显示,F基因的表达量约占细菌总蛋白的35%。SDS-PAGE电泳显示,表达产物的分子质量约为55 ku,与预计大小相符;经Western-blotting试验进一步证实,该基因获得了正确表达。     

弓形虫硫氧还蛋白样蛋白基因的克隆与原核表达

为掌握刚地弓形虫硫氧还蛋白样蛋白(thioredoxin-like,TRXL)的生物学特性及其作为诊断候选分子的潜力,针对trxl基因序列设计引物,通过RT-PCR法扩增弓形虫trxl基因,并将其连接至pET-30a(+)原核表达载体。转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达后,分析了rTRXL蛋白的反应原性。结果显示,弓形虫trxl基因全长1 275bp,共编码424个氨基酸,与GenBank中下载的弓形虫ME49株trxl基因的参考序列完全一致。SDS-PAGE分析表明,诱导表达的重组蛋白rTRXL的大小约48ku,与预期的结果相符,主要以包涵体形式存在。Western-blot结果显示,重组蛋白rTRXL能被感染弓形虫的猪阳性血清识别,表明重组蛋白rTRXL具有良好的反应原性。上述研究结果为弓形虫rTRXL蛋白作为新型弓形虫诊断试剂候选抗原的研究奠定了基础。     

几种蜱MLP基因的表达及其表达产物反应原性的分析

通过对饥饿的长角血蜱雌性成蜱cDNA表达文库中筛选到的未知基因进行5′RACE扩增,以期获得长角血蜱MLP基因全长cDNA序列。设计通用引物,采用PCR方法分别从青海血蜱、麻点璃眼蜱、森林革蜱、微小牛蜱及小亚璃眼蜱中对MLP基因完整的开放阅读框进行了扩增,并将其克隆到表达载体pGEX-4T-1中,构建重组质粒,转入BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达,分别用SDS-PAGE和Western-blot分析目的蛋白的表达情况和反应原性。结果表明,成功扩增了长角血蜱的MLP基因全长序列及多个蜱种的MLP基因开放阅读框序列,体外高效诱导表达了约39.2ku的不同蜱的MLP重组蛋白。Western-blot结果表明,长角血蜱的MLP重组蛋白具有很强的反应原性,且不同蜱的重组蛋白间具有很强的交叉反应性。     

新城疫病毒F48 E9株M和NP基因的原核表达

根据新城疫病毒(NDV)F48E9国内标准强毒株编码序列设计了2对特异性引物,分别用于扩增M和NP基因.经序列测定,将其克隆到原核表达载体pET-30a( )上,转化E.coli BL21(DE3),筛选表达NDV F48E9株M蛋白和NP蛋白的菌株.IPTG诱导表达后,SDS-PAGE分析结果表明,NDV M蛋白在E.coli BL21(DE3)内以可溶形式存在,而NP蛋白以包涵体的形式表达.用纯化的M和NP蛋白免疫鸡制备超免疫血清,进行Western-blot分析;结果,它们可以与真核表达系统表达的M和NP蛋白以及NDV发生特异性反应,表明,原核表达系统表达的NDV M和NP蛋白具有良好的免疫原性和反应原性.     

中华泰勒虫MPSP基因的原核表达及反应原性分析

用生物信息学方法,对中华泰勒虫的梨浆虫主要表面蛋白(major piroplasm surface proteins,MPSP)基因的核苷酸序列及编码蛋白的氨基酸序列进行了分析,并对该蛋白的抗原表位、信号肽以及跨膜区进行了预测。设计特异性引物,对中华泰勒虫MPSP基因进行了克隆和原核表达,并对融合蛋白的反应原性进行了分析。SDS-PAGE结果显示,融合蛋白的分子质量约为38ku,分布于上清中。Western-blot试验表明,融合蛋白仅与抗His标签蛋白的单克隆抗体、中华泰勒虫阳性血清、瑟氏泰勒虫阳性血清、环形泰勒虫阳性血清发生反应,而与其他泰勒虫、巴贝斯虫和绵羊无形体阳性血清不发生反应。这些结果表明,中华泰勒虫MPSP可作为ELISA诊断方法的候选抗原。     

