犊牛腹泻大肠杆菌O_(15)菌蜕的制备及免疫原性研究

为了制备犊牛腹泻大肠杆菌O_(15)菌株菌蜕并研究其免疫原性,克隆噬菌体PhiX174裂解基因E,并构建温控溶菌表达载体。制备HBTN3菌蜕,并研究其免疫原性。结果显示:成功构建了温控溶菌表达载体pBVE,并制备了HBTN3菌蜕。最大细菌裂解率是99.87%,剩余的活菌被冷冻干燥并失活。安全性试验结果证实是安全的。用扫描电子显微镜观察到菌蜕的形态完整且内容物排出。小鼠接种菌蜕会产生良好的免疫反应和保护,保护率为80%。该研究结果为防控犊牛腹泻大肠杆菌疾病奠定了基础。     

禽致病性大肠杆菌噬菌体vB_EcoM_JS09裂解酶的表达及其活性分析

为研究禽致病性大肠杆菌噬菌体vB_EcoM_JS09编码的裂解酶对宿主大肠杆菌的裂解作用,克隆表达了禽致病性大肠杆菌噬菌体vB_EcoM_JS09的裂解酶,并检测了裂解酶的菌体内外裂解活性。利用PCR扩增了禽致病性大肠杆菌噬菌体vB_EcoM_JS09裂解酶基因(Lysin基因),构建了重组表达质粒pET-32a(+)-LysJS09,测序验证后转化至大肠杆菌BL21(DE3)进行IPTG诱导表达。在37℃IPTG浓度为1.0mmol/L诱导4h表达效果最好。重组融合蛋白LysJS09在BL21(DE3)中获得了高表达,在N端具有His标签,其分子质量约为38.9ku。重组融合蛋白以分泌型方式表达,经His-trap HP(GE)亲和层析柱纯化后获得的重组蛋白LysJS09的纯度为97%。裂解活性试验表明,该裂解酶单独使用和加入EDTA(0.1mol/L)均无体外酶活性;但菌体内裂解试验表明,表达的裂解酶对宿主菌具有一定的裂解作用。     

猪流行性腹泻病毒S蛋白富含表位区域的原核表达与鉴定

猪流行性腹泻病毒(PEDV)是引起猪腹泻的重要病原之一,给世界养猪业带来严重危害。本研究对PEDV分离株JS-2纤突蛋白(S)进行抗原表位分析,选择3个富含表位片段的区域。通过RT-PCR扩增基因序列,克隆入p ET32a(+)载体,转化大肠杆菌BL21(DE3)中并进行诱导表达,SDS-PAGE电泳显示,成功表达了3个重组蛋白,分子质量与预期大小一致。将蛋白进行割胶回收,与油佐剂乳化后免疫小鼠,制备超免疫血清,利用PEDV包被抗原进行ELISA检测,结果免疫小鼠血清D450值达1.0左右,证实筛选制备的重组蛋白具有良好的免疫原性和反应原性。     

猪急性腹泻综合征冠状病毒膜蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备

为了制备猪急性腹泻综合征冠状病毒(SADS-CoV)抗膜蛋白(M)多克隆抗体,本研究以SADS-CoV GDS04分离株cDNA为模板扩增M基因片段,并将其克隆至原核表达载体pGEX-6p-1,构建重组质粒pGEX-6p-1-M.测序正确后将其转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达,所获得的重组...     

马流产沙门菌鞭毛重组蛋白FliC的原核表达及对小鼠的免疫保护试验

为研究马流产沙门菌新疆分离株鞭毛蛋白FliC(flagellin C)的免疫生物学特性及保护特性。本研究利用PCR技术扩增获得该菌的Fli C基因,并将其连接到原核表达载体p ET-28a(+)上,构建重组表达质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞后,用IPTG诱导表达重组蛋白,SDS-PAGE和Western-blot检测与分析表达蛋白,并将纯化的重组蛋白免疫小鼠。结果显示,成功诱导表达了52 ku的重组蛋白,该蛋白第2次免疫小鼠第14天时血清中的特异性Ig G抗体效价可达1∶72 900,且抗体亚型以Ig G1为主,免疫小鼠的攻击保护率可达73%。结果表明,Fli C重组蛋白具有良好的免疫原性和免疫保护效果。为进一步开展马流产沙门菌亚单位疫苗的研究奠定了基础。     

