口蹄疫病毒亚单位与宿主细胞凋亡的研究进展

通过对口蹄疫病毒和其他小RNA病毒的蛋白质功能研究进行总结,分析了口蹄疫病毒蛋白参与调控宿主细胞凋亡平衡的作用,并对口蹄疫病毒持续感染形成的机制进行了探讨.     

抑制宿主脂肪酸合成关键酶活性影响O型口蹄疫病毒的复制

为探究宿主脂肪酸合成对O型口蹄疫病毒（FMDV）复制的影响,以猪肾细胞PK-15和IBRS-2细胞为模型,监测脂肪酸合成的关键酶抑制剂对FMDV复制的调控作用;通过CCK-8试剂盒检测抑制剂对细胞的毒性作用,筛选合适的抑制剂预处理浓度;用Western-blot和实时荧光定量PCR(qPCR)方法检测添加外源C75和TOFA对FMDV复制的调控作用。结果显示,和对照组相比,添加脂肪酸合成的关键酶抑制剂C75和TOFA后,口蹄疫病毒蛋白水平和转录水平均显著下调。结论,抑制宿主细胞脂肪酸合成会降低FMDV在宿主细胞中的复制效率,这为进一步深入研究FMDV的致病机制开辟了新的方向。     

新城疫病毒通过巨胞饮作用入侵HeLa细胞的研究

新城疫病毒(NDV)在体外可以感染多种细胞,但是感染机制尚未完全明确。本试验针对NDV通过巨胞饮途径感染He La细胞的过程进行研究,选择特异性针对巨胞饮作用的药物抑制剂5-(N-乙基-N-异丙基)-阿米洛利(EIPA)、肌动蛋白(actin)聚合作用抑制剂细胞松弛素D(Cyto D)、PK C激酶抑制剂卡马拉素(Rottlerin)等,分别作用于He La细胞,通过W estern-blot和间接免疫荧光试验(IFA)分别检测NDV感染He La细胞的情况。结果显示,在病毒感染后第3、6小时,EIPA能显著抑制NDV的进入,并且存在药物剂量的依赖性,同时,Cyto D和Rottlerin在第3、6和12小时也能显著抑制NDV的进入。结果表明,巨胞饮作用可能是NDV侵入细胞的一种重要途径,该结果将有助于进一步解析NDV的感染方式。     

宿主细胞基因序列插入亚洲1型口蹄疫病毒导致病毒对牛的致病性减弱的研究

1株Asia 1型口蹄疫疫苗毒株在BHK21悬浮培养细胞中传代时与宿主BHK21细胞m RNA重组,导致VP1第206位与第207位氨基酸之间插入了VDLV序列,该插入突变使得疫苗免疫效果大幅下降,不能产生有效保护。比较发现,含12 nt插入序列的变异毒株(Vac-Asia1-VDLV)与亲本毒株(Asia 1/HN/06)在BHK21细胞上的生长曲线存在较大差异,变异毒株可感染CHO-K1,pgsA-745,pgsB-618,pgsD-677细胞,毒价可达到1×105PFU/mL以上,而亲本毒不能感染CHO类细胞并产生蚀斑。动物试验结果显示,乳鼠半数致死量(LD50)与亲本毒株相比变化不明显。但牛感染试验表明,大剂量(1×107LD50)接种牛舌面,Vac-Asia1-VDLV不引起体温反应和其它临床症状,荧光定量PCR检测鼻拭子和血液时未发现病毒,而Asia 1/HN/06引起典型的口蹄疫症状,鼻拭子和血液中检出病毒。上述试验结果表明,与亲本毒相比,变异毒株Vac-Asia 1-VDLV对牛的致病性明显降低。     

口蹄疫消毒试验——两种普通杀菌剂对口蹄疫病毒的消毒作用

(一)兰州面碱对O型口蹄疫病毒的消毒作用:根据前一试验报告,5％的兰州面碱在2℃作用2小时,对A型口蹄疫病毒无杀毒效力。为验证前一试验结果,我们重复了试验。用12％的兰州面碱溶液,与等量20％的O型口蹄疫牛舌皮毒(阿克苏牛源毒,于试验室用牛保存28代)悬液均匀混合(混合后,面碱即6％,pH9.6,病毒为10％),于2℃和26℃分别放置30～40、60、120分钟后,接种猪(体重15～20公斤,系A型鸡胚毒效力试验用过     

口蹄疫消毒试验——福尔马林烟雾剂对O型口蹄疫病毒的消毒作用

据文献报导,福尔马林对口蹄疫病毒具有良好的杀毒能力。我们在前一报告中报导了福尔马林溶液对A型口蹄疫病毒的消毒作用。本文介绍福尔马林烟雾剂对人工污染于羊皮样品上的O型口蹄疫病毒的消毒效力试验结果。     

树突状细胞对灭活口蹄疫病毒的泛素化作用

通过制备BALB/c小鼠单核细胞源树突状细胞(DC),构建了树突状细胞与灭活口蹄疫病毒(FMDV)的体外作用系统,考察树突状细胞对灭活FMDV的泛素化作用。收获荷载灭活FMDV后不同时间的树突状细胞,制备树突状细胞裂解液,用SDS-PAGE和Western-blot分析灭活FMDV抗原是否被泛素化。结果发现,在将灭活FMDV荷载于树突状细胞后的第0.5、3、6、10和20 h均可检测到分子质量约为75ku的FMDV蛋白,并且被FK2抗体标记的泛素化蛋白含量明显多于FK1抗体标记的泛素化蛋白含量。说明灭活FMDV被树突状细胞加工提呈的过程包括泛素化作用,并且泛素化蛋白主要在溶酶体内被降解。     

