17α-甲基睾酮在猪毛发中蓄积规律的研究

为建立猪毛发中17α-甲基睾酮残留的液相色谱-串联质谱检测方法,研究多剂量内服、单剂量肌肉注射两种给药方式下,17α-甲基睾酮在猪毛发的蓄积规律及差异,选用体重为(20.0±3.5)kg的杜长大三元杂交猪6头,随机分为2组,一组按体重4 mg/kg内服17α-甲基睾酮、连续给药30 d,另一组按体重4mg/kg单剂量肌肉注射17α-甲基睾酮,毛发样品均采集到给药后第61天。样品处理后经液相色谱-串联质谱仪分析检测。以时间为横坐标、质量分数为纵坐标,分析17α-甲基睾酮在猪毛发中的残留规律。结果显示,17α-甲基睾酮在0.75~1 000 ng/g范围内线性关系良好(r2=0.999 1);检测限为0.30 ng/g,定量限为0.75 ng/g。多剂量内服给药组,第一次给药后第10天,毛发中药物质量分数达到峰值,而后出现下降,到约16 d后趋于稳定,停药后逐渐下降;单剂量肌肉注射给药组,药物质量分数在给药后第10天达到峰值,而后迅速下降;两种给药途径,在给药后第61天均仍能检测到17α-甲基睾酮。结果表明,建立的检测方法灵敏度较高;多剂量内服给药组在给药30 d及停药后31 d内、单剂量肌肉注射给药组在给药后61 d内均可在猪毛发中检测到17α-甲基睾酮,但不同给药方式之间蓄积差异较大。     

鱼肌肉中氟苯尼考和氟苯尼考胺残留的高效液相色谱检测

建立了同时检测鱼肌肉组织中氟苯尼考和氟苯尼考胺残留的高效液相色谱检测法。以水和丙酮为提取溶液,Oasis MCX固相萃取柱为净化柱,采用Inertsil ODS—3(5μm,250 mm×4.6 mm i.d.)反相色谱柱,以A液(0.02 mol/L庚烷磺酸-钠0.025 mol/L磷酸钠溶液,二者体积比68∶32,pH3.85)与B液(含1 mL/L三乙胺的甲醇溶液)为流动相,梯度洗脱,紫外检测器225 nm处检测。结果显示,在10~1 000μg/kg浓度范围内,线性关系良好;加标回收率为75.9%~82.8%,日内变异系数为2.1%~5.8%,日间变异系数为4.7%~7.7%;氟苯尼考胺和氟苯尼考的检测限分别为5μg/kg和10μg/kg,定量限分别为10μg/kg和20μg/kg。结果表明,所建立的检测方法具有灵敏、准确、简便、快速的特点,适于同时检测鱼肌肉中氟苯尼考和氟苯尼考胺的残留。     

阿散酸在猪体内的药动学与生物利用度研究

选用体重25 kg左右的长×大二元杂健康猪8头,按双周期双交叉试验设计,进行静脉注射与内服阿散酸(10 mg/kg)的药动学研究。采用高效液相色谱法测定猪血浆中阿散酸的浓度,用统计矩原理处理血浆药物浓度-时间数据。结果显示:健康猪静脉注射阿散酸后的主要药动学参数为β=0.55 h-1±0.01h-1,t1/2β=1.26h±0.03 h,Vz=0.30L/kg±0.01 L/kg,Vdss=0.29 L/kg±0.01 L/kg,CL=0.17 L/(kg.h)±0.01 L/(kg.h),MRT=1.75 h±0.07 h,AUC=60.44μg/mL.h±0.01μg/mL.h;内服给药的主要药动学参数为β=0.39 h-1±0.02 h-1,t1/2β=1.79 h±0.09 h,tmax=1.81 h±0.09 h,Cmax=3.43μg/mL±0.53μg/mL,MRT=3.95 h±0.13 h,AUC=15.12μg/mL.h±0.01μg/mL.h,F=24.5%±3.4%。研究结果表明,阿散酸在健康猪体内的药动学特征为内服吸收迅速,血药浓度达峰时间短,但药物峰浓度低,绝对生物利用度低,消除快...     

