猫杯状病毒GX2019的分离鉴定及全基因克隆遗传进化分析

从南宁某宠物医院疑似感染猫杯状病毒(Feline calicivirus,FCV)猫鼻咽拭子中,利用F81细胞分离1株FCV后,RT-PCR和电镜鉴定,测定TCID_(50)和理化性质。同时利用RT-PCR分段扩增病毒全基因序列,进行同源性及遗传进化分析。结果显示,FCV GX2019分离株的TCID_(50)为1×10~(-8.67)/0.1 mL,基因组全长为7 687 bp,与FCV CH-JL4(长春株)毒株核苷酸序列相似性最高,为85.3%,属于同一分支。氨基酸分析表明,与国内FCV疫苗株255、国外FCV疫苗株F9、FCV跛行综合征株2280及FCV GX01分离株氨基酸变异率分别为46.7%、26.7%、53.3%、40.0%,其中B细胞抗原识别表位中氨基酸位点发生了改变。     

猫杯状病毒GX2019的分离鉴定及全基因克隆遗传进化分析

从南宁某宠物医院疑似感染猫杯状病毒（Feline calicivirus,FCV）猫鼻咽拭子中,利用F81细胞分离1株FCV后,RT-PCR和电镜鉴定,测定TCID_(50)和理化性质。同时利用RT-PCR分段扩增病毒全基因序列,进行同源性及遗传进化分析。结果显示,FCV GX2019分离株的TCID_(50)为1×10~(-8.67)/0.1mL,基因组全长为7687 bp,与FCV CH-JL4（长春株）毒株核苷酸序列相似性最高,为85.3%,属于同一分支。氨基酸分析表明,与国内FCV疫苗株255、国外FCV疫苗株F9、FCV跛行综合征株2280及FCV GX01分离株氨基酸变异率分别为46.7%、26.7%、53.3%、40.0%,其中B细胞抗原识别表位中氨基酸位点发生了改变。     

三株猫杯状病毒的分离鉴定及致病性研究

为了解猫杯状病毒(feline calicivirus,FCV)在广西地区的流行情况与致病性,本研究采集55份疑似FCV拭子,按常规方法分离鉴定得到3株FCV,以VP1基因进行同源性分析,在77.5%～85%之间,这3株分离株(2019)与广西株GX01(2013)、吉林株CH-JL4(2015)、上海株SH(2014)及英国株F65(1999)、哈尔滨株HRB-SS(2014)处于同一进化分支,具有相同的遗传起源,但与目前临床上使用的国内疫苗株255、国外疫苗株F9处于不同的进化分支,存在疫苗免疫失败的风险。为了解这3株FCV的毒力,进行动物致病性试验。结果显示,模拟自然感染的试验猫,FCV潜伏期最长为7 d,5～7 d为排毒的高峰期,FCV存在短暂病毒血症的情况。器官病变集中在肺部,会出现明显的淤血、出血现象。这3株的感染率均为100%,死亡率分别为50%、50%、75%,表明这3株FCV毒株均有致病性。综合剖检和HE染色结果分析,致病力最强的是GXN3株。     

猫泛白细胞减少症病毒纳米PCR检测方法的建立与初步应用

为建立一种灵敏且快速检测猫泛白细胞减少症病毒（FPV）的分子检测方法,本研究采用纳米颗粒与普通PCR技术相结合,通过使用Oligo 7设计FPV的特异性引物,建立FPV Nano-PCR分子检测方法,并与普通PCR方法进行对比分析。结果显示,所建立的Nano-PCR的敏感度是普通PCR的10倍（10 fg/μL）;特异性试验表明,Nano-PCR只检测猫泛白细胞减少症病毒时呈阳性反应,而检测猫杯状病毒（FCV）、猫疱疹病毒（FHV）以及F81细胞cDNA/DNA时呈阴性反应。利用两种方法对采集的26份临床病料进行平行检测,发现Nano-PCR与普通PCR阳性率分别为53.84%和42.31%。上述结果表明,所建方法具有敏感性好、特异强、简捷快速等优点,可应用于临床样品的快速检测和鉴定,为猫泛白细胞减少症的早期诊断和防控提供了一定技术保障。     

疫苗开发的新领域--T细胞类疫苗

概述了T细胞疫苗的分子基础及合成肽疫苗、基因工程亚单位疫苗、基因重组嵌合病毒疫苗、化学偶联蛋白疫苗、DNA疫苗的研究现状和前景.     

