孔雀石绿单克隆抗体的制备及其鉴定

用人工合成的无色孔雀石绿-兔血清白蛋白(LMG-RSA)作抗原免疫BALB/c小鼠,通过杂交瘤细胞融合技术筛选抗无色孔雀石绿的单抗,单抗经纯化后对其特异性和灵敏性进行了鉴定,探讨了建立孔雀石绿的免疫学检测方法。结果显示,经细胞融合和筛选得到了1株分泌抗无色孔雀石绿单克隆抗体的杂交瘤细胞5E9。经鉴定,该杂交瘤细胞的染色体数为98.82±5.6,间接ELISA检测小鼠腹水的抗体效价达1.3×105,该细胞连续培养10代以上,生物学性状稳定,间接竞争ELISA(ciELISA)结果显示,无色孔雀石绿50%抑制的质量浓度为18.5μg/L,除孔雀石绿外,与其他类似结构和相关类型的药物没有交叉反应,表明该单抗用于孔雀石绿的检测有较大的应用价值。     

乳牛孕酮人工抗原的制备与鉴定

采用二环己基碳化二亚胺偶联法将孕酮-11α-半琥珀酸酯(11-αOH-P4-HS)分别与牛血清白蛋白(BSA)、卵清白蛋白(OVA)载体偶联,制备乳牛孕酮人工抗原P4-BSA和P4-OVA,并用SDS-PAGE对制备的人工抗原进行测定。再用制备的人工免疫抗原P4-BSA免疫BALB/c小鼠制备免疫血清。用P4-OVA作为ELISA检测抗原,方阵滴定法确定检测抗原的最佳包被浓度,间接ELISA测定免疫血清中抗体的特异性及效价。结果表明,成功制备了乳牛孕酮人工抗原,P4-OVA的最佳包被浓度为5.82×10-5ng/mL,最佳封闭液为50 mL/L的羊血清,免疫血清具有良好的特异性。     

分泌抗赭曲霉素A单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立

用赭曲霉素A(OA)-BSA合成抗原免疫Balb/c小鼠,取免疫鼠脾细胞与sp2/0细胞融合。通过克隆和ELISA法筛选,建立三株分泌抗OA单克隆抗体杂交瘤细胞株(3C_(12)、1D_(12)和2G_7)。用间接ELISA法测定,细胞上清液抗体效价为128~χ(3C_(12))和64~χ(1D_(12)和2G_7),腹水抗体效价为10~(-7)(3C_(12)、1D_(12))和10~(-6)(2G_7)。三株单抗(McAb)'均属IgG类,分泌抗体稳定。用竞争间接ELISA测定三株McAb对OA的敏感性为22.5～39.2ng/ml,与异种毒素黄曲霉毒素B_1和ZEN毒素无交叉反应。     

氯霉素全抗原合成及多克隆抗体的制备

用重氮化方法将氯霉素与牛血清白蛋白 (BSA)和卵清蛋白 (OVA)偶联 ,制备免疫抗原和包被抗原 ,用ELISA方法进行鉴定。将偶联抗原用弗氏佐剂乳化后免疫德国大白兔 ,制备多克隆抗体 ,并用硫酸铵沉淀法初步纯化 ,用亲和层析法进一步纯化。用所得抗体建立竞争酶联免疫吸附分析法(ELISA)用于氯霉素检测 ,最低检查限为 0 .3ng/mL。     

克伦特罗单克隆抗体的制备与鉴定

将克伦特罗(Clenbuterol)重氮化后与牛血清白蛋白偶联,免疫BALB/c小鼠,用杂交瘤技术获得1株稳定分泌抗克伦特罗单克隆抗体的杂交瘤细胞株.该单克隆抗体为IgG1亚类,用间接ELISA测定细胞上清液抗体效价为11.6×106,腹水抗体效价为13.2×108.抗体与沙丁胺醇无交叉反应.该细胞株体外传代培养和冻存复苏后仍能稳定分泌抗体.     