沃尼妙林在猪体内的生物利用度及药代动力学研究

选用体重20kg左右的大×长二元健康阉公猪8头,按双周期、双交叉试验设计,进行静脉注射及内服沃尼妙林(10.5mg/kg)的药代动力学研究。采用液相色谱-串联质谱法测定猪血浆中沃尼妙林的浓度,用3P97药代动力学程序处理血浆药物浓度-时间数据。结果,健康猪静脉注射给药的药时数据适合一级吸收二室模型,主要药代动力学参数为:t1/2α=0.21h±0.07h,t1/2β=3.09h±1.09h,Vd=3.64L/kg±0.43L/kg,CLB=0.83L/(kg·h)±0.29L/(kg·h),AUC=12.93mg/L·h±4.57mg/L·h。健康猪内服给药的药时数据适合一级吸收一室开放模型,主要药代动力学参数为:t1/2ka=0.76h±0.05h,t1/2kel=2.19h±0.31h,tmax=1.70h±0.04h,Cmax=1.35μg/mL±0.06μg/mL,AUC=7.34mg/L·h±0.52mg/L·h,F=56.62%±3.75%。结果表明,沃尼妙林在健康猪体内的药代动力学特征是:内服吸收迅速,血药浓度达峰时间短,药物峰浓度高,绝对生物利用度较高,但有效血药浓度维持时间短,药物消除较快。     

高效液相色谱法同时检测水产品中7种四环素类抗生素残留的研究

采用Inertsil C8-3(5μm,250 mm×4.0 mm i.d.)反相色谱柱,以pH 4.0的EDTA-McIlvaine缓冲溶液为提取溶液,以HLB固相萃取柱为净化柱,以甲醇 乙腈 0.01 mol/L三氟乙酸为流动相(梯度洗脱),流速为1.5 mL/min,检测波长为350 nm,进样量100μL,建立了同时检测水产品中四环素、金霉素、土霉素、强力霉素、去甲基金霉素、甲烯土霉素和二甲胺四环素等7种四环素类抗生素残留的液相色谱法。该方法的检出限为1.5~5.0μg/kg,测定低限为50μg/kg,线性范围为50~1 000μg/kg,加标回收率为75.2%~100.6%,相对标准偏差为2.19%~10.56%。上述结果表明,该方法具有灵敏、准确、简便、快速等优点,适用于水产品中上述7种四环素类抗生素残留的同时检测。     

岭南黄鸡内服穿心莲超细粉后血中穿心莲内酯浓度的测定

以穿心莲内酯为指标性成分,应用RP-HPLC法,测定了岭南黄鸡内服穿心莲超细粉后血浆中穿心莲内酯的含量。结果,在测定的时间段(服药后第0~6 h),穿心莲内酯在血浆中均有分布,给药后约1 h达到峰值,峰浓度约为1.75μg/mL;给药后第6 h的峰浓度约为0.09μg/mL。平均绝对回收率为85.24%~91.18%,定量限、检测限分别为0.04和0.02μg/mL。研究结果为建立禽类血浆中穿心莲内酯的测定方法,对动物服用穿心莲后有效成分的吸收情况进行评价提供了基础资料。     

