细粒棘球绦虫排泄分泌抗原的研究──六钩蚴排泄分泌抗原的反应原性

本实验应用体外培养方法制备细粒棘球绦虫六钩幼排泄分泌（ＥＳ）抗原，应用酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ）首次对六钧蚴ＥＳ抗原的反应原性进行了初步分析。以５μｇ／ｍｌ包被反应板分别与已知阳性、阴性血清；人工感染血清，免疫血清，疫区屠宰绵羊血清；肝片吸虫、细颈囊尾蚴以及边虫感染的绵羊血清反应，结果表明六钩蚴ＥＳ抗原具有较好的反应原性。ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－２００层析对抗原有一定的纯化作用。纯化六钧蚴ＥＳ抗原可望用于绵羊棘球蚴病的免疫诊断。     

绵羊绦虫蚴囊液的SDS─PAGE分析

由于绵羊棘球蚴囊液（EgCF）取材相对方便具有较强的抗原活性，是诊断棘球蚴病抗体的较好抗原，但因EgCF成分复杂，在免疫诊断中有时与其它绦虫蝴病抗体发生免疫交叉反应。为查明绵羊棘球蚴和其它绦虫蚴抗原组分的异同，本文在分子水平上比较了细粒棘球蚴囊液细颈囊尾蚴囊液（CtCF）和多头蚴囊液（CcCF）可溶性蛋白多肽的异同。（一）材料与方法1.样品的制备：（1）EgCF：无菌抽取自然感染绵羊肝脏棘球蚴包囊液，5000r／min离心20min，取上清，PEG浓缩至1／10，蒸馏水透析除盐，经紫外吸收法测定其蛋白含量为2.4mg／ml，分装，-20°…     

羊脑多头蚴抗原的SDS－PAGE分析

采用十二烷基硫酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）对来自自然感染绵羊脑多头蚴的头节、囊壁可溶性抗原及囊液抗原用垂直平板电泳、连续凝胶系统进行了分析。电泳后以考马斯亮蓝Ｒ－２５０染色。结果：头节抗原共２６条多肽带，其分子量范围１７．５～１４８ｋＤ，其中主带５条，分别为７２、６９、４６、３７和３３ｋＤ；囊壁抗原共２０条多肽带，分子量范围１８～１２６ｋＤ，其中主带４条，分别为６９、４６、２９和１９ｋＤ；囊液抗原共２０条多肽带，分子量范围１８～１６２ｋＤ，其中主带４条，分别为９７、７２、５７和３８ｋＤ。初步阐明了羊脑多头蚴三种不同抗原的部分生化特性，为对该抗原的进一步深入研究奠定了基础。     

羊脑多头蚴抗原的二维电泳分析

对自然感染绵羊的脑多头蚴原头节可溶性抗原、囊壁可溶性抗原和囊液抗原经二维电泳分析，原头节可溶性抗原共显示７９个多肽斑点，其中酸性多肽斑点２６个，中性多肽斑点５个，碱性多肽斑点４８个；囊壁可溶性抗原共显示５９个多肽斑点，其中酸性多肽斑点２０个，中性多肽斑点４个，碱性多肽斑点３５个；囊液抗原共显示５５个多肽斑点，其中酸性多肽斑点２４个，中性多肽斑点５个，碱性多肽斑点２６个。三种脑多头蚴抗原共同多肽斑点３个，原头节可溶性抗原和囊壁可溶性抗原共同多肽斑点１４个，原头节可溶性抗原和囊液抗原共同多肽斑点５个，囊壁可溶性抗原和囊液抗原共同多肽斑点５个     

亲和层析纯化棘球蚴囊液特异性抗原的研究

本文应用兔抗健康羊IgG吸附柱、兔抗羊细颈囊尾蚴IgG吸附柱分别对绵羊棘球蚴囊液粗抗原进行了亲和吸附,制得了亲和纯抗原,并用ELISA法测定其抗原性。试验表明,经过兔抗羊细颈囊尾蚴IgG吸附柱吸附后的抗原,与非疫区绵羊血清反应的OD值都低,而与疫区血清反应的OD值都较高。经过兔抗健康羊IgG吸附柱吸附后,在不影响阳性检出率的情况下,可以降低阴性血清所致的假阳性反应,同时提高了细颈囊尾蚴的检出率。     