环形泰勒虫SPAG蛋白的原核表达及反应原性分析

根据GenBank中公布的环形泰勒虫子孢子表面抗原(SPAG)基因序列,结合生物信息学分析,对SPAG蛋白跨膜区和抗原表位进行分析。选取基因片段设计表达引物,从环形泰勒虫不同虫株的SPAG基因的保守区扩增目的片段,并构建SPAG-pET-30a重组表达载体,在大肠杆菌BL21(DE3)表达系统中进行表达,并对SPAG重组蛋白的反应原性进行分析。结果显示,获得的SPAG基因片段长度为882 bp,重组蛋白分子质量约为42 ku。反应原性分析显示,该重组蛋白可与环形泰勒虫阳性血清发生特异性反应,与中华泰勒虫、瑟氏泰勒虫、牛巴贝斯虫、双芽巴贝斯虫的阳性血清无交叉反应。本研究结果表明,SPAG蛋白有较好的反应原性和种特异性,可作为检测环形泰勒虫的候选抗原建立相应血清学诊断方法。     

IBDV H1株VP2基因的原核表达及其产物的复性

应用RT-PCR技术从传染性腔上囊病病鸡总RNA中克隆出1 461 bp的VP2基因,将其克隆于pET-28a载体,筛选并构建了pVP2表达载体。经IPTG诱导,在其宿主菌BL21(DE3) 中成功表达了53．7 ku的蛋白,SDS-PAGE和Western-blotting分析结果显示,VP2表达产物以包涵体形式存在,可与鸡IBDV抗血清及1株IBDV单抗发生特异性反应。将VP2表达产物进行纯化和复性,用复性前后的蛋白分别与特异性多抗进行Dot-ELISA检测,结果,复性后蛋白的反应活性比复性前增强了10倍;用复性后的蛋白与IBDV单抗进行Dot-ELISA,结果显示,VP2蛋白与单抗1H4、1E12、583、EA6、3C7反应强( );与4E4、1H11反应中度( );与4E5、3C4、 1E11、3H9反应较弱;而与EC6、3D12、1A1无反应。     

土耳其斯坦东毕吸虫原肌球蛋白基因的原核表达

将pGEM-TM质粒上的土耳其斯坦东毕吸虫原肌球蛋白(TM)基因片段亚克隆至原核表达载体pET28a(+),重组的pET28-TM在大肠埃希氏菌BL21(DE3)中经1 mmol/L IPTG诱导表达出一37.5 ku的融合蛋白。该蛋白经Ni-NTA亲和层析柱纯化,SDS-PAGE检测,出现与目的蛋白大小一致的单一条带。Western-blotting检测结果表明,纯化的蛋白可被自然感染东毕吸虫的山羊血清识别,这为进一步研究东毕吸虫基因工程疫苗奠定了基础。     

猪生殖与呼吸综合征病毒分离株dNsp2基因的原核表达

参考GenBank中收录的猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)JXA1株Nsp2基因序列,设计了1对引物用于扩增截短的Nsp2(deleting Nsp2,dNsp2)基因,用BamH Ⅰ+Xho Ⅰ双酶切后将目的基因插入到原核表达载体pET-32a(+)中,转化大肠杆菌BL21(DE3)进行表达,经SDS-PAGE电泳和Western-blot检测,dNsp2基因得到了高效表达,融合蛋白的分子质量约为36.5 ku,表达产物以可溶性方式存在于表达上清液中,表达量可达菌体总蛋白的30%以上,表达产物能被PRRSV变异株抗体所识别,具有较好的生物学活性.PRRSV变异株dNsp2基因的高效表达为该病毒ELISA检测方法的建立及应用奠定了基础.     