地昔尼尔乳剂在猪体内的药动学研究

为建立高效液相色谱法(HPLC)测定猪血浆中地昔尼尔质量浓度的方法,探讨地昔尼尔乳剂在猪体内的药动学特征,将50g/kg地昔尼尔乳剂以45mg/kg的单剂量为6头健康猪给药(背正中线浇泼),血浆经乙腈提取,采用HPLC测定了血液中地昔尼尔浓度。本试验条件下,地昔尼尔在0.05～20μg/mL内线性良好,r2=0.999,最低检测限为0.01μg/mL;其药时数据符合一级吸收二室模型,主要药动学参数为:t1/2ka=9.836h±0.198h,t1/2α=13.649h±0.124h,t1/2β=20.745h±1.187h,tmax=17.576h±0.216h,Cmax=9.129μg/mL±0.313μg/mL,AUC=450.010μg/mL.h±2.993μg/mL.h。结果表明,该测定方法专属、准确、灵敏,适用于地昔尼尔的药动学研究;地昔尼尔乳剂经皮给药后,在猪体内的吸收、消除速率较慢,达峰浓度高。     

吉他霉素在猪体内的药代动力学特征及残留检测方法的研究

对7头健康猪按随机交叉设计经单剂量(2.5×104U/kg)内服吉他霉素原药及其微囊制剂进行了药代动力学试验。血浆样品经磷酸氢二钾溶液碱化、无水乙醚提取后,采用HPLC法测定血药浓度。结果表明,药时数据均符合一级吸收二室开放模型,主要药代动力学参数为:原药t1/2ka=0.23h±0.05h,t1/2β=6.43h±2.38h,tmax=0.65h±0.17h,Cmax=6.97μg/mL±1.40μg/mL,AUC=19.98mg/(L.h)±8.16mg/(L.h);微囊制剂t1/2ka=0.55h±0.16h,t1/2β=10.63h±3.73h,tmax=1.25h±0.23h,Cmax=7.97μg/mL±1.63μg/mL,AUC=36.24mg/(L.h)±6.15mg/(L.h)。吉他霉素原药在猪体内吸收较快,但其微囊制剂分布更广泛并消除较缓慢。对猪肌肉、肝和肾等添加吉他霉素标样后均采用0.2%偏磷酸-甲醇萃取后过SCX小柱用甲醇抽提吹干,脂肪加标样采用正己烷除脂后用甲醇反萃取减压蒸干。采用HPLC法测定组织浓度。结果,各组织在0.05～6.4μg/g范围内线性关系良好(r0.999),吉他霉素在各组织中回收率均大于65.38%,批内及批间变异系数分别小于5.56%和4.60%,检测限为0.05μg/g。结果表明,此方法重复性好、灵敏度高,可用于猪组织中吉他霉素残留的检测。     

乙酰甲喹在家兔体内药物代谢动力学和首过效应的研究

为探讨家兔单次静脉注射和灌胃乙酰甲喹(30mg/kg)后的血浆药物代谢动力学特征,15只家兔被随机均分为A、B、C三组,A、B两组均通过消化道给药,但A组自心脏采血,B组自肝门静脉采血,C组则经耳缘静脉给药,自心脏采血。利用高效液相色谱法(定量限为0.1μg/mL)检测每个血浆样品中乙酰甲喹的质量浓度,之后以非房室分析法计算乙酰甲喹的药物代谢动力学参数。经消化道给药之后,A、B两组中乙酰甲喹的大多数药物代谢动力学参数均具有显著差异:消除速率常数(λz)分别为0.43h-1±0.11h-1和0.19h-1±0.02h-1;消除半衰期(t1/2λz)分别为1.76h±0.65h和3.69h±0.44h;药时曲线下面积(AUC0-∞)则分别为29.28(h·μg)/mL±4.4(h·μg)/mL和78.39(h·μg)/mL±7.28(h·μg)/mL。而静脉注射(C组)后,这些参数的数值分别为0.35h-1±0.03h-1、2.02h±0.18h和40.86(h·μg)/mL±6.76(h·μg)/mL,而体清除率(Cl)为747.93mL/(h·kg)±103.76mL/(h·kg),表观分布容积(Vz)为2 170.19mL/kg±308.96mL/kg。乙酰甲喹在A组和B组中的口服生物利用度分别为71.65%和192.85%。结果表明,静脉注射后,乙酰甲喹在家兔体内分布广泛、消除迅速;而灌胃给药后,乙酰甲喹吸收迅速,但存在明显的首过效应。     