猪细胞因子信号传导抑制因子1蛋白的表达纯化与多克隆抗体制备

为制备猪细胞因子信号传导抑制因子1(SOCS1)的多克隆抗体,采用RT-PCR扩增猪SOCS1基因序列,将其克隆至原核表达载体pET-28a(+),构建重组表达载体pET28a-pSOCS1,并转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,在不同温度、IPTG浓度、诱导时间等条件下进行表达,确定最佳表达条件,并对重组蛋白pSOCS1进行纯化。以表达的重组蛋白pSOCS1免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,经4次免疫,间接ELISA测得抗体效价达到1∶51 200。Western-blot和间接免疫荧光试验结果表明,该多克隆抗体可与pSOCS1重组蛋白和经HEK293T细胞过表达的pSOCS1蛋白发生特异性反应,证明pSOCS1重组蛋白免疫原性良好。本研究为后续制备单克隆抗体、研究猪SOCS1相关作用机制奠定了基础。     

滑液支原体DnaK的原核表达及免疫原性分析和亚细胞定位

参照GenBank中滑液支原体(Mycoplasma synoviae,MS)WVU1853株dnaK基因序列(CP011096.1)设计并合成特异性引物,利用overlap PCR技术扩增获得MS dnaK基因,并将其克隆至pMD19-T载体,在序列分析的基础上将该基因克隆至pET-28a(+)质粒,构建原核表达载体pET-dnaK并转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导后,进行SDS-PAGE分析。继而将纯化表达产物免疫新西兰白兔制备多克隆抗体,并利用间接ELISA、Western-blot和免疫荧光试验对MS DnaK的免疫原性及其在细胞内的分布进行分析。结果显示,MS dna K基因全长1 791 bp,编码596个氨基酸,重组蛋白rMSDnaK在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达,且其相对分子质量约为67 ku。间接ELISA和Western-blot结果表明,rMSDnaK具有良好的免疫原性,且MS DnaK在其胞浆和胞膜中均有分布,但在胞膜中含量较多,免疫荧光试验进一步证实DnaK在MS膜表面的分布。本研究结果为进一步研究MS DnaK的生物学功能奠定了基础。     

肠毒素性大肠杆菌K99-ST1融合基因的克隆及原核表达

为有效预防肠毒素性大肠杆菌(ETEC)引起的犊牛和羔羊腹泻,将PCR扩增获得的ETEC K99菌毛抗原基因和人工合成的ST1基因片段,借助pUCm-T载体,构建了重组质粒pUCm-K99-ST1,从而获得了融合基因K99-ST1;使用EcoR I Sal I双酶切将该融合基因定向插入表达载体pET-30a中,成功构建了表达载体pET-K99-ST1,将其转入表达茵株BL21(DE3)中,经IPTG诱导,获得31 ku的蛋白;Western-blotring结果显示,该融合蛋白可与K99阳性血清发生特异性反应.     

布鲁氏菌延胡索酸水合酶与纤连蛋白和纤连蛋白溶酶原的结合活性

依据牛型布鲁氏菌(Brucella abortus)延胡索酸水合酶(fumarate hydratase classⅠ,Fumhy)基因序列设计1对特异性引物,以牛型布鲁氏菌A19株基因组为模板,通过PCR扩增Fumhy基因的开放阅读框,连接到pMD18-T Simple载体上后进行序列测定和分析;将Fumhy定向克隆到表达载体pET-28a中,构建重组表达质粒pET28a-Fumhy,并转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,在IPTG诱导下,进行Fumhy蛋白的表达,对表达的Fumhy蛋白进行免疫原性、与纤连蛋白和纤连蛋白溶酶原结合活性检测,研究Fumhy蛋白的免疫原性及相关的生物学活性。测序结果表明,Fumhy基因全长1 620bp,编码539个氨基酸;成功获得带有His标签的Fumhy重组蛋白His-Fumhy,大小为59ku,与预期结果相符合。Western-blot检测结果表明Fumhy蛋白具有免疫原性,且具有与纤连蛋白和纤连蛋白溶酶原结合活性。由此推测Fumhy蛋白可能参与布鲁氏菌在体内的感染过程。     