结核分枝杆菌pdhA基因的原核表达及其免疫原性分析

以结核分枝杆菌H37Rv菌株的基因组DNA为模板,采用PCR方法扩增出1 100bp的pdhA(pyruvate dehydrogenase E1component alpha subunit)基因,经限制性酶切后,与pET-28a载体连接,转化到大肠杆菌BL21中,重组菌经1mmol/L IPTG诱导表达了pdhA蛋白,并用Ni-His-resin纯化了目的蛋白,经Western-blot分析鉴定了目的蛋白的免疫原性。结果显示,重组质粒的双酶切鉴定和DNA测序均正确;SDS-PAGE和Western-blot分析结果显示,在44ku处获得一目的条带,且具有很好的免疫原性。本研究成功获得了高纯度的重组蛋白pdhA,为深入研究其功能奠定了基础。     

牛分枝杆菌CFP-10基因的原核表达及其表达产物的变态反应原性的鉴定

以牛分枝杆菌基因组为模板,PCR扩增获得CFP-10基因,并连入pET-32a(+)载体,获得了重组质粒pET-32a-CFP-10。将重组质粒转入宿主菌大肠杆菌Rosetta,经IPTG诱导后,重组蛋白rCFP-10以可溶形式表达并被纯化,将rCFP-10在致敏豚鼠皮内做迟发型变态反应(DTH)检测,并以PPD作为阳性对照。结果显示,测得rCFP-10组豚鼠皮肤红斑直径平均值为10mm,接近于PPD组(13mm)。结果证明,以pET-32a(+)为载体进行原核表达,获得的重组蛋白rCFP-10依然具有较强的迟发型变态反应原性,同时也证明了CFP-10具有作为皮试诊断试剂抗原的潜力,这一结果为牛结核病新型DTH皮试诊断的研究奠定了基础。     

轮状病毒VP4基因和VP7基因原核表达载体的构建及表达

经PCR从含有VP4基因、VP7基因片段的重组质粒 pT VP4和 pT VP7中扩增VP4、VP7基因 ,连接至 pGEM 5zf(+ )。经筛选和鉴定正确后同时酶切目的基因和表达质粒 pET 2 8a(+ ) ,连接、转化受体菌 ,经PCR、酶切和序列分析证明 ,连接向位和阅读框架是正确的 ,从而构建了轮状病毒保护性抗原VP4基因、VP7基因片段的原核表达载体 pET2 8a VP4、pET2 8a VP7。重组质粒转化表达菌在IPTG诱导下 ,用SDS PAGE、薄层凝胶扫描分析表达的蛋白。结果表明 ,表达的目的蛋白以包涵体的形式存在 ,蛋白的分子量分别为 37.6 9和 36 .2 0ku ,表达量占菌体总蛋白的比例分别为 17.1%和 14 .4 %。     

非洲猪瘟病毒P54基因原核表达载体的构建与表达

根据GenBank中非洲猪瘟病毒(ASFV)P54基因序列,设计合成了2对引物,采用PCR方法从ASFV DNA中分别扩增出了P54基因片段和经过改造的跨膜信号肽缺失的P54基因,将其克隆到表达载体pET28b中,构建了重组质粒pET-P54和pET-P54q,测序验证后转化入表达宿主菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE,Western-blotting检测.结果显示,经过改造的信号肽缺失的重组菌pET-P54q可表达出分子质量约24.5 ku的重组融合蛋白,表达的蛋白以可溶形式存在于菌体中,经镍柱亲和层析纯化可获得纯度较高的目的蛋白.纯化的蛋白能与ASFV阳性血清发生特异性的免疫印迹反应,证实,表达的蛋白具有较好的反应原性.     

流产布鲁氏菌omp25基因的克隆与原核表达

用设计的1对特异性引物对流产布鲁氏菌2型CVCC70502株总DNA进行外膜蛋白基因omp25的PCR扩增,得到了1条完整的基因,大小为642 bp;测序分析证明,它与国外报道的流产布鲁氏菌omp25基因的核苷酸序列完全一致。将该基因克隆到原核表达载体pGEX-6p-1中,经酶切、PCR扩增和测序分析,表明重组表达载体构建成功。将此重组质粒转化至宿主菌BL21(DE3)中,用IPTG进行诱导。结果证实,该基因可以在大肠杆菌中表达,表达产物为分子质量约50 ku的融合蛋白,与理论推测的蛋白分子质量一致;Western-blotting试验证明,表达蛋白OMP25可被流产布鲁氏菌阳性血清所识别。