ASFV和PRRSV多重TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立与初步应用

为了建立一种可同时精准、快捷鉴别检测非洲猪瘟病毒(ASFV)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的方法,本研究选择猪源β-actin为内参基因,根据ASFV的P72基因及PRRSV的ORF6基因设计特异性引物及TaqMan探针,通过优化反应条件,建立了ASFV和PRRSV多重TaqMan荧光定量PCR检测方法,对该方法的特异性、敏感性、重复性进行验证,并初步应用于临床样品的检测。结果显示,该方法可在45 min内完成对ASFV、PRRSV及猪源β-actin基因的特异性扩增;对ASFV、PRRSV及猪源β-actin标准品模板的最低检测拷贝数分别为7.87×10¹ copies/μL、1.19×10² copies/μL和5.99×103copies/μL,同一模板的3次重复试验的组内及组间变异系数均小于2%;用该方法检测92份临床样品,未检出ASFV,检出19份PRRSV阳性样品。结果表明,本研究建立了一种可快速鉴别检测ASFV及PRRSV的多重荧光定量PCR方法,较普通PCR敏感性高10³倍,可应用于ASFV和PR...     

非洲猪瘟病毒LFD-RPA快速检测方法的建立

本研究根据非洲猪瘟病毒(ASFV)B646L基因保守序列设计nfo RPA特异性引物和探针,建立了ASFV核酸LFD-RPA快速检测法。结果表明,该方法特异性强,与猪圆环病毒2型(PCV2)、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、口蹄疫病毒(FMDV)、猪A型塞内卡病毒(SVA)等病原核酸无交叉反应;最低可以检测到1.57×10~2copies/μL重组质粒pUC-B646L;检测时间短,其中RPA扩增20 min,LFD检测10～20 min。应用该法及OIE推荐的荧光PCR法对24个模拟样品进行检测,检测结果一致。对50份已知的临床样品核酸进行检测,阳性符合率为73.3%。上述结果表明,本研究建立的LFD-RPA快速检测方法操作简便,为ASFV现场快速检测提供了技术支持。     

非洲猪瘟TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立与应用

为建立检测非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)的快速诊断方法,本研究根据ASFV SY18株p17蛋白的编码基因D117L的保守序列设计并合成引物和探针,建立了基于ASFV p17蛋白的编码基因D117L的TaqMan荧光定量PCR检测方法,并验证其特异性、灵敏性和重复性。结果显示,本研究建立的TaqMan荧光定量PCR检测方法的C_t值与标准品在1×10^9~1×10^1copies/μL范围内呈良好的线性关系,相关系数为0.998,斜率为-3.192,检测下限为10 copies/μL,且与其他能引起相似症状的猪源病毒无交叉反应。重复性试验结果显示,组间与组内变异系数均小于1.920 7%,重复性好。此方法可用于ASF的早期诊断和ASFV快速检测。     

非洲猪瘟病毒实时荧光RAA检测方法的建立

为了建立非洲猪瘟病毒(ASFV)简捷、高效的基层临床检测方法,本研究选取非洲猪瘟病毒保守基因B646L (P72)序列,设计特异性引物和探针,建立非洲猪瘟病毒实时荧光重组酶介导等温扩增(RAA)检测方法。结果显示,所建立方法与OIE推荐的荧光定量PCR方法灵敏度相当,低至10 copies,μL,检测时长仅需10 min,与口蹄疫病毒(FMDV)、猪细小病毒(PPV)、伪狂犬病病毒(PRV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)均无交叉反应。对100份临床样品的检测结果与OIE推荐的荧光定量PCR结果一致,但相较于荧光定量PCR检测时间的2h,检测时间大大缩短。结果表明,本研究建立的方法灵敏度较高、特异性较好,为ASFV早期临床诊断提供了技术支持。     

非洲猪瘟病毒环介导等温扩增诊断方法的建立

通过对GenBank中登录的非洲猪瘟病毒(ASFV)p72蛋白基因序列进行分析,根据p72保守区序列设计合成了内(FIP,BIP)、外(F3,B3)2对引物,其中外引物扩增片段的大小为184bp。通过对反应条件进行优化,建立了非洲猪瘟LAMP检测方法。结果显示,该方法在62℃保温60min即可完成,最低可检测到1×101 copies/μL的病毒DNA,与常规PCR方法相比灵敏度高100倍。对ASFV、猪圆环病毒2型、猪细小病毒、猪伪狂犬病病毒基因组DNA同时检测,结果仅有ASFV出现条带,而其他均未出现目的条带。表明,建立的ASFV-LAMP诊断方法具有较好的特异性和敏感性。     

