奶牛分枝杆菌的分离鉴定与耐药性分析

为优化分枝杆菌PCR诊断方法并监测牛分枝杆菌耐药性,本研究采用罗氏培养基自奶牛淋巴结和肺中分离分枝杆菌,优化本课题组建立的两级多重PCR方法用于分离菌株的分子诊断。一级PCR为两重PCR,靶标16SrRNA进行属和群的鉴定;二级PCR为七重PCR,根据结核分枝杆菌复合群(Mycobacte-rium tuberculosis complex,MTBC)成员染色体缺失区域的差异,设计了7对引物,依据群内不同种各自呈现特定的扩增谱型进行种的鉴定。对MTBC分离株,全菌水平用绝对浓度法对4种抗结核一线药物(RFP、INH、EMB、SM)进行药敏试验;分子水平用PCR扩增耐药基因rpoB、katG、inhA、embB、rrs,并测序分析。结果显示,本试验共分离出14株分枝杆菌,一级PCR鉴定均为分枝杆菌属成员,其中8株为MTBC成员。二级PCR中,这8株均呈现相同的扩增谱型,均为牛分枝杆菌谱型。药敏试验和耐药基因检测结果一致,8株牛分枝杆菌分离株对4种抗结核病一线药物全部敏感,基因序列分析未见突变。结果表明,本研究优化的两级多重PCR方法具有快速可靠和低成本的优势,是目前国内最新的分子诊断方法。     

禽分枝杆菌副结核亚种保护性抗原的研究进展

为了给副结核病新型疫苗研究中抗原的选择提供参考,综述了超氧化物歧化酶和巯基过氧化物酶等酶类、热休克蛋白、抗原85复合物及其他一些抗原在激发实验动物细胞和体液免疫中所发挥的作用,同时总结了在实际应用中可供借鉴的经验。     

鹦鹉副黏病毒的分离与鉴定

采集疑似自然感染新城疫病毒(NDV)的病死鹦鹉的肝、脾和胰腺,应用SPF鸡胚分离到1株病毒(YW-PMV),根据F基因片段测序结果,该病毒属于Ⅶh类,含有强毒株特征的蛋白酶识别序列RRRKRF,能凝集鸽红细胞,并能被新城疫阳性血清抑制,而不能被减蛋综合征(EDS)、禽流感H5、H7、H9血清抑制;电镜观察见到形态不规则、囊膜表面具有密集纤突的病毒粒子,直径100~200 nm。部分生物学特性表明,分离毒能致死鸡胚和番鸭胚,最小致死量和平均致死时间(MDT)分别为46.8 h和53 h;病毒接种鸡胚成纤维细胞和番鸭胚成纤维细胞均能引起细胞病变,并能被抗ND阳性血清中和;应用NDV荧光RT-PCR检测,该分离毒核酸为NDV阳性。上述结果初步表明该分离毒为鹦鹉副黏病毒强毒株。     

鹅副黏病毒的分离和鉴定

鹅副黏病毒病是由禽副黏病毒引起的一种急性高度接触性传染病 ,表现为发病急 ,传播快 ,发病率高 ,病死率高 ,在我国屡有发生 ,造成了一定的经济损失。我国学者已对该病做了详尽的研究 ,认为是由Ⅰ型禽副黏病毒即新城疫病毒引起的 ,基因型为Ⅶ型。 2 0 0 1年以来海南省发生了该病 ,笔者对此开展了流行病学调查 ,临床症状、解剖病变观察和病原分离鉴定。1　材料1.1　试验动物　 9～ 10日龄非免疫鸡胚 ,非免疫种鸡所产。 1日龄雏鸡 ,用非免疫鸡胚自行孵化。 6周龄小鸡 ,2 0日龄以上小鹅 ,严格隔离饲养 ,试验前测定新城疫HI效价为 1.0lb以下。 …     

牛布氏杆菌和副结核分枝杆菌双重PCR检测方法的建立

为快速检测牛布氏杆菌和副结核分枝杆菌,根据GenBank中的布氏杆菌OMP31基因序列(JF918757)及副结核分枝杆菌ISMav2基因序列(AF286339)设计、合成2对特异性引物,通过对PCR条件的优化,建立了快速鉴别检测牛布氏杆菌和副结核分枝杆菌的双重PCR方法。经对建立的方法进行特异性和敏感性试验,结果表明,分别扩增出602、246bp的特异性牛布氏杆菌和副结核分枝杆菌DNA目的条带,作为对照的双芽巴贝斯虫、大肠杆菌、沙门氏菌、弓形虫、链球菌、牛放线菌的DNA及其混合物均未扩增出任何条带。牛布氏杆菌与副结核分枝杆菌的最低检测限分别为1.92和2.51pg;牛肉样品中人工污染的牛布氏杆菌和副结核分枝杆菌的检测敏感性分别为6×104和7×104 CFU/mL。该双病原检测体系的成功建立为牛布氏杆菌病及副结核病的检测、鉴定和流行病学调查提供了有力的技术支持。     