鸭瘟病毒gB基因B细胞和T细胞表位的预测及其主要抗原域基因的原核表达

应用生物信息学工具对本实验室鉴定的鸭瘟病毒(DPV)CHv毒株gB基因(GenBank登录号:EF608147)编码蛋白进行了B、T细胞表位预测,对其主要抗原域基因进行了PCR扩增,构建了原核表达载体pET-28a-gBM,并在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达.结果表明,重组菌可表达分子质量约46 ku的重组融合蛋白,表达蛋白以包涵体形式存在,约占菌体总蛋白的30%.Western-blot分析显示,表达蛋白能够被兔抗DPV多克隆血清特异识别,证实该氨基酸片段具有较强的免疫原性.     

肠炎沙门菌效应蛋白AvrA的原核表达及多克隆抗体的制备

为研究肠炎沙门菌(Salmonella enteritidis)avr A基因功能及其在感染过程中的表达分布情况,本研究通过PCR技术克隆获得了avr A基因,并构建了肠炎沙门菌Avr A原核表达载体p Cold-avr A,转入大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达;表达蛋白经纯化后免疫小鼠获得Avr A多克隆抗体,通过Western-blot检测了抗体特异性。结果显示,成功构建了表达载体p Cold-avr A,并获得了纯化的Avr A蛋白,成功制备了小鼠抗Avr A蛋白的多克隆抗体,可用于检测细菌Avr A蛋白的表达。本研究成功获得纯化的Avr A蛋白及其多克隆抗体,为进一步探讨Avr A在肠炎沙门菌感染过程中所发挥功能奠定了基础。     

表达H9N2亚型禽流感病毒HA2蛋白的延迟裂解型沙门菌DNA疫苗载体的构建

为了构建表达禽流感病毒H9N2亚型血凝素HA2蛋白的延迟裂解型沙门氏菌载体,本试验首先将绿色荧光片段EGFP插入到真核表达载体p YA4545中,构建重组质粒p YA4545-EGFP,并转染巨噬细胞系RAW264.7,共聚焦显微镜下观察其表达情况;再通过PCR技术扩增HA2基因,将其克隆到沙门菌载体p YA4545中,构建重组质粒p YA4545-HA2,继而转染HEK-293T细胞,收集细胞总蛋白,通过Western-blot检测HA2蛋白的表达情况;最后将重组质粒电转到沙门菌宿主χ11218中,检测重组菌对阿拉伯糖的依赖性。结果,p YA4545真核表达体系能够有效表达;重组质粒p YA4545-HA2的HA2蛋白成功表达;重组菌对阿拉伯糖具有明显依赖性。本试验成功获得了以延迟裂解型沙门氏菌为载体表达禽流感病毒HA2蛋白的菌株,为后续开发以HA2为目标抗原的新型口服疫苗奠定了基础。     

类弹性蛋白和Mxe内含肽介导的非洲猪瘟病毒重组蛋白K205R的表达与纯化

为了构建Mxe内含肽(mxe intein,MI)和类弹性蛋白(elastin-like peptide,ELP)介导的重组蛋白表达与纯化系统,将PCR扩增的MI序列和限制性内切酶切取的ELP序列插入原核表达载体pET-30a,获得融合表达载体pET-MIE;将PCR扩增的非洲猪瘟病毒(ASFV)K205R基因插入pET-MIE载体,获得重组载体pET-K205R-MIE;分别将pET-MIE和pET-K205R-MIE转化大肠杆菌,对其重组蛋白表达、逆向相变循环沉淀及MI自体裂解条件进行优化。结果显示,在20℃条件下K205R-MIE融合蛋白为可溶性表达,26℃条件下逆向相变循环沉淀融合蛋白的回收率达73.2%,26℃孵育4h的裂解效率达91.4%,K205R蛋白的回收率为51.3%,纯度高达92.2%,能被ASFV免疫血清识别。结果提示,成功构建了简单、经济的重组蛋白表达与纯化系统,制备的K205R抗原可用于ASFV诊断。     