同时检测五种引起猪繁殖障碍的病毒的多重PCR的建立

为建立一种能同时检测5种引起猪繁殖障碍的病毒的多重PCR方法,分别针对各病毒的保守序列设计了4对特异性引物,其中3对分别用于扩增猪瘟病毒(CSFV)E2基因、非洲猪瘟病毒(ASFV)VP72基因、伪狂犬病病毒(PRV)gB基因的目的片段;针对NSP2基因设计的1对引物用于区分猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)。通过对反应条件的优化,建立了快速检测CSFV、ASFV、PRV、PRRSV和HP-PRRSV的多重PCR方法。敏感性试验结果显示,该多重PCR对这5种病原核酸的最低检测量分别为2.10×103(HP-PRRSV),1.30×103(PRRSV),1.09×104(CSFV),1.50×103(ASFV)和8.97×102(PRV)copies/μL。对49份临床样品的检测结果显示,它们的混合感染率为51%(25/49)。该方法对阴性样本的扩增结果均为阴性,并且无交叉反应性,表明该方法特异性良好,具有快速、灵敏且成本低等优点,能够对猪繁殖障碍病毒病的单个或混合感染的临床样品进行快速鉴别诊断,并对其流行病学调查具有深远意义。     

非洲猪瘟病毒免提取核酸荧光定量PCR检测方法的建立

根据非洲猪瘟病毒(ASFV)保守的VP72基因序列,设计特异性引物和探针,经过优化反应体系中各组分及反应条件,建立了直接检测样品中ASFV的荧光定量PCR方法,并分析该方法的特异性和敏感性。结果显示,该直扩荧光定量PCR方法只对ASFV有特异性扩增,对其他几种相似疾病病原的灭活抗原,如猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒、猪圆环病毒、口蹄疫病毒、印第安纳型水泡性口炎病毒、新泽西型水泡性口炎病毒、猪流行性腹泻病毒等检测均呈阴性。敏感性试验结果显示,对10倍梯度稀释的非洲猪瘟病毒灭活抗原的检测敏感性可达1×10~(-6),与OIE推荐的传统的荧光PCR的检测敏感性相当。3个ASFV稀释度样品的组内和组间重复的变异系数均小于5%。该方法无须提取核酸,可在60 min内完成对样品的检测,检测快速、灵敏,结果准确,结合便携式荧光PCR仪,为野外或现场的非洲猪瘟病毒快速检测提供了一种切实可行的方法。     

非洲猪瘟病毒荧光RPA快速检测方法的建立及初步应用

本研究根据非洲猪瘟病毒(ASFV)基因组中序列保守稳定的B646L基因设计特异性引物和探针,建立了敏感、特异、高效的ASFV核酸RPA快速检测法。结果显示,该方法特异性强,能准确检测ASFV核酸,与猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征(PRRSV)、猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2)、口蹄疫病毒(FMDV)、猪A型塞内卡病毒(SVA)等灭活病毒核酸无交叉反应;敏感性高,本试验中最低可检测到2×101copies/uL;检测时间短,15 min即可完成反应;重复性好。采用ASFV灭活抗原和猪血液制备模拟临床猪血样品,能检出灭活抗原的稀释度为1∶12 800,应用该方法对200份进口冻猪产品及供港猪场420份猪抗凝血进行检测,结果均为阴性,与OIE推荐的实时荧光PCR法检测结果相同。本研究建立的RPA快速检测法操作简便,尤其适合ASFV现场快速检测。     