猪传染性胃肠炎病毒分子生物学研究进展

阐述了猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)的基因结构、基因表达方式、结构蛋白及其功能、非结构蛋白、病毒的抗原性及免疫、分子生物学诊断技术和基因工程疫苗研究现状及有待深入研究解决的问题.     

预防动物传染病的新型疫苗

随着生物学的深入研究,出现了许多新型学科(分子遗传学,分子免疫学,分子微生物学,分子生物化学)和新技术(DNA重组,生物活性大分子的人工合成,淋巴细胞杂交瘤)。以微生物为实验对象,从分子水平进行了探索性和实用性研究,这为研制新型疫苗提供了理论和技术。 (一)基因工程苗 重组DNA技术的出现是生物科学中的一场革命,它为人类进一步认识遗传物质的组成及表达的调控、工业化生产各种生物制品展示了光辉灿烂的前景。从细菌或病毒的DNA有意义链上用限制性核酸内切酶切下带有粘性末端的目的基因,用连接酶把具有遗传标志的质粒和目的基因连为一体,     

猫杯状病毒的分离鉴定及其对理化因素抵抗力的研究

采集南京某宠物医院处置的疑似患猫杯状病毒病的家猫的鼻咽拭子,将其处理液接种于CRFK细胞,进行连续传代培养,出现特征性细胞病变。通过对该分离株进行形态学观察、PCR鉴定、间接免疫荧光试验,证明该分离株为猫杯状病毒(FCV),遂将其命名为FB-NJ-13。用RT-PCR分段扩增病毒基因组并将序列提交至GenBank(登录号:KM111557)。序列分析显示,该毒株与国内外参考毒株核苷酸序列的同源性在76.2%~79.6%之间。同时研究了该病毒对温度、酸碱、有机溶剂、干燥和紫外线照射等理化因素的抵抗力。结果显示,50℃30min或70℃5min即可灭活该病毒;该病毒在pH值为3的酸性环境中和pH值为10的碱性环境中不稳定;它对乙醚和氯仿不敏感;紫外线照射2.0h以上,可将该病毒有效灭活。上述研究结果为揭示我国FCV的分子生物学特征和遗传进化规律提供了重要的科学依据。     

猫传染性腹膜炎病毒实时荧光定量PCR方法的建立与应用

为建立一种高效准确检测猫传染性腹膜炎病毒(FIPV)的实时荧光定量PCR方法,以FIPV N基因为靶基因设计特异性探针和引物,构建质粒标准品。通过优化反应条件,建立real-time PCR方法,并进行临床检测。经方法优化,所建立方法的标准曲线为y=-3.137x+42.243,R²值为0.999,扩增效率E为108.0%。该方法与猫瘟病毒(FPV)、猫疱疹病毒(FHV)和猫杯状病毒(FCV)无交叉反应,特异性良好;检测最低拷贝数为9.250 copies/μL,比常规PCR方法高出100倍;组内、组间变异系数均小于5.0%,重复性好。采用建立的方法和EvaGreen real-time PCR方法对39份临床样品进行检测,结果,检出阳性样品数分别为24和22,经Kappa检验,两者高度一致。上述结果表明,本研究成功建立了高效、敏感、特异的实时荧光定量PCR方法,可用于FIPV的临床病例检测。     