浙江省副猪嗜血杆菌的分离鉴定与药敏试验

从浙江省5个县(区、市)疑似患有多发性浆膜炎和关节炎猪的98份病料中分离到26株细菌,通过细菌形态、培养特性和生化特性观察以及PCR鉴定最终确定为副猪嗜血杆菌。对26株已确定为副猪嗜血杆菌的分离株进行了血清学分型和药敏试验。结果显示,分离到的26株副猪嗜血杆菌分离株中,4型8株,5型6株,12型5株,13型2株,其余5株无法分型,并且副猪嗜血杆菌对头孢类药物、氟喹诺酮类药物及庆大霉素敏感,对复方磺胺类药物、大环内酯类抗生素及氯霉素敏感性略有不同,对四环素、氨苄青霉素具有耐药性。试验结果对浙江省猪场副猪嗜血杆菌病的防治提供了指导依据。     

结核分枝杆菌与牛分枝杆菌PCR快速鉴别检测方法的建立

根据结核分枝杆菌与牛分枝杆菌基因组的比对分析结果,针对结核分枝杆菌与牛分枝杆菌153bp、RD10和TbD1的3处差异缺失区域设计引物,分别建立了结核分枝杆菌与牛分枝杆菌PCR快速鉴别检测方法.应用建立的3种方法分别对84株结核分枝杆菌、3株牛分枝杆菌、51株非结核分枝杆菌及9种其他常见菌株进行了检测.结果显示,用针对153 bp缺失片段建立的PCR方法分别在结核分枝杆菌及牛分枝杆菌中扩增出645 bp及492 bp的目的条带;用针对RD10、TbD1建立的PCR方法分别在结核分枝杆菌及牛分枝杆菌中扩增出478 bp及361 bp的目的条带、358 bp及524 bp的目的条带.这3种PCR检测方法的准确率和特异性均为100%.敏感性试验结果显示,这些检测方法对结核分枝杆菌和牛分枝杆菌基因组DNA的检测极限均为10 pg.表明,此方法可用于牛源或人源结核分枝杆菌及牛分枝杆菌的快速鉴别检测.     

奶牛病毒性腹泻/粘膜病病毒的分离与鉴定

近年来,内蒙古包头地区奶牛中流行一种急性传染病,主要临床特征为体温升高,口腔、鼻腔粘膜溃烂,便血,胃肠粘膜出血、脱落,致死率极高。其中西滩奶牛场1990年11月至1991年4月共产犊牛94头,死亡93头。为此,我们采集病料,进行病毒分离鉴定,确诊为腹泻/粘膜病病毒(BVD/MD)感染所致。(一)材料 采取包头市合作奶牛场西滩分场2头新生犊牛发热期的血便、粘膜,无菌离心处理后作接种材料。     

昆明地区奶牛临床型乳房炎的病原分离与鉴定

近年来,昆明地区奶牛业发展很快,奶牛总头数达12000多头。可是多年来,乳房炎不断流行,发病率可高达80％。随着人民生活水平的提高,乳品质量也开始受到重视。因此,对奶牛乳房炎进行研究有很大意义,它不仅为乳房炎的防治提供了科学依据,也是乳品检验的重要内容。牛奶的微生物学质量对乳品业和消费者都有重要关系,在发达国家己列为质量和价格指标。1987年以来,本室由昆明第一农场、第三农场、海埂农场、官渡区职业中学农场和郊区奶牛专业户采取和送检93例临床乳房炎的306份乳样,进行了病原的分离和鉴定。结果报道如下。     

奶牛衣原体性流产的病原分离和鉴定

1989、1990年我们对西安市部分奶牛场所进行血清学调查,结果布氏杆菌病、牛白血病、牛蓝舌病均为阴性,而衣原体补体结合试验阳性率高达28.31％,在这些牛场中常有流产、犊牛关节炎、犊牛肠炎等病例发生。采集流产病料,接种鸡胚卵黄囊培养,分离出2株衣原体(CCS_(10)株和CCS_(15)株),未分离出相关致病菌。分离株接种鸡胚卵黄囊能致鸡胚规律死亡,剖检死亡鸡胚可见明显病变,卵黄囊膜涂片镜检能观察到大量原生小体。代表株CCS_(15)     

禽分枝杆菌副结核亚种map0862基因与map2154c基因的串联重组表达

以禽分枝杆菌副结核亚种参考株P18的基因组DNA为模板,扩增出了map0862基因和map2154c基因.采用重叠延伸剪接PCR技术(PCR-SOE)获得了融合基因map0862-2154c.将融合基因与原核表达载体pET32a( )连接,构建了重组质粒pET0862-2154c.将重组质粒转化到大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)中,以IPTG(终浓度1 mmol/L)诱导后对表达产物进行SDS-PAGE分析和Western-blot检测.结果表明.表达的重组蛋白map0862-2154c的分子质量为76 ku,可用于建立诊断副结核病的ELISA.     