非洲猪瘟病毒CD2v基因实时荧光PCR检测方法的建立

为建立一种准确、特异、高效、快速的非洲猪瘟病毒(ASFV)实时荧光PCR检测方法,本研究根据ASFV CD2v基因序列,设计了TaqMan荧光PCR引物及探针,通过优化退火温度、引物及探针的比例,建立了ASFV的TaqMan实时荧光PCR检测方法。结果表明,本研究所建立的荧光PCR方法具有良好的特异性和敏感性,以重组质粒为标准品建立的TaqMan荧光PCR方法的标准曲线具有良好的线性关系,相关系数为0.988,斜率为-3.025 4,最低检测限可达到10 copies/μL,且与伪狂犬病病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒2型、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒等多种猪病病毒不存在交叉反应。该方法重复性良好,批内和批间变异系数均小于2%。综上,本研究建立的非洲猪瘟CD2v基因实时荧光定量PCR方法为ASFV的检测提供了一种新的敏感、特异的分子检测技术。     

非洲猪瘟病毒CD2v基因实时荧光PCR检测方法的建立

为建立一种准确、特异、高效、快速的非洲猪瘟病毒（ASFV）实时荧光PCR检测方法，本研究根据ASFV CD2v基因序列，设计了TaqMan荧光PCR引物及探针，通过优化退火温度、引物及探针的比例，建立了ASFV的TaqMan实时荧光PCR检测方法。结果表明，本研究所建立的荧光PCR方法具有良好的特异性和敏感性，以重组质粒为标准品建立的TaqMan荧光PCR方法的标准曲线具有良好的线性关系，相关系数为0.988，斜率为 －3.025 4，最低检测限可达到10 copies/μL，且与伪狂犬病病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒2型、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒等多种猪病病毒不存在交叉反应。该方法重复性良好，批内和批间变异系数均小于2%。综上，本研究建立的非洲猪瘟CD2v基因实时荧光定量PCR方法为ASFV的检测提供了一种新的敏感、特异的分子检测技术。     

毛皮兽阿留申病毒可视化交叉等温扩增检测方法的建立及初步应用

为建立快速、特异、灵敏的毛皮兽阿留申病毒可视化交叉引物等温扩增检测方法(CPA),以阿留申病毒属内病毒序列为参考,在VP2序列高变区保守区段设计合成4条特异引物。通过优化CPA反应条件,建立了毛皮兽阿留申病毒可视化交叉引物等温扩增检测方法,并进行了特异性、敏感性试验以及对临床样品的检测。结果显示,该方法可扩增水貂阿留申病毒(AMDV)和狐貉阿留申病毒(RFAV),对犬科和水貂组织以及常见病毒无特异性反应;对AMDV、RFAV可视化检测下限分别为5.38×10~2copies/μL、5. 93×10~2copies/μL;对83份临床样品的检测结果显示,其中有16份PCR检测为阴性,CPA、qPCR检测为阳性的样品,表明CPA检测方法优于传统PCR。本试验建立了一种高敏感性、特异性检测毛皮兽阿留申病毒的方法,通过添加荧光染料实现了可视化检测,它更加适合基层兽医站、养殖场进行快速核酸检测。     

一种基于M基因的尼帕病毒TaqMan-MGB荧光RT-PCR检测方法的建立

为建立一种快速、敏感和特异地检测尼帕病毒(Nipah virus,NiV)的方法,根据NiV M基因序列保守区设计了1对特异性引物和探针,通过优化反应条件,建立了一种检测NiV的TaqMan-MGB实时荧光RT-PCR方法,并对该方法进行特异性、定量线性范围、敏感性和重复性等试验。结果显示,该方法仅对NiV M基因的RNA标准对照(NiV-M-RNA)发生特异性扩增反应,对猪的其他常见病毒,包括经典猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪流行性腹泻病毒、猪流感病毒、伪狂犬病病毒、猪细小病毒和猪圆环病毒2型均不发生交叉反应。该方法对NiV-M-RNA的最适线性检测范围为4.6×101~4.6×107 copies/μL,标准曲线方程为y=-3.418x+37.57,线性相关系数(r2)为0.999,检测下限为4.6copies/μL。对5个不同浓度(4.6×103~4.6×107 copies/μL)的NiV-M-RNA进行双份样品的4次重复检测,每个浓度重复试验的Ct值的变异系数均小于1.5%,具有良好的重现性。用该方法对368份临床样品进行NiV检测,结果均为阴性。本方法的建立为活猪临床样品中NiV检测提供了一种快速、敏感和特异的技术手段。     