鸭疫里默氏杆菌表面抗原D15截短蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

为制备抗鸭疫里默氏杆菌(RA)tD15蛋白的单克隆抗体并对其特性进行鉴定,应用纯化复性的重组tD15蛋白免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合,应用有限稀释法筛选出抗RA tD15重组蛋白的阳性杂交瘤细胞株;采用腹水诱生法制备单克隆抗体腹水,用饱和硫酸铵法纯化腹水抗体;采用间接ELISA筛选阳性杂交瘤细胞以及测定单克隆抗体的特性、效价及其相对亲和力。结果显示,获得2株抗RA tD15蛋白的阳性杂交瘤细胞株,遂被命名为4#、16#,2株细胞株经反复冻存复苏,体外传代仍能稳定分泌抗体;4#单克隆抗体属于IgG1,κ链;16#单克隆抗体属于IgG2b,κ链;4#杂交瘤细胞培养上清的效价为1∶3 200,腹水效价为1∶12 800,16#杂交瘤细胞培养上清的效价为1∶6 400,腹水效价为1∶204 800;2株单克隆抗体均能够识别大小约为34ku的蛋白,说明这2株单克隆抗体是特异性识别tD15蛋白的抗体;这2株单克隆抗体能够与鸭疫里默氏杆菌全菌裂解蛋白发生特异性反应,而不与其他鸭源的病原体发生反应;测得它们的亲和常数分别为1.52×109 L/mol和1.00×1010 L/mol。结果表明,这2株单克隆抗体可能识别两种不同的抗原表位。     

犬瘟热病毒H蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

为制备犬瘟热病毒(CDV)H蛋白单克隆抗体,采用蔗糖密度梯度离心法提纯CDV-Ondetstepoort株,利用RT-PCR方法扩增其H基因截短片段(H1、H2、H3),克隆至pET-28a (+)载体并转化至大肠杆菌Rosetta感受态细胞中进行原核表达,用Ni-NTA亲和层析柱纯化3种截短H蛋白;以纯化病毒为抗原免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,采用间接ELISA、间接免疫荧光法(IFA)和病毒中和试验分析杂交瘤细胞的生物学特性。结果表明,纯化的截短H蛋白表达正确,以此筛选到7株能稳定分泌犬瘟热病毒和重组H2蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株(3B1、3B5、3C5、3D5、5A6、4G12和7B2),抗体亚类鉴定均为Ig G1κ;IFA检测均为阳性,表明7种单克隆抗体特异性好;病毒中和试验测定其培养上清的抗体中和效价为24～28,诱生BALB/c小鼠腹水的抗体中和效价为1×102～1×106;间接ELISA叠加试验显示,3B5、4G12、5A6、7B2之间的叠加系数均在50%以上,表明这4种单克隆抗体识别不同抗原表位;另外,3B5、4G12、5A6、7B2还能中和当前流行的Asia 1型CDV毒株,具有较好的广谱中和活性。本研究为后续CDV感染的免疫治疗和CDV检测方法的建立提供了材料基础。     

猪传染性胃肠炎病毒N蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

以纯化的猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)重组N蛋白免疫BALB/c小鼠,按照常规方法融合、筛选,最终获得2株抗TGEV N蛋白的杂交瘤细胞系,分别命名为2G7和2C2。2株单抗亚类均为Ig G1,腹水的间接ELISA效价均为1∶108。2株杂交瘤细胞连续培养20代,各代次的上清效价保持不变,均为1∶12 800,说明2株细胞分泌抗体的能力稳定。通过间接免疫荧光发现,制备的2株单克隆抗体能与感染TGEV的细胞发生特异性反应,在胞浆和细胞膜上有亮绿色荧光。结果表明,所制备的2株TGEV N蛋白的特异性单克隆抗体细胞株遗传稳定,分泌的抗体敏感性高,为TGEV病原检测奠定了基础。     

鸡毒支原体丙酮酸脱氢酶E1β亚基单克隆抗体的制备和鉴定

为制备鸡毒支原体丙酮酸脱氢酶E1β亚基(PDHB)的单克隆抗体,将鸡毒支原体Rlow株的pdhb基因进行克隆和原核表达。表达产物纯化后作为免疫原,按常规方法免疫BALB/c小鼠。取免疫小鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,经过克隆和筛选,获得3株能稳定分泌抗鸡毒支原体PDHB抗体的杂交瘤细胞株,分别被命名为2D11、3B5和4D9。ELISA检测结果表明,3株杂交瘤细胞培养上清的抗体效价为1∶1 024~1∶2 048,小鼠腹水的抗体效价为1∶12 800~1∶25 600。单克隆抗体特异性试验显示,获得的腹水单克隆抗体均能与鸡毒支原体各菌株发生反应,而不与其他禽类病原发生反应。3株单克隆抗体的抗体亚型均为IgG1,轻链均为κ链。稳定性鉴定结果表明,获得的3株杂交瘤细胞均能稳定分泌单克隆抗体。鸡毒支原体PDHB单克隆抗体的成功制备,为研究丙酮酸脱氢酶的生物学功能和进一步建立检测方法奠定了基础。     