杭州地区奶牛乳房炎病原菌分离鉴定与药敏试验

为了充分了解杭州地区奶牛乳房炎的病原,以便选用合适的抗菌药物,较好地控制奶牛隐性乳房炎,我们于1991年5～8月间,对杭州市郊五个奶牛场的部分奶牛的乳区奶样进行了病原微生物分离和鉴定,并对分离株进行了体外药敏试验。 (一)材料和方法 1.奶样采集:奶样取自杭州市牛奶公司第一牧场(A场)、第二牧场(B场)、杭江牛奶公司奶牛场(C场)、杭州市四季青乡常青奶牛场(D     

奶牛乳房炎乳汁细菌的分离和鉴定程序

引起奶牛乳房炎的微生物达数十种之多,其中包括细菌、真菌、霉形体、病毒等等。为了进行感染病原的检定,美国奶牛乳房炎委员会1981年;澳大利亚农业常委会家畜卫生委员会,都根据该国具体情况制定了“牛乳房炎微生物学或细菌学诊断程序”。我国至今尚未制定类似的统一程序,以致在一定程度上阻碍了奶牛乳房炎检菌工作的开展。     

结核分枝杆菌毒力相关因子的研究进展

结核病是威胁全球人类健康的重要人畜共患病。它的病原是结核分枝杆菌。由于结核病在治疗过程中发生了严重的耐药,对现有的抗结核药物提出了严峻的挑战。而结核分枝杆菌具有致病性是需要依赖多种基因的调控与表达,结核分枝杆菌的毒力相关因子在结核分枝杆菌的致病性上具有重要作用。结核分枝杆菌中主要与毒力相关的因子有早期分泌的一些蛋白、肽聚糖、分枝菌酸、细胞代谢相关因子和转录调节因子等。现在已经有越来越多的研究者对结核分枝杆菌的毒力因子感兴趣并对其进行了研究,期望从这些毒力因子中寻找新的药物靶标。     

结核分枝杆菌三价DNA疫苗的体液免疫与细胞免疫应答

为研究结核分枝杆菌Ag85B、MPT64和MPT83抗原DNA疫苗在奶牛体内诱导的免疫应答,以PJW4303为载体,构建了上述3种抗原基因的三价DNA疫苗。采用阴离子交换色谱方法提取3种质粒,混合后添加佐剂DDA免疫3月龄荷斯坦奶牛3次,采用ELISA法检测免疫奶牛的特异性抗体效价。利用双抗夹心ELISA定量测定免疫奶牛各月的IFN-γ浓度。结果显示,纯化后的DNA疫苗经质量检验达到动物免疫试验的要求;免疫前奶牛体内特异性抗体为阴性;三免后第30天MPT83、Ag85B和MPT64特异性抗体效价达到最高,均值分别为1∶3 200、1∶2 560和1∶2 880;同时免疫奶牛MPT83、Ag85B、MPT64三种蛋白诱导产生的IFN-γ在三免后第30天达到最高,分别为(630.25±94.45)、(341.65±76.75)、(51.38±9.80)pg/mL,阴性对照组PBS的IFN-γ浓度为(6.48±20.88)pg/mL。每个月的阴性对照与3种抗原相比,差异均极显著(P<0.01)。证实该三价核酸疫苗能同时诱导机体产生细胞免疫应答和体液免疫应答,可能有利于增强疫苗对结核病的抗性。     

猪链球菌的分离与鉴定

猪链球菌病是由多种不同群的链球菌引起的不同临诊类型传染病的总称。目前许多国家和地区都有猪链球菌病的报道 ,其中以E群链球菌引起的淋巴结脓肿最常见 ,以C群链球菌引起的败血症危害最严重。国内报道的动物链球菌病以L群兽疫链球菌为主 ,其次为D群和E群。近年来 ,猪链球菌病的流行呈明显上升趋势 ,2 0 0 2年 3月 ,安徽省某猪场发生一起以败血症、脑膜炎为特征的急性传染病 ,死亡率较高。笔者从该猪场采集病料 ,分离到 1株细菌 ,通过生化试验、动物接种试验等鉴定 ,证明分离菌为链球菌。1　临床症状病猪精神不振 ,食欲减少或废绝 ,体温 …     