猪德尔塔冠状病毒SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法的建立及应用

为建立猪德尔塔病毒(porcine deltacoronavirus,PDCoV)快速灵敏的诊断方法,采用RT-PCR方法扩增猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)M基因,将M基因克隆到载体pEASY-Blunt Cloning Kit,以构建出的重组质粒作为标准阳性质粒,并以此为模板建立PDCoV M基因的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法,并对该方法进行敏感性、特异性和重复性等验证。结果,建立的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法的Ct值与标准品模板在6.57×10~8～6.57×10~1copies/μL范围内呈良好的线性关系,相关系数为0.999,斜率为-4.215;该方法特异性强,对PEDV和TGEV猪常见病原检测均无特异性扩增;可重复性良好,组内和组间变异系数均小于2%;灵敏度可达6.57×10~1copies/μL;对临床样品的检测,本研究建立的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法的阳性检出率为5.0%。上述结果表明,本研究成功建立了检测PDCoV的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法,可实现对PDCoV的快速灵敏诊断。     

猫疱疹病毒Ⅰ型PCR检测方法的建立及初步应用

本研究旨在建立猫疱疹病毒Ⅰ型(FHV-1)PCR检测方法,并将其应用于临床样品FHV-1的快速检测。根据GenBank已发表的FHV-1 TK基因序列的保守区域设计合成1对引物,通过对反应体系的优化,建立了FHV-1 PCR检测方法,并验证该方法的特异性、敏感性、稳定性。结果显示,本研究建立的FHV-1 PCR检测方法对猫杯状病毒(FCV)、猫细小病毒(FPV)、犬瘟热病毒(CDV)均无交叉反应;可检测病毒DNA模板的最低浓度为3.78×101copies/μL;应用该方法从22份猫临床样品中检出17份FHV-1核酸阳性样品。上述结果表明,本研究建立的FHV-1 PCR检测方法特异、灵敏、快速、可重复,适合于临床FHV-1的快速检测。     

猪δ冠状病毒TaqMan-MGB荧光定量RT-PCR方法的建立和应用

为了快速准确地检测猪δ冠状病毒(porcine deltacoronavirus,PDCoV),本研究根据PDCoV基因序列保守区设计特异性引物和TaqMan-MGB探针,建立了一种特异性检测PDCoV的TaqMan-MGB荧光定量方法。结果显示,该方法特异性良好,对猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒、猪伪狂犬病病毒、猪细小病毒和猪圆环病毒2型等的检测结果均为阴性,无交叉反应;模板浓度在3.15×108～3.15×101copies/?L范围内具有良好的线性关系;敏感性高,最低检测限为10 copies/?L的模板;重复性好,批内和批间重复性试验变异系数分别为0.25%～1.06%和0.58%～1.27%;对临床样品的检测结果显示,本研究建立的荧光定量检测方法对PDCoV的阳性检出率(40%)高于常规PCR方法对PDCoV的阳性检出率(31.7%)。该方法的建立为PDCoV的实验室鉴别诊断及流行病学调查提供了快速、准确的检测手段。     

毛皮兽阿留申病毒SYBR Green Ⅰ-qPCR检测方法的建立及病毒种鉴别

为建立快速定量检测、鉴别毛皮兽阿留申病毒的SYBR Green ⅠqPCR方法,以阿留申病毒属内病毒序列为参考,在VP2序列高变区的保守区段设计合成1对引物。结果,该方法检测水貂阿留申病毒(AMDV)、狐貉阿留申病毒(RF AV)的最低浓度分别为5.38×10~2copies/μL、5.93×10~2copies/μL,且通过熔解曲线可区分鉴别不同病毒种。对55份临床样品以及4株RFAV进行定量检测,结果,有13份PCR检测为阴性的样品被qPCR检测为阳性,说明qPCR检测方法的灵敏度优于普通PCR。上述结果表明,本试验建立的方法是一种高敏感性、特异性检测毛皮兽阿留申病毒,并可通过实测Tm值区分阿留申病毒的分子诊断技术。     