疣状毛癣菌免疫原性的研究

本研究以疣状毛癣菌LTV菌株制成活菌湿苗、活菌冻干苗、灭活冻干苗及其代谢产物冻干菌,给犊牛进行肌肉注射免疫接种。活菌湿苗免疫4头牛,结果4/4保护,而湿苗对照组2/17保护;活菌冻干苗免疫7头牛,结果5/7保护;灭活冻干苗免疫7头牛,6/7保护;代谢产物冻干苗免疫5头,0/5保护;冻干苗对照组0/7保护。其结果证明,疣状毛癣茵(Trichophytonverrucosum)菌体对牛具有良好的免疫原性。     

流产布氏杆菌BPE123基因的克隆表达及生物信息学分析

根据GenBank中流产布氏杆菌BPE123基因序列(登录号:NC_006933.1),设计引物,以布氏杆菌病疫苗菌A19全基因组DNA为模板扩增BPE123基因,将目的基因克隆入pEASY-T3载体,测序正确后,双酶切pEASY-T3-BPE123,目的片段BPE123连入pET-32a(+)表达载体,构建表达质粒pET-32a(+)-BPE123,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达;对BPE123基因进行生物信息学分析。结果显示,成功构建了重组菌pET-32a(+)-BPE123-BL21(DE3),诱导表达了融合蛋白BPE123。生物信息学分析显示,BPE123基因N端25个氨基酸是其信号肽,与其相互作用的蛋白大都与菌毛相关,它们是flgF、fliI、motA、BruAb2_0155、BruAb2_0121和BruAb2_0125。布氏杆菌属内BPE123基因序列的同源性高达99%。本研究获得了BPE123蛋白并预测了BPE123基因的相关生物学功能,为进一步探索该蛋白的免疫原性和在布氏杆菌胞内寄生过程中的作用奠定了基础。     

猕猴溶组织内阿米巴凝集素hgl基因LC3段的克隆及原核表达

为了研究动物溶组织内阿米巴基因工程疫苗,以川西猕猴溶组织内阿米巴分离株中提取的总基因组DNA为模板,扩增了hgl基因抗原区LC3段,将其重组于原核表达载体pET-32b(+)中,构建了pET-32b(+)-hglLC3表达载体,转化至大肠杆菌BL21中,经IPTG诱导表达融合蛋白,获得了1200bp的hgl基因LC3编码区片段;SDS-PAGE分析结果显示,重组表达质粒产生了大小为66ku的目的条带,与预期的结果一致;Western-blot分析结果显示,重组蛋白与兔超免疫血清呈阳性反应,表明,该抗原可作为动物溶组织内阿米巴疫苗的候选抗原。     

福氏志贺菌2a多药耐药基因marA的克隆及其原核表达

根据福氏志贺菌2a多药耐药基因marA的序列,设计并合成了1对特异性引物,在引物的5'和3'端分别加入含有BamHⅠ和SalⅠ限制性酶切位点的序列,以福氏志贺菌2a菌株基因组DNA为模板扩增了marA基因序列.将PCR产物与pMD18-T载体连接,转化到大肠杆菌DH5α.鉴定成功获得目的片段后,经BamHⅠ+ SalⅠ双酶切并与载体pET-30a连接,构建原核表达质粒pET-30a-marA,并将其转化宿主菌BL21(DE3)pLys,用IPTG诱导其表达.SDS-PAGE分析表明,重组载体pET-30a-marA可成功地在大肠杆菌中表达MarA蛋白.Western-blotting检测证明,该蛋白能与志贺菌阳性血清发生特异性反应.     