深圳地区奶牛临床型乳房炎病原菌分离鉴定与药敏试验

乳房炎是奶牛最常见的疾病之一,本病既可引起奶牛产奶量下降,又影响奶品质量,造成很大经济损失。西方一些国家对此病研究了１００多年,但仍未从根本上解决问题。我国对此病研究起步较晚,但进展很快,有不少单位做过细菌鉴定工作,有些科研单位也进行了疫苗和综合防治措施的研究。但由于引起乳房炎的病原微生物种类繁多,各种微生物的感染也因地区、牛群和时间的不同而异。本试验通过对临床型乳房炎病原菌的分离与鉴定,了解了深圳地区奶牛临床型乳房炎的病原种类及主要病原菌的区系状况;并通过药物敏感性试验,指导临床科学用药,以达…     

北京及周边地区乳牛乳腺炎的调查与病原菌分离鉴定

为了解乳牛乳腺炎的发病原因,对北京及其周边地区4个奶牛场的乳牛乳腺炎的发病情况进行了临床调查、诊断和检测,采集患临床型乳腺炎和隐性乳腺炎乳牛的乳样;用接种法对采集乳样进行培养,对可疑菌落进行分离、接种、染色、镜检鉴定.结果显示,从采集的266份乳样中分离到7种434株病原菌,其中葡萄球菌150株,链球菌204株,革兰阴性杆菌80株.证实,北京及其周边地区乳牛乳腺炎的主要病原菌为葡萄球菌和链球菌,且细菌混合感染引起的乳牛乳腺炎有上升趋势.     

产后奶牛子宫黏液中微生物的分离鉴定及与黏液性状的关系

选择产后荷斯坦奶牛18头,以产后第21天的黏液性状评分和中性粒细胞计数为基础,将其分为健康组9头,亚临床子宫内膜炎组3头和临床子宫内膜炎组6头。通过对黏液中细菌的分离培养和测序,检测产后奶牛不同时间、不同子宫状态下子宫黏液中细菌的种类和数量,并分析了细菌种类、数量与产后时间及黏液性状的关系。试验表明,在健康组和患病组奶牛子宫内共分离到407株纯菌,经测序后发现其分别属于变形菌门、厚壁菌门、放线菌门的25种细菌,其中大肠杆菌、芽胞杆菌、葡萄球菌和希瓦菌的分离率较高,分别为44.14%、19.31%、6.21%和4.83%;蜡样芽胞杆菌、苏云金芽胞杆菌等只出现在健康牛子宫,克雷伯菌、不动杆菌、志贺菌、肾棒状杆菌、绵羊创伤球菌只出现在患子宫内膜炎的奶牛子宫。黏稠且不透明黏液中的分离菌数为98株,显著多于分离菌为37株的半透明、白色脓性黏液及分离菌为10株的透明、偶带白丝的黏液;其中产后第35天菌株分离数量和黏稠黏液数量最多,在黏稠型黏液中共分离出41株纯菌,占细菌分离总数的74.56%,绵羊创伤球菌、志贺菌、表皮葡萄球菌、不动杆菌等只从黏稠型黏液中分离到;产后第49~56天,细菌分离数量及黏稠型黏液数量较产后第35天逐渐减少。结果表明,大肠杆菌是感染产后奶牛子宫的主要微生物,奶牛产后子宫感染细菌数量越多黏液脓性越高,并且奶牛产生子宫内膜炎及脓性黏液可能与不动杆菌、绵羊创伤球菌、志贺菌等病原菌感染有关。     

结核分枝杆菌和牛分枝杆菌二重实时荧光PCR检测方法的建立

根据结核分枝杆菌23SrRNA基因序列和牛分枝杆菌特殊基因序列,设计了2对针对结核分枝杆菌和牛分枝杆菌的特异性引物和2条用不同荧光基团标记的TaqMan探针,建立了结核分枝杆菌和牛分枝杆菌的二重实时荧光定量PCR检测方法,并对建立的方法进行敏感性、特异性测定和临床样品检验。结果显示,该方法特异性好,能区分不同模板浓度组合的结核分枝杆菌和牛分枝杆菌;可检测到10copies模板的结核分枝杆菌和牛分枝杆菌;对保存的50份PPD检测阳性牛的鼻黏液、牛乳和淋巴结进行检测,结果6份结核分枝杆菌阳性,1份牛分枝杆菌阳性,其余均为阴性,与PCR的检测结果一致。由此可见,建立的二重实时荧光定量PCR方法具有特异、敏感、快速、可定量检测等优点,适合用于结核分枝杆菌和牛分枝杆菌的鉴别检测。