西藏环状病毒荧光定量RT-PCR检测方法的建立

为了建立检测西藏环状病毒(Tibet orbivirus,TIBOV)的快速核酸检测方法,根据新分离的西藏环状病毒(DH13C120)Seg-10基因序列,设计了特异性引物及探针。通过优化反应条件,建立了检测西藏环状病毒核酸的荧光定量RT-PCR方法,并对该方法的特异性、敏感性和重复性进行了检测。结果显示,该方法在2.31×10~8～2.31×10~2copies/μL质粒标准品浓度之间具有良好的线性关系,相关系数为0.999;组内与组间的变异系数均小于2%;最低检测下限为2.31×10~1copies/μL;对蓝舌病病毒、鹿流行性出血热病毒、阿卡斑病毒、盖塔病毒和流行性乙型脑炎病毒检测结果均为阴性,无交叉反应;对云南新分离的9株西藏环状病毒进行检测,拷贝数在3.23×10~5～1.54×10~6copies/μL之间,准确率为100%;对2013年采集自云南江城县的48份牛血液样品进行检测,检出西藏环状病毒阳性3份。结果表明,本研究建立的西藏环状病毒荧光定量RT-PCR检测方法具有良好的特异性、敏感性和重复性,适用于西藏环状病毒的快速检测,对西藏环状病毒的检测和流行病学调查提供了技术手段。     

猪丁型冠状病毒TaqMan实时定量RT-PCR检测方法的建立和应用

根据GenBank中登录的猪丁型冠状病毒(PDCoV)N基因序列在保守区设计合成特异性引物和TaqMan探针,构建含有PDCoVN基因的重组质粒作为阳性标准品,通过优化各项反应条件,建立了检测PDCoV的TaqMan实时荧光定量RT-PCR方法,并对该方法进行特异性、定量线性范围、敏感性和重复性等试验。结果显示,该方法仅对PDCoV出现特异性扩增反应,与猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、A群猪轮状病毒、猪嵴病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、伪狂犬病病毒、猪瘟病毒及猪细小病毒均无交叉反应。该方法的标准曲线Ct值与2.2×10~9~2.2×10~1copies/L之间的质粒浓度具有良好的线性关系,标准曲线方程为Ct=-3.539×lg X+38.95,线性相关系数(R2)为1.0,检测下限为2.2 copies/L。对3个不同浓度(2.2×10~2、2.2×10~4、2.2×10~6copies/L)的pMD18-PDCoV-N进行2次重复检测,每个浓度重复试验的Ct值的变异系数均小于1.0%,表明该方法具有良好的重复性。应用建立的方法对64份广西临床腹泻样品进行检测,结果从其中18份样品中检出PDCo V,样品阳性率为28.1%,说明广西猪群存在PDCoV感染。结果表明,建立的TaqMan实时荧光定量RT-PCR方法为PDCoV的检测和定量分析提供了一种快速、敏感和特异的技术手段。     

登革病毒SYBR Green Ⅰ real-time PCR方法的建立及应用

为建立灵敏、高效的登革病毒检测方法,本试验拟以包含登革病毒3′端保守序列的质粒pUC57-DENV为模板,建立检测DENV的荧光定量PCR方法。结果显示,该检测方法在4.88×10~1～4.88×10~9copies/μL范围内呈良好的线性关系,相关系数为0.999,斜率为-3.653。最低检测限度为4.88 copies/μL,对照组未出现特异性扩增,所有稀释度的标准品在80.20℃出现特异性熔解峰。组内和组间试验的变异系数均小于1%。本试验建立的SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR方法,可为登革病毒早期检测提供技术支持。     

PCV2型和PCV3型双重荧光定量PCR检测方法的建立

为建立快速、特异地鉴别检测猪圆环病毒2型(PCV2)和猪圆环病毒3型(PCV3)的检测方法,本研究根据PCV2和PCV3保守区域基因序列,采用Primer Express 6设计了2对特异性的引物和2种不同荧光基团标记的TaqMan探针。经过引物筛选和条件优化,建立可鉴别检测PCV2和PCV3的双重荧光定量PCR方法。本方法能同时特异性地检测鉴别PCV2和PCV3,且与CSFV、PRV、ASFV、SVDV、FMDV、SVA病毒核酸没有交叉反应。本方法灵敏性强,PCV2和PCV3的最小检出量分别为48.1 copies/μL和58.3 copies/μL。组间和组内试验变异系数不超过1.5％,重复性好。结果表明,本研究创建了一种灵敏度高、特异性强的PCV2和PCV3双重荧光定量PCR方法。