100g/kg磷酸替米考星可溶性粉和100g/L替米考星溶液在鸡体内的比较药动学

采用单剂量平行随机对照试验设计,将24只健康肉用商品鸡随机分成2组,每组公母各半。分别单剂量(12mg/kg,根据体重以替米考星计)经口内服100g/kg磷酸替米考星可溶性粉和100g/L替米考星溶液(对照品)。给药后按预定时间采集血样,血浆中替米考星的质量浓度采用HPLC紫外检测器进行定量分析。对实测的血药浓度-时间数据采用Winnonlin5.2药动学分析软件计算药代动力学参数,对100g/kg磷酸替米考星可溶性粉和100g/L替米考星溶液在鸡体内的药动学参数进行比较研究。结果显示,100g/L替米考星溶液对照品单剂量内服后,平均消除半衰期(t1/2β)为17.316h,达峰时间(tmax)和峰值浓度(Cmax)分别为1.083h和0.399μg/mL,平均药时曲线下面积(AUC)为1.891h·μg/mL,平均滞留时间(MRT)为8.286h;100g/kg磷酸替米考星可溶性粉单剂量内服后,t1/2β为13.207h,tmax和Cmax分别为1.333h和0.372μg/mL,AUC为1.813h·μg/mL,MRT为7.612h。结果表明,100g/kg磷酸替米考星可溶性粉和100g/L替米考星溶液口服给药在鸡胃肠道内吸收迅速,消除较慢。两者经口给药的主要药动学参数之间均无显著差异(P0.05)。     

牛乳中三氮脒残留高效液相色谱检测方法的建立

以乙腈沉淀牛乳中的蛋白质,上清液采用Oasis WCX固相萃取小柱净化浓缩,用乙酸-甲醇溶液洗脱药物,研究了牛乳中三氮脒残留的高效液相色谱检测方法。洗脱液上机检测,紫外检测波长372nm,色谱分析柱为氰基柱,流动相为V(乙腈)∶V(甲酸铵溶液)=10∶90,等度洗脱。当样品中三氮脒的含量为0.010～1.00μg/mL时,药物质量浓度与检测信号存在良好的相关性(r2>0.999);牛乳中三氮脒的检测限为0.50×10-2μg/mL,定量限为0.010μg/mL。牛乳按0.010、0.10和1.00μg/mL 3个添加水平做三氮脒的回收率试验,回收率≥82%,变异系数在1.3～4.2之间。结果表明,本研究建立的三氮脒残留高效液相色谱检测方法重复性好,灵敏度高,操作简便,可用于牛乳中三氮脒残留的检测。     

犬新孢子虫不同靶基因PCR检测方法的比较

为筛选出检测犬新孢子虫更为特异、敏感的PCR方法,分别以MAG1、SAG1和Nc5为靶基因进行PCR检测,并从敏感性、特异性和临床样本检出率等方面进行了比较。结果显示,以Nc5为靶基因的PCR方法敏感性最高,最小检测DNA量为17.8fg/μL;以MAG1为靶基因的PCR方法敏感性最低,最小检测DNA量为17.8pg/μL;而以SAG1为靶基因的PCR方法的最低检测量为178fg/μL;3种靶基因引物均扩增不出刚地弓形虫、牛瑟氏泰勒虫、猪附红细胞体等基因片段,具有较好的特异性;对28份已攻犬新孢子虫标准株的BALB/c小鼠组织样本的检测结果表明,以Nc5基因设计的引物检出率最高,为75.0%(21/28),明显高于SAG1基因的67.9%(19/28)和MAG1基因的53.6%(15/28)。本试验为新孢子虫病的诊断及流行病学调查提供了更为敏感、特异的检测技术。     