绵羊棘球蚴囊液抗原在IHA中的特异性研究

本研究应用粗制绵羊包囊液作抗原致敏经戊二醛处理的鞣酸化绵羊红细胞,进行微量间接血凝试验(IHA),检测棘球蚴病羊血清400份、健康羊血清45份、细颈囊尾蚴病羊血清13份、肝片吸虫病羊血清21份、边虫病羊血清20份、多头蚴病羊血清1份,阳性反应率依次为83.1％、13.33％、33.46％、4.35％、0％、0％。以40％饱和硫酸铵盐析抗原对上述健康羊血清、细颈囊尾蚴病羊血清及96份棘球蚴病羊血清的检测结果依次为13.33％、38.46％、87.5％。对分段盐析的其他组份及葡聚糖凝胶层析抗原、醋酸盐析抗原、牦牛肺包囊液抗原、鼠包囊液抗原也进行了初步试验,均未获得满意结果。     

西藏家畜三种绦虫蚴病感染情况的调查

采用剖检法检查西藏五县147只山羊、118只绵羊、114头牦牛、88头黄牛内脏器官、网膜、肠系膜、脑等组织器官,采集寄生虫幼虫,调查西藏家畜主要带科中绦期幼虫(细颈囊尾蚴、棘球蚴、脑多头蚴)的感染情况和危害程度。结果显示,山羊细颈囊尾蚴、棘球蚴、脑多头蚴的总体感染率分别为46.94%、4.08%、0,绵羊分别为62.77%、13.83%、4.26%;牦牛棘球蚴、脑多头蚴的感染率分别为15.79%、2.63%,黄牛的感染率分别为4.55%、0,说明绵羊更易感脑多头蚴;截至目前暂未在西藏发现山羊感染脑多头蚴;牦牛感染率幼畜与成年畜间差异极显著(P0.01),说明幼畜更易感。结果表明,西藏家畜这三种绦虫蚴病感染强度仍很高,需开展深入研究,加强寄生虫病防控工作。     

细粒棘球绦虫排泄分泌抗原研究——六钩蚴排泄分泌抗原、原头节、囊液及囊壁抗原的二维电泳分析

应用二维电泳、考马斯亮蓝G-250染色对细粒棘球绦虫六钧蚴排泄分泌抗原、原头节、绵羊及牦牛棘球蚴囊液以及囊壁抗原进行了初步分析。结果5种抗原分别显示多肽斑点108、64、85、124及83个;其中特异斑点分别为44、40、46、87及37个。对六钩蚴ES抗原多肽斑点的分析尚属首次。     

分泌抗细粒棘球蚴原头蚴抗原单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立

用感染包虫的绵羊肝包囊中的活原头蚴腹腔接种ＢＡＬＢ／Ｃ鼠，８个月后取鼠脾细胞与Ｓｐ２／Ｏ骨髓瘤细胞融合。经ＩＨＡ筛选，获得１４个阳性杂交瘤细胞株，对其中３林进行了克隆和进一步研究。结果表明，ＳＣ＿５与细颈囊尾蚴、脑包虫和肝片吸虫抗原均不发生交叉反应，腹水抗体的ＩＨＡ效价为１：２０４８，属ＩｇＧ＿２ｂ亚类：３Ｃ＿５和６Ｃ＿４与细颈囊尾蚴和脑包虫有轻度交叉反应，腹水抗体的ＩＨＡ效价为１：１２８，均属ＩｇＭ类。     

分泌抗细粒棘球蚴囊液抗原McAb杂交瘤细胞株的建立

用羊肝囊液纯化抗原免疫BALB/c鼠,取鼠脾细胞与SP2/o骨髓瘤细胞融合,经筛选及克隆化培养,获得3株分泌McAb的杂交瘤细胞株1D_3、3H_(11)和9E_(11)。3株McAb均属IgG_1亚类,能与人源和羊源的细粒棘球蚴囊液抗原反应,不与细颈囊尾蚴、肝片吸虫、脑包虫或弓形虫抗原反应。腹水中抗体的IHA最高效价可达2~(-13)。杂交瘤细胞经冻存、复苏和连续传代培养,分泌抗体性质稳定。     

黑龙江省部分市县猪绦虫蚴和犬绦虫感染情况调查

对来自黑龙江省17个市、县的156头猪进行了绦虫蚴感染情况调查,并对其中5个市、县的50头犬进行了绦虫感染情况调查.结果,细颈囊尾蚴、棘球蚴、猪囊尾蚴的感染率分别为50.6%、4.5%和3.2%;犬泡状带绦虫、细粒棘球绦虫的感染率分别为24.0%和4.0%.     