猫泛白细胞减少症病毒的分离与鉴定

猫泛白细胞减少症(Feline panleukopenia,FP)又名猫瘟热(Feline distemper,FD)或猫传染性肠炎(Feline infectious enteritits,FIE)是由细小病毒科、细小病毒属中的猫泛白细胞减少症病毒(Feline panleukopenia virus,FPV)引起的对猫科动物危害极大的一种病毒性传染病。1928年Verge和Cristoforoni证明该病是由病毒引起,1964年Johnson从云豺体内第一次成功地分离出该病毒,以后又有许多国家成功地分离到该病毒。我国李刚等于1985年首次在家猫中分离到该病毒,并证明了该病在我国的流行。该病毒在自然条件下除猫以外,还可感染狮、虎、豹、貂等多种猫科和鼬科动物。近年来在昆明市花鸟市场中虽多次有疑似本病的疫情发生,但未能确诊。     

猫疱疹病毒Ⅰ型PCR检测方法的建立及初步应用

本研究旨在建立猫疱疹病毒Ⅰ型(FHV-1)PCR检测方法,并将其应用于临床样品FHV-1的快速检测。根据GenBank已发表的FHV-1 TK基因序列的保守区域设计合成1对引物,通过对反应体系的优化,建立了FHV-1 PCR检测方法,并验证该方法的特异性、敏感性、稳定性。结果显示,本研究建立的FHV-1 PCR检测方法对猫杯状病毒(FCV)、猫细小病毒(FPV)、犬瘟热病毒(CDV)均无交叉反应;可检测病毒DNA模板的最低浓度为3.78×101copies/μL;应用该方法从22份猫临床样品中检出17份FHV-1核酸阳性样品。上述结果表明,本研究建立的FHV-1 PCR检测方法特异、灵敏、快速、可重复,适合于临床FHV-1的快速检测。     

禽流感病毒血凝素基因的研究进展

叙述了禽流感病毒(AIV)血凝素(HA)基因的特点,HA 基因编码蛋白质的结构和功能,HA基因与AIV致病力的关系及HA基因工程疫苗的研究近况,以为AI的预防和治疗研究提供参考。     

猫杯状病毒纳米PCR检测方法的建立

为了提高猫杯状病毒(FCV)的检测效率,参考FCV全基因组序列的保守区域,利用生物学软件Primer Premier 5.0设计1对FCV特异性引物,并建立了FCV纳米PCR检测方法.结果显示,该方法特异性良好,与其他常见的猫病毒性病原均无交叉反应;该方法敏感性良好,最低检测量为5.4×10-3 pg/μ L的标准品,...     

猫泛白细胞减少症的调查

猫泛白细胞减少症(Feline panleukopenia)又名猫瘟热(Feline distemper)、猫传染性胃肠炎(Feline infection senteritis)。本病30年代发现于欧美国家,Bolin和Johnsoil分离和鉴定其病原为细小病毒。血清学调查表明本病近年来亦广泛流行于日本。国内曾发生于江苏、陕西等省的家猫及公园猫科动物。近两年来,贵州省黔西县广泛流行着一种以呕吐、稀便(后期部份猫便秘),体温正常或偏高,常规药物治疗无效,病势凶猛,死亡率     

猫泛白细胞减少症病毒的分离鉴定及其结构蛋白VP2可溶性表达的调控

为了研究猫泛白细胞减少症病毒（FPV）的生物学特性,可溶性表达FPV结构蛋白,研发基于VP2的新型亚单位疫苗,采集40份疑似FPV阳性的中华田园猫粪便样本,通过qPCR对样本检测后利用细胞培养、血凝试验、PCR和电镜观察等试验鉴定分离株,并对其VP2基因进行同源性比对。同时,构建pET-28aVP2、pET-28a-SUMO-VP2和pET-22a-SUMO-VP2重组质粒并利用大肠杆菌进行表达。结果显示,成功分离出1株FPV毒株;生物信息学分析表明,该毒株的VP2基因与此前报道的毒株同源性高达99%。蛋白表达结果显示,单独使用SUMO标签对VP2蛋白的可溶性表达影响较低;然而,当带有SUMO标签的重组质粒与4个分子伴侣（p G-KJE8、pGro7、pKJE7、pTf16）分别共表达时,可溶性VP2的表达量可显著提高。该研究可为FPV亚单位疫苗研发提供数据和有效的生物材料。     