非洲猪瘟TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立与应用

为建立检测非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)的快速诊断方法,本研究根据ASFV SY18株p17蛋白的编码基因D117L的保守序列设计并合成引物和探针,建立了基于ASFV p17蛋白的编码基因D117L的TaqMan荧光定量PCR检测方法,并验证其特异性、灵敏性和重复性。结果显示,本研究建立的TaqMan荧光定量PCR检测方法的C_t值与标准品在1×10^9~1×10^1copies/μL范围内呈良好的线性关系,相关系数为0.998,斜率为-3.192,检测下限为10 copies/μL,且与其他能引起相似症状的猪源病毒无交叉反应。重复性试验结果显示,组间与组内变异系数均小于1.920 7%,重复性好。此方法可用于ASF的早期诊断和ASFV快速检测。     

Ⅰ群禽腺病毒抗体间接hexon-ELISA检测方法的建立

为建立一种检测Ⅰ群禽腺病毒(FAVⅠ)抗体的间接ELISA方法,以FAVⅠhexon重组蛋白作为包被抗原,优化反应条件,建立了FAVⅠ抗体间接hexon-ELISA检测方法。抗原最佳包被浓度为10.0μg/mL,最适包被条件为37℃2h加4℃过夜;最佳封闭液为50g/L脱脂乳;血清最佳稀释度为1∶100,最佳作用时间为75min;酶标二抗最佳工作浓度为1∶2 000,最佳作用时间为45min;hexon-ELISA阴性、阳性临界值为0.379。用建立的hexon-ELISA方法检测100份鸡血清样品,阳性率为45%。结果表明,建立的hexon-ELISA方法简便、快捷,可大批量检测,具有良好的特异性、敏感性和重复性,适用于FAVⅠ的诊断、抗体水平监测及流行病学调查。     

猪肠病毒G型实时定量PCR检测方法的建立及初步应用

为建立一种能够准确、快速地鉴别猪肠病毒G型的诊断方法,本研究参考猪肠病毒G型的3D基因序列设计1对特异性引物,扩增片段预计大小约为104 bp,将3D基因片段克隆到pMD18-T载体上的阳性重组质粒作为标准品,建立猪肠病毒G型的实时定量PCR检测方法,并应用到临床样品的检测。研究结果显示,该方法设计的引物具有高度的特异性;标准曲线的Cq值与质粒标准品模板在2.92×10^8copies/μL^2.92×10^2copies/μL范围内,呈良好的线性关系,相关系数为0.998,斜率为-4.023;组内与组间重复性试验显示变异系数很小,在0.26%~1.57%之间。该方法的最低检测限量可达2.92×10 copies/μL。使用本方法对2017-2019年广西部分地区的猪场临床腹泻粪便样品进行检测,猪肠病毒G型阳性检出率为18.42%,说明广西部分地区的猪场存在猪肠病毒G型的感染。本研究成功建立了猪肠病毒G型实时定量PCR检测方法,可用于猪肠病毒G型感染的临床检测。     

氯霉素残留伏安免疫测试法的电化学条件

在间接竞争ELISA的基础上,建立了以碱性磷酸酶(ALP)-对硝基苯磷酸(pNPP)为反应体系的检测氯霉素(CAP)残留的伏安免疫方法,并对此法的电化学条件进行了详细的探讨。结果,在0.2 mol/L的B-R电解质溶液(pH3.0)中,当扫描速度为50 mV/s时,伏安法对硝基苯酚(PNP)的灵敏度最佳;且在1.2V处,该物质具有良好的氧化峰形。用此法测试CAP的检测下限达到0.064 ng/mL,检测线性范围为0.15~600 ng/mL。     