牛病毒性腹泻病毒单克隆抗体的制备及其应用

为制备牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)单克隆抗体(MAb)及其直接荧光标记抗体,本试验用纯化的牛病毒性腹泻病毒Ht01株免疫雌性BALB/c小鼠。间接ELISA测其血清效价,取抗体效价达标小鼠的脾细胞与SP2/0细胞融合。用间接ELISA筛选阳性细胞株并进行2次亚克隆后注射入小鼠腹腔制备单抗腹水。利用辛酸-硫酸铵沉淀法纯化腹水,用间接免疫荧光试验测定其活性,用SDS-PAGE试验测定其纯度。经活性、纯度检测合格后,采用搅拌法与异硫氰酸荧光素(FITC)偶联;用葡聚糖G-25 Medium介质进行分离纯化。结果,本研究共获得2株能够稳定分泌IgG1类型的阳性杂交瘤细胞株和一种直接荧光抗体,分别被命名为BMAb11、BMAb20、DB11。稳定性试验表明,杂交瘤细胞分泌的抗体稳定性好。ELISA、间接免疫荧光试验和直接免疫荧光试验表明,单克隆抗体和直标荧光抗体均与BVDV发生特异性反应,说明它们的特异性较好。经ELISA鉴定,腹水抗体效价达到1∶12 800。直接荧光抗体荧光素与蛋白的摩尔比(F/P)为3.34,标准值在2.0～4.0之间,符合标准。上述研究结果表明,本研究制备的单克隆抗体和直标荧光抗体可用于BVDV的检测,为BVDV的临床诊断奠定了基础。     

重组猪干扰素α的真核表达纯化及其单克隆抗体制备

为了获得猪源干扰素α(PoIFN-α)的单克隆抗体,本研究首先将PoIFN-α基因连接到pcDNA3.1真核表达载体从而构建rPoIFN-α质粒,通过真核表达系统（ExpiCHOTM）表达蛋白,并用亲和层析技术纯化后对重组蛋白进行鉴定;以重组蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠后进行细胞融合,用建立的间接ELISA方法筛选阳性杂交瘤细胞,亚克隆后通过制备腹水得到单克隆抗体,纯化制备的抗体并鉴定。结果显示,成功构建了rPoIFN-α质粒,通过ExpiCHOTM表达系统成功表达出正确大小的可溶性蛋白,分子质量为20 ku;通过间接ELISA筛选和5次亚克隆,得到1株能稳定分泌抗IFN-α蛋白的单克隆细胞株（3c6）,亚型鉴定为Ig G1亚型、Ig Gκ轻链;Western-blot结果显示,抗体可以特异识别IFN-α,抗体纯化后效价检测可达1∶256 000。上述结果表明,本试验制备的rPoIFN-α蛋白纯度高,单克隆抗体特异性强,可以在以后的研究中用于建立不同的IFN分子的检测方法,为研究猪病毒感染和免疫过程中不同细胞因子的应答情况提供便利。     

Asia1型口蹄疫病毒3B蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

为了获得Asia1型口蹄疫病毒非结构蛋白3B的单克隆抗体,以含Asia1型FMDV/JS/05毒株3B基因的pCAGGS-3B质粒为模板,扩增3B蛋白基因,并克隆至pET-30a(+)载体,进行原核表达及纯化。分别以Asia1型口蹄疫病毒、纯化的3B蛋白为抗原,免疫4~6周龄的雌性BALB/c小鼠,经过4次免疫后,取小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞按5∶1~10∶1进行细胞融合,用本实验室建立的间接ELISA对融合后的细胞进行筛选,并进行4次有限稀释筛选出的阳性细胞扩大培养后,注射小鼠腹腔,制备腹水。对制备的腹水进行类别鉴定、反应原性和效价鉴定。结果表明,获得1株能稳定分泌抗Asia1型口蹄疫病毒3B蛋白的细胞株,其抗体类别为IgM,腹水效价为1∶12 800,通过Western-blot和间接免疫荧光试验,确定其能识别口蹄疫病毒3B蛋白。     