棘球蚴囊液抗原A和B在酶联免疫吸附试验中的应用比较

用醋酸缓冲液和４０％饱和硫酸铵连续沉淀法从绵羊棘球蚴囊液（ＳＨＣＦ）中得到部分纯化抗原（ＳＰＰＣＦ），并从中分离了抗原Ａ和抗原Ｂ，分别用单克隆抗体反向间接血凝试验（Ｍ－ＲＰＨＡ）、单克隆抗体双扩散试验（Ｍ－ＤＤ）和酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ）进行了鉴别，表明自制的三株单克隆抗体（ＭｃＡｂ）均识别ＳＨＣＦ、ＳＰＰＣＦ及抗原Ｂ，而不识别抗原Ａ；用ＥＬＩＳＡ对阳、阴性血清检测，ＳＰＰＣＦ、抗原Ａ和抗原Ｂ的阳性检出率分别为８３．３３％、８３．３３％和７５％，阴性符合率分别为７２．２２％、８６．１１％和７５％，表明抗原Ａ的敏感性和特异性均优于ＳＰＰＣＦ和抗原Ｂ。     

猪囊虫特异抗原的提取和应用的研究

将细颈囊尾蚴和棘球蚴的粗抗原超免家兔,从抗两种粗抗原的兔血清中提取γ球蛋白与CNBr活化的Sepharose 4B偶联制成免疫吸附柱进行亲和层析,排除猪囊虫粗抗原中与细颈囊尾坳和棘球蚴的共同抗原,得到纯化的猪囊虫特异抗原SACC。用SACC进行斑点试验(DIA)诊断猪囊虫病,结果表明,SACC不仅具有较强的特异性(99.62％),而且其敏感性(98.30％)与粗抗原的敏感性(98.86％)比较也没有明显降低。经免疫电泳分析也证明SACC是猪囊虫的特异性抗原。     

分泌抗细粒棘球蚴原头节可溶性抗原单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立

用SP2／0骨髓瘤细胞与以羊源细粒棘球蚴原头节可溶性抗原（SPA）免疫的Balb／c鼠脾细胞融合，经克隆和筛选后获得8株分泌抗SPA的杂交瘤细胞株，即3A_4、1IC_2B_3、2C_2、2E_3、3E_6、3F_(10)和3C_2。亚类鉴定为IgG_1（3A_4、3E_6、1C_2、3F_(10)和3C_2）、IgG_2b（2C_2)、IgG_3(2E_3）、IgG总（2B_3）。免疫双扩散法显示2C_2腹水及2B_3、2C_2、2E_3培养上清粗提物与SPA有反应，与细粒棘球蚴囊液（SHF）抗原及细颈囊尾蚴抗原（CtAg）无反应，以WesternBlot证实3A_4、2C_2、3C_2在SPA50KDa处有强反应带，但对SHP和CtAg亦有微弱反应。依赖于补体的杀伤试验及ADCC实验，提示这些单抗在寻求保护性抗原方面具有一定研究价值。     

细粒棘球绦虫重组EG95抗原在绵羊绦虫蚴病血清抗体检测中的应用

为了分析评价细粒棘球绦虫重组蛋白EG95(rEG95)在血清抗体检测上的效果,以细粒棘球绦虫EG95重组质粒pGEM-EG95为模板,经PCR扩增后将目的片段亚克隆至pET-28a(+),构建重组表达载体pET-EG95,在大肠杆菌BL21中表达,SDS-PAGE分离和电洗脱纯化重组表达产物rEG95。建立重组蛋白间接ELISA方法,检测绵羊带绦虫蚴病血清抗体水平。结果表明,表达产物经SDS-PAGE测定分子质量为21ku左右。该蛋白可被棘球蚴病阳性血清特异性识别,表明该表达产物具有反应原性。应用该重组蛋白间接ELISA检测18份脑多头蚴、15份细颈囊尾蚴、20份棘球蚴感染绵羊血清,24份疫苗抗原rEG95免疫羊血清和来自棘球蚴病疫区的179份绵羊血清,其阳性检出率分别是66.67%、80.00%、100%、91.67%和58.2%,而14份健康羊血清反应为阴性,组间差异有一定统计学意义(P<0.05)。表明EG95蛋白可作为绵羊带绦虫蚴病共同保护性抗原和诊断抗原而加以应用。     