犬新孢子虫AMA1基因重组猫疱疹病毒1型转移载体的构建及真核表达

为构建犬新孢子虫AMA1基因重组猫疱疹病毒1型(FHV1)转移质粒pBS-TK-NcAMA1,并在真核细胞中表达,以重组质粒pVAX1-NcAMA1为模板,扩增犬新孢子虫AMA1基因,并将其亚克隆至重组质粒pBS-TK。通过转染试剂PEI将pBS-TK-NcAMA1转移载体转染至293T细胞,以制备的小鼠抗犬新孢子虫AMA1蛋白的特异性抗体为一抗,应用间接免疫荧光试验和Western-blot对基因的表达情况进行鉴定。结果显示,构建的病毒转移载体pBS-TK-NcAMA1可以在293T细胞内获得表达,表达蛋白的分子质量为68ku。这一研究成果为犬新孢子虫AMA1基因的重组猫疱疹病毒1型载体疫苗的研制奠定了基础。     

猫CD3单克隆抗体的筛选与鉴定

为研究猫CD3的生物学功能、猫淋巴瘤和自身免疫性疾病的诊断及治疗方法,通过克隆构建含猫CD3胞外区基因的重组质粒,将ExpiCHO-S细胞和Expi293细胞表达的猫CD3蛋白分别作为免疫原和筛选抗原,利用杂交瘤技术制备抗猫CD3单克隆抗体（m Ab）,对其抗体亚型和杂交瘤细胞株稳定性进行鉴定和分析,IFA、Western-blot、免疫组化（IHC）和流式细胞术（FCM）分析其生物学特性。结果显示,成功制备了2株可持续稳定分泌抗猫CD3 m Ab杂交瘤细胞株,命名为2C9和3E1;亚型鉴定结果显示均为Ig G1型,轻链类型均为κappa型。IFA和Western-blot结果显示,2株抗猫CD3 m Ab均可与体外表达的猫CD3蛋白发生特异性结合。IHC和FCM结果显示只有2C9 m Ab可特异性识别猫脾、肠道淋巴组织及猫外周血单核淋巴细胞（PBMCs）中的T淋巴细胞。结果表明,本研究制备的猫CD3 m Ab为后续猫CD3分子的功能研究、猫淋巴瘤和自身免疫性疾病的诊断及治疗方法的建立奠定了基础。     

口蹄疫多表位疫苗的研究进展

概述了口蹄疫多表位疫苗研究的最新进展,并对口蹄疫合成肽疫苗、多表位疫苗、病毒样颗粒展示多表位疫苗和以自身蛋白质分子为载体的多表位疫苗的免疫原性进行了比较,旨在为研制高效、安全、多价的新型口蹄疫分子疫苗提供理论参考。     

犬副流感病毒实时荧光RPA检测方法的建立

为快速监控犬猫科动物中犬副流感病毒(CPIV)的感染情况,本研究针对CPIV核衣壳蛋白基因的保守序列,设计特异性引物和荧光探针,建立了CPIV实时荧光重组酶聚合酶等温扩增方法(real-time RPA)。结果表明,该方法具有良好的特异性,与其他犬病毒和同属的副黏病毒均未出现交叉反应;其敏感性与RT-PCR方法相近;将该方法应用于CPIV感染犬的临床组织样本、体表样本的检测,证实该实时荧光RPA方法具有良好的稳定性和可靠性。与现有的核酸检测方法相比,该实时荧光RPA方法检测周期仅30min即可完成结果判读,满足了犬猫科动物CPIV快速检测的需要。     

CRISPR/Cas基因编辑技术在动物DNA病毒病中应用的研究进展

CRISPR/Cas是一种细菌的适应性免疫系统,已被开发为基因编辑工具。近年来CRISPR/Cas基因编辑技术在病毒基因功能研究、病毒与宿主的相互作用、重组疫苗开发、病原学检测等方面得到广泛应用,其中CRISPR/Cas9由于其简便、高效的特点成为研究最深入、应用最成熟的一种类型。本文介绍了CRISPR/Cas的发现、分类以及不同Cas蛋白的作用机制,重点阐述该系统在动物DNA病毒性疫病中的应用进展,为动物DNA病毒性疫病防控提供参考依据。