副溶血性弧菌LUXTM荧光PCR快速检测方法的建立

根据LUXTM荧光PCR技术原理,针对副溶血性弧菌toxR基因的保守序列,设计了特异的LUXTM荧光标记引物,通过优化反应条件与参数,建立了可快速检测副溶血性弧菌的LUXTM荧光PCR方法。结果显示,该方法高度敏感,对纯菌的检测低限达到每个反应体系7个菌(CFU),经6 h增菌培养后检测,对样品的检测低限(CFU)达到100/25 g;特异性强,对副溶血性弧菌2株标准菌株和10株参考菌株的检验均呈阳性,而对霍乱弧菌等28株非目标菌的检测均呈阴性;重复性好,定量检测的批内和批间变异系数均小于1%。应用此方法检测水产样品103份,检出阳性样品6份,与TaqMan荧光PCR和SN标准的检测结果完全一致。用此方法可在8 h内完成对样品中副溶血性弧菌的检测,其检测的快速性、敏感性和特异性与TaqMan荧光PCR技术相当,但检测成本更低。     

猪SIgA直接ELISA检测方法的建立及应用

采集猪肠黏液并分离纯化出猪分泌型免疫球蛋白A(SIgA),制备兔抗猪SIgA IgG抗体,经HRP标记,并优化直接ELISA检测猪SIgA的条件,建立了检测猪SIgA的直接ELISA方法。结果显示,筛选的最佳反应条件:黏液蛋白包被浓度为10μg/mL,兔抗猪SIgA IgG-HRP酶标抗体的工作浓度为1∶200,反应时间为60min。包被SIgA浓度标准曲线的线性范围为90～1 400ng/mL,回收率为85.85%～133.88%,变异系数为13.12%～17.67%。采用该方法对猪肺炎支原体灭活疫苗免疫与攻毒后的仔猪肺冲洗液和肠黏液中的SIgA进行检测;结果显示,攻毒后免疫猪肺冲洗液中SIgA含量平均为205.81ng/mL,显著高于攻毒对照猪的147.56ng/mL和空白对照猪的124.37ng/mL(P<0.05);免疫猪肠黏液中SIgA含量平均为67.94ng/mL,与对照猪无明显差异。结果证实,建立的猪SIgA直接ELISA方法具有经济、适用和准确的特点。     

山羊关节炎脑炎病毒SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法的建立及应用

为建立检测山羊关节炎脑炎病毒(caprine arthritis-encephalitis virus,CAEV)的快速诊断方法,本研究根据CAEV甘肃株Gag基因设计1对引物,并以含有CAEV甘肃株全基因组序列的质粒pUC57-CAEV为模板,建立CAEV的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法,并验证其特异性、灵敏性和重复性。结果显示,本研究所建立的SYBRGreenⅠ荧光定量PCR检测方法的Ct值与标准品模板在1.19×109~1.19×10^1 copies/μL范围内呈良好的线性关系,相关系数为0.997,斜率为-3.74,检测下限为1.19×10^1 copies/μL,且对痘苗病毒、山羊痘病毒均无扩增。重复性试验结果显示,批间与批内变异系数均小于1%,重复性好。本研究首次建立了CAEVGag基因的SYBRGreenⅠ荧光定量PCR检测方法,为CAEV的快速检测和病毒感染预防提供了技术手段。     

动物性食品中大肠埃希氏菌O157∶H7特异性二重PCR检测方法的建立

根据大肠埃希氏菌O157∶H7wzx和fliC基因的保守序列设计了2对引物,建立并优化了特异性检测大肠埃希氏菌O157∶H7的二重PCR体系,扩增产物为395bp(wzx)和1057bp(fliC)。人工培养基中大肠埃希氏菌O157∶H7的检测下限为2.3×102CFU/mL,人工污染的牛乳、猪肉及牛肉中大肠埃希氏菌O157∶H7的检测下限分别为5.8×102CFU/mL、4.3×102CFU/g和3.1×103CFU/g。样品经3h预增菌后检测下限可达3.1×100~5.8×100CFU/mL(或CFU/g)。试验结果提示,针对wzx及fliC基因的二重PCR方法可以快速特异地检测出牛乳、猪肉及牛肉中大肠埃希氏菌O157∶H7的污染。