细粒棘球绦虫排泄分泌抗原研究——六钩蚴排泄分泌抗原的免疫原性

本实验应用体外培养方法制备细粒棘球绦虫六钩蚴排泄分泌(ES)抗原,将其与弗氏不完全佐剂乳化后免疫绵羊2次,最后一次免疫后2周每只试验绵羊攻击1000枚虫卵,攻击后7个月剖杀试验羊观察肝肺包囊寄生情况。结果表明六钩蚴ES抗原具有很好的免疫原性,诱导的免疫保护力(减囊率)达96.04％;混合抗原为93.39％,囊液抗原为76.21％,囊壁抗原为30.62％。免疫后试验羊的抗体滴度与免疫保护力之间存在正相关关系。     

绵羊绦虫蚴病的防治

绵羊绦虫蚴病是由带科绦虫的中绦期所引起的一类疾病。在青海省常见多发的有细粒棘球蚴病、脑多头蚴病和细颈囊尾蚴病,给畜牧业生产造成了巨大的经济损失,并严重危胁着人的身体健康。为了研究制定切实可行的防治措施,我们于1988～1991年通过流行病学调查、活体诊断、病羊治疗、牧犬驱虫、科普宣传、患病器官处理综合防治措施,取得了较明显的效益。     

羊脑多头蚴抗原的等电聚焦电泳分析

采用等电聚焦电泳(IEF)技术,对自然感染绵羊的脑多头蚴的头节可溶性抗原、囊壁可溶性抗原和囊液抗原进行了分析.IEF电泳后,分别用考马斯亮蓝R-250法染蛋白质,PAS法染多糖,醋酸α-萘酯-坚固蓝法染酯酶同工酶,Nile's蓝法染脂.蛋白质染色后头节可溶性抗原显带42条,等电点(pI)4.89～8.72;囊壁可溶性抗原显带50条,pI 4.80～8.69;囊液抗原显带39条,pI 4.80～9.88.多糖染色后头节可溶性抗原显带22条,pI 4.04～8.30;囊壁可溶性抗原显带19条,pI 4.82～9.92.酯酶同工酶染色后头节可溶性抗原显带7条,pI 4.93～7.22;囊壁可溶性抗原显带7条,pI 4.93～6.91;囊液抗原显带13条,pI 5.23～9.70.脂染色后头节可溶性抗原显带3条,pI分别是4.03、5.69和8.63;囊壁可溶性抗原显带2条,pI分别是4.03和8.44;囊液抗原显带3条,pI分别是5.01、5.12和5.27.     

细粒棘球绦虫排泄分泌抗原研究——绵羊牦牛棘球蚴囊液几项生化指标的比较

本文应用聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦(IEF)电泳首次对绵羊、牦牛棘球蚴囊液的蛋白质、糖、脂及酯酶同功酶进行了初步分析。结果表明,用考马斯亮蓝R-250染蛋白质分别显示38及36条带;用RAS染糖,分别显示19及22条带;用Nile＇s蓝染脂,均显示7条带;用坚固蓝染酯酶同功酶,分别显示20及10条带。两者上述几项生化指标的差异是宿主特性不同的一个反映。本项研究为进一步阐明绵羊、牦牛棘球蚴囊液的生化特性积累了资料。     

多头绦虫抗原特性的研究（1）——囊液和囊壁粗抗原的免疫原性

用羊脑多头蚴囊液和囊壁粗抗原以１２ｍｇ／只的免疫剂量与等体积的白油－司班佐剂乳化，分３次免疫羊。于第３次免疫后１４ｄ，经口攻击感染多头绦虫虫卵２５００枚，攻击后２２５ｄ，剖杀检查免疫效果。结果囊壁粗抗原免疫组羊只全获保护，囊液粗抗原免疫组羊只（３／４）获保护，另１只羊脑中有直径０．６ｃｍ钙化的多头蚴病灶，其间为干酪样物质。而感染对照组羊脑中均有多头蚴寄生，其中１只羊脑中有３个多头蚴包囊，致使羊的脑组织极度萎缩，呈一层薄膜包围在包囊周围。免疫羊血清抗体滴度与免疫保护力之间呈正相关关系，免疫羊体重略高于对照羊