抗O型口蹄疫病毒VP1蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

以高浓缩的O型口蹄疫病毒(FMDV)灭活疫苗为抗原免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与小鼠SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,以重组表达的O型重组VP1蛋白(O-r VP1)为筛选抗原,利用杂交瘤技术获得1株可稳定分泌抗O型FMDV VP1蛋白抗体的杂交瘤细胞株1C7,染色体数高于任一亲本细胞的染色体数目;腹水的抗体效价为1︰105,质量浓度为4.7 mg/m L。1C7单克隆抗体为IgG2b亚型,相对亲和力常数为1.5 mol/L,能够与O型FMDV特异性地结合,且仅与结构蛋白VP1反应。稳定性鉴定结果表明1C7株能稳定分泌抗体。阻断ELISA试验表明1C7单克隆抗体能够被O型FMDV免疫阳性血清特异性地阻断。本研究为进一步建立O型FMDV抗体的阻断ELISA及胶体金免疫层析快速检测方法奠定了基础。     

猪链球菌2型人源分离株MRP单克隆抗体的制备与鉴定

为建立一种针对猪链球菌2型(SS2)毒力因子的特异性检测方法,研制了抗SS2溶菌酶释放蛋白(MRP)单克隆抗体(McAb),并对其生物学活性进行了分析.将表达、纯化的SS2菌株MRP免疫BALB/c小鼠,采用淋巴细胞杂交瘤技术将免疫鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,以纯化的MRP蛋白作为包被抗原,通过间接ELISA方法筛选获得了6株能稳定分泌抗MRP McAb的杂交瘤细胞系288、3G5、1G1、3G9、186和2C3.经用间接ELISA方法测定,单抗腹水的抗体效价均超过1105,杂交瘤细胞培养上清液的效价为1128～11 024.western-blotting鉴定结果表明,6株单抗均具有特异的生物学活性;以2B8单抗腹水和SS2多克隆抗血清建立的夹心ELISA方法可特异地检测MRP.     

抗禽脑脊髓炎病毒单克隆抗体的制备及鉴定

利用提纯的禽脑脊髓炎病毒(AEV)VR株CEF适应毒制备抗原,免疫BALB/c小鼠,应用杂交瘤技术以间接ELISA筛选获得1株分泌抗AEV(VR)单克隆抗体的杂交瘤细胞.对制备的细胞上清及腹水进行单克隆抗体特性鉴定,经染色体计数、免疫球蛋白类及亚类测定、特异性试验、稳定性试验、SDS-PAGE电泳,表明该杂交瘤细胞染色体数目介于90-110条,该单克隆抗体亚类为IgG2a,分子质量为142 ku,ELISA测定细胞上清效价为11×104,腹水效价为11×106,与其它病原无交叉反应,抗体分泌稳定.     

停乳链球菌GapC的免疫特性分析及B细胞抗原表位的筛选与鉴定

旨在表达牛乳源停乳链球菌3-磷酸甘油醛脱氢酶（GapC）,预测并鉴定其B细胞抗原表位。本研究采用PCR扩增停乳链球菌GapC基因,构建重组质粒p ET-28a-TR-X16087-2。经IPTG诱导表达后纯化GapC蛋白,并以纯化的GapC蛋白免疫小鼠,采用ELISA方法检测Ig G抗体效价及抗体分型,分析对小鼠的免疫保护效力。结果显示,成功表达了大小为44 ku的GapC蛋白,对小鼠的免疫保护率为76%。预测并筛选出3个B细胞抗原表位,鉴定了1个优势抗原表位BP3:196PHRGGDLRRARAGAAN206。上述结果表明,本研究成功表达了停乳链球菌GapC蛋白,对其免疫效果进行了评估,预测与鉴定了其B细胞表位,为GapC蛋白功能和表位疫苗的研究奠定了基础。     