鼠伤寒沙门菌SL1344 sseK2基因的克隆表达及生物信息学分析

为研究鼠伤寒沙门菌SL1344株SseK2蛋白的生物学特性,通过PCR扩增sseK2基因,构建原核表达质粒pET-32a-sseK2,经大肠杆菌BL21(DE3)表达、纯化后经SDS-PAGE和Western-blot鉴定,对sseK2基因编码的氨基酸进行生物信息学分析。结果显示,鼠伤寒沙门菌SseK2蛋白在大肠杆菌中呈可溶性表达,纯化获得较高纯度的蛋白。生物信息学分析显示,SseK2蛋白为可溶性蛋白,由348个氨基酸组成,分子质量约39.57 ku。该蛋白不含信号肽、无跨膜区,为膜外蛋白,包含4个N-糖基化位点、3个O-糖基化位点、56个磷酸化位点、15个B细胞线性结合位点和8个T细胞结合位点以及10个二硫键。其蛋白二级结构中以α-螺旋(Hh)占33.05%,无规则卷曲(Cc)占27.30%为主。成功构建了原核表达载体,并对其进行生物信息学分析,为进一步研究sseK2基因的生物学功能及在沙门菌致病机制中的作用奠定了良好基础。     

重组A型FMDV VP1基因减毒鼠伤寒沙门菌表达质粒的构建及表达

本试验通过构建重组A型FMDV VP1基因减毒鼠伤寒沙门菌,诱导产生外源蛋白,为减毒鼠伤寒沙门菌作为FMDV VP1口服活载体疫苗可行性提供研究基础。将A型FMDV VP1基因克隆后测序,根据减毒鼠伤寒沙门菌的密码子偏好性进行优化,再将其插入表达载体p YA3341之中构建重组质粒p YA3341-VP1。然后,将构建的重组质粒p YA3341-VP 1采用化学法转入大肠杆菌X6212中,筛选阳性克隆。经PCR鉴定和双酶切鉴定正确后,将重组质粒p YA3341-VP1依次转入减毒鼠伤寒沙门菌中间宿主X3730和表达宿主X4550中,在转入X4550后第3.5小时加入IPTG诱导表达,表达产物进行SDS-PAGE与Western-blot分析。结果表明,成功构建了重组减毒沙门菌X4550-VP1载体,且表达产物大小为23 ku,与预期目的蛋白大小相符。上述结果表明,FMDV VP1基因在减毒鼠伤寒沙门菌中得到了成功表达。     

口蹄疫病毒VP1蛋白诱导犊牛甲状腺初代细胞凋亡的鉴定

为了制备和培养犊牛甲状腺初代细胞(CTY),并检测口蹄疫病毒VP1蛋白对其诱导的凋亡情况,采用原代细胞培养方法,取初生犊牛甲状腺制备初代细胞并培养。采用RT-PCR方法扩增口蹄疫病毒VP1基因,再用限制性内切酶EcoRⅠ+XhoⅠ酶切后定向克隆到表达载体pCAGGS中,构建重组质粒pCAGGS-VP1,转染CTY,用Western-blot检测口蹄疫病毒VP1蛋白在犊牛甲状腺初代细胞中的表达情况;通过显微镜观察转染的CTY细胞状态、经AV-PI双染色、检测线粒体膜电位变化和Hoechst-33258荧光染色来检测细胞凋亡。结果显示,成功制备了犊牛甲状腺初代细胞,构建的重组质粒可以在犊牛甲状腺初代细胞中表达,通过几种方法均证明口蹄疫病毒VP1蛋白能够诱导犊牛甲状腺初代细胞的凋亡,细胞凋亡率比空载体对照组高约2倍。结果表明,口蹄疫病毒VP1蛋白能够诱导CTY的凋亡,这一结果为深入研究口蹄疫病毒VP1蛋白凋亡功能域和VP1诱导的凋亡途径奠定了基础。