口蹄疫病毒受体猪源整联蛋白β6亚基配体结合域单克隆抗体的制备

以纯化的口蹄疫病毒受体猪源整联蛋白β6亚基配体结合域重组蛋白为抗原,免疫雌性BALB/c小鼠,经3次免疫后取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,制备口蹄疫病毒受体猪源整联蛋白β6亚基配体结合域单克隆抗体(McAb);采用有限稀释法和间接ELISA克隆和筛选阳性杂交瘤细胞株,并用SDS-PAGE、间接ELISA以及间接免疫荧光法对制备的McAb的特异性进行鉴定。结果显示,成功获得5株能稳定传代并分泌抗β6亚基配体结合域的杂交瘤细胞株,分别命名为C4C7、E7C7、B8C9、C2D8和B7B6,其分泌的McAb为IgG2b(C2D8)和IgG2a(C4C7、E7C7、B8C9、B7B6)亚类。制备的口蹄疫病毒受体猪源整联蛋白β6亚基配体结合域McAb可为深入研究整联蛋白αvβ6在口蹄疫病毒感染过程中的作用奠定基础。     

猪流行性腹泻病毒M蛋白亲和肽的筛选及其抗病毒作用

把成功构建的猪流行性腹泻病毒(PEDV)M蛋白的阳性重组质粒pET-32a(+)-M在大肠杆菌表达系统中进行诱导表达。以表达纯化的M蛋白作为靶蛋白,利用噬菌体展示技术对随机十二肽库进行筛选,4轮淘选后,挑选出了10个与PEDV及M蛋白特异性结合力高的噬菌体单克隆,序列测定后推导的氨基酸序列分别为AGWYCTEVLCV、AYCTRHVCYLDN,多肽被命名为M2、M9。就合成多肽体外抗病毒的效果而言,间接免疫荧光试验和实时荧光定量PCR试验证明,多肽M2、M9及多肽M2与M9联合使用均能够有效抑制病毒复制,且都呈剂量依赖性。其中多肽M2抑制病毒的作用比多肽M9的高,两种多肽联合抗病毒的作用最好。上述结果为进一步研究PEDV M蛋白功能性配体和研制防治PEDV的小分子治疗制剂提供了试验依据,奠定了理论基础。     

Netrin-1在伪狂犬病病毒触发的抗病毒天然免疫反应中作用的研究

为探究轴突导向生长因子Netrin-1在病毒感染中的功能,以猪伪狂犬病病毒感染MEF细胞为模型,通过荧光定量PCR检测Netrin-1基因mRNA在感染前后表达水平的变化,结果表明,伪狂犬病病毒刺激可以使得细胞下调Netrin-1 mRNA的表达水平。以小鼠Netrin-1基因保守序列设计1对特异性引物,成功将Netrin-1克隆入pcDNA3.1载体,在MEF细胞中瞬时转染重组质粒,并用伪狂犬病病毒感染细胞,针对炎症因子IL-6、干扰素IFN-β与干扰素刺激基因IFIT1和ISG15的mRNA进行qPCR验证,结果表明,Netrin-1对于干扰素与干扰素刺激基因的表达具有抑制作用。免疫印迹试验结果证明,过表达Netrin-1使得细胞核因子P65亚基表达下调。表明Netrin-1对免疫反应具有抑制作用,细胞在受到病毒感染时下调Netrin-1的表达以促进免疫反应。     

口蹄疫病毒非结构蛋白对豚鼠CD8~+T细胞应答的免疫增强作用

为了整体评价口蹄疫病毒非结构蛋白和前导蛋白对免疫应答的影响,选用反向遗传操作技术构建的与野生型毒株(Mya98/BY/2010)P1基因相同而非结构蛋白和前导蛋白不同的重组病毒(分别被命名为Re-Mya98/BY/2010)和Mya98/BY/2010)作为抗原,经BEI灭活后与4种佐剂乳化,制备不同的疫苗作为免疫原。然后免疫豚鼠,利用流式细胞仪检测免疫豚鼠CD4+T细胞和CD8+T细胞亚群的含量,ELISA方法检测免疫豚鼠血清中抗体应答。免疫后第28天进行攻毒试验。结果,抗原剂量相同的条件下,重组Re-Mya98/BY/2010疫苗比Mya98/BY/2010疫苗更能有效诱导CD8+亚群,每个时间点都含有较高的含量。ELISA结果显示,Mya98/BY/2010和Re-Mya98/BY/2010抗原都能诱导抗体应答,早期Re-Mya98/BY/2010诱导更高的抗体应答。豚鼠攻毒后,免疫Re-Mya98/BY/2010疫苗的保护率分别达到100%、83.33%、100%和50%,而免疫Mya98/BY/2010疫苗的保护率仅为20%、0、17%和25%,两者具有明显的统计学差异。结果表明,口蹄疫非结构蛋白在诱导免疫应答方面具有显著的诱导CD8+T淋巴细胞应答和提高免疫保护率的作用。