猪IFN-α1重组蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立及其生物学特性

应用杂交瘤细胞技术,将用猪IFN-α1重组蛋白免疫的小鼠脾细胞经与骨髓瘤细胞融合、筛选和多次克隆化培养,成功获得了3株能稳定分泌抗猪IFN-α1的单克隆杂交瘤细胞株,分别将其命名为4E9、5B2和5H11。这3株杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体经ELISA检测,体外细胞培养上清的效价均可达到1∶104,体内腹水的效价均可达1∶105;SDS-PAGE分析显示,纯化的这3株单克隆抗体的重链分子质量均在60ku以上,轻链均在30ku以上,符合抗体IgG重链、轻链分子的大小;抗体亚类鉴定表明4E9、5B2为IgG2a类,5H11株为IgG2b类,且其抗原结合位点基本一致。细胞染色体分析表明,3株杂交瘤细胞株染色体平均数为88～96条,远高于骨髓瘤细胞或脾细胞的染色体数,从遗传角度证实获得了杂交瘤细胞株;在杂交瘤细胞的稳定性试验中,这3株细胞经多次冻存复苏和传代培养,不同代次细胞上清中的抗体效价均在1∶104～1∶105之间,说明该3株杂交瘤细胞分泌单克隆抗体的性能稳定。     

沙丁胺醇单克隆抗体的制备及其鉴定

将沙丁胺醇 (salbutamol)琥珀酰化后 ,应用混合酸酐法与牛血清白蛋白偶联 ,免疫BALB/c小鼠 ,采用杂交瘤技术获得了 1株能稳定分泌抗沙丁胺醇单克隆抗体的杂交瘤细胞株。该单抗为IgG1亚类。经间接ELISA方法测定 ,其细胞上清抗体效价为 1∶3 .2× 10 6,腹水抗体效价为 1∶6.4× 10 8。该抗体与克仑特罗交叉反应率为 5 0 .0 0 % ,与莱克多巴胺交叉反应率为 0 .3 0 %。体外传代培养和冻存复苏后抗体分泌稳定。     

鸭肠炎病毒单克隆抗体的制备

采用差速离心和蔗糖密度梯度离心法提纯鸭肠炎病毒 (DEV)鸭胚成纤维细胞适应毒 ,免疫BALB/c小鼠 ,取脾细胞与SP2 / 0骨髓瘤细胞融合 ,经间接ELISA筛选 ,有限稀释法 3次克隆 ,获得了 2株稳定分泌DEV单克隆抗体的杂交瘤细胞株 1B6和 2G8。经鉴定 ,2株单克隆抗体分别为IgM和IgG1 亚类 ,腹水ELISA效价均达到 1∶1 0 7以上。以 2G8单抗腹水为材料 ,采用间接免疫荧光抗体技术对DEV标准毒感染的鸭胚成纤维细胞进行检测 ,结果表明 ,用该抗体可特异性检出接毒后 6h感染细胞中的DEV ,且感染后 4 8h免疫荧光强度最高 ,该单抗与细胞成分和鸭肝炎病毒无交叉反应。将杂交瘤细胞冻存 3和 6个月 ,复苏后仍能稳定分泌单克隆抗体     

牛型布氏杆菌苹果酸脱氢酶单克隆抗体的制备及鉴定

为制备牛型布氏杆菌(Brucella abortus)苹果酸脱氢酶(MDH)单克隆抗体,将牛型布氏杆菌A19菌株的MDH基因进行克隆和表达,表达产物被纯化后作为免疫原,按常规方法免疫BALB/c小鼠。取免疫鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,经亚克隆和间接ELISA筛选,最终获得3株分泌牛型布氏杆菌MDH蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞,分别被命名为C2、D5和F4。ELISA检测结果表明,3株杂交瘤细胞培养上清的抗体效价为1∶1 600～1∶3 200,小鼠腹水效价为1∶12 800～1∶25 600;Western-blot检测结果表明,3株单克隆抗体均能与牛型布氏杆菌MDH重组蛋白发生特异性反应。结果表明,本研究成功制备了牛型布氏杆菌MDH蛋白单克隆抗体,为基于MDH的布氏杆菌检测方法的建立奠定了基础。