牛源大肠杆菌CTX-M型基因耐药性与流行性分析

为了解不同养殖模式下牛源大肠杆菌对抗菌药物的耐药性及CTX-M型基因流行分布特征,本研究从甘肃和新疆采集肉牛、奶牛和牦牛粪便样品,经分离鉴定得到220株大肠杆菌,采用纸片扩散法(K-B法)对分离株进行药物敏感性测定,通过PCR法检测CTX-M型基因和整合子基因型,利用多重PCR法对CTX-M阳性菌株进行种族进化关系分析...     

野生动物捻转血矛线虫的分子鉴定及PCR检测方法的建立

为了对野生动物捻转血矛线虫进行分子鉴定并建立特异性PCR检测方法,基于ITS序列,对草食类野生动物粪便中毛圆线虫虫卵及幼虫DNA进行分子鉴定,并比较粪便和虫体样品的PCR扩增效果;基于ITS1序列建立了特异性PCR检测方法,并对20份临床粪样进行了检测。结果显示,2种草食动物(长颈鹿、弯角剑羚)粪便和虫体样品均扩增出ITS1和ITS2片段,且虫体DNA比虫卵DNA的扩增效果更好;经系统发育分析和BLAST比对,该毛圆线虫分离株属于毛圆科血矛属,与基因库中多株捻转血矛线虫ITS1和ITS2序列的相似性为98%~99%。结果表明,基于ITS1序列建立的PCR检测方法具有良好的特异性和敏感性,与幼虫鉴定法的符合率为95%,高于粪便虫卵检查法(70%),具有一定的临床应用价值。     

小附红细胞体的分离鉴定及其对猪的人工感染试验

采用2对附红细胞体种特异性引物,对上海地区2个屠宰场采集的736份猪血液基因组DNA进行PCR检测,将小附红细胞体特异性引物扩增产物克隆到pMD18-T载体,进行序列测定和生物信息学分析。将小附红细胞体阳性血液分离物肌肉注射给5头切除脾的断奶广西巴马小型猪仔猪,感染后定期采血,进行显微镜检,并提取基因组DNA进行PCR检测。另设3头猪作为不感染对照组,进行相同的检测。结果显示,共有101份样品检测出附红细胞体阳性,阳性率为13.72%,其中54份为小附红细胞体单独感染,占7.34%。5头巴马小型猪在接种小附红细胞体后第13~16天起,至第34天试验结束,出现明显的临床症状;血液显微镜检和PCR检测均发现存在小附红细胞体感染;其序列测定显示,16SrRNA基因的部分序列与接种的小附红细胞体的相应序列完全一致。上述结果表明,本研究成功筛选出小附红细胞体阳性血液,并成功实现了小附红细胞体对巴马小型猪的人工感染试验。     

禽白血病病毒J亚群和网状内皮组织增殖病毒共感染的产蛋种鸡的病理学研究及其疫源追溯

为查明禽白血病病毒J亚群(ALV-J)和网状内皮组织增殖病病毒(REV)共感染临床鸡群的原因,对河北省某鸡场患病的产蛋种鸡进行组织病理学检查、病毒分离和可疑病原的间接免疫荧光检测、PCR和ELISA检测,同时对该鸡群所用疫苗中可疑病毒进行病原分离和PCR鉴定。结果,组织病理学检查发现,发病鸡的肝脏、腺胃、肾脏均出现灶状淋巴细胞增殖;用发病鸡肝脏浸液接种DF1细胞后,分别用特异性单抗进行间接免疫荧光检测发现培养物中ALV-J抗原和REV抗原均呈阳性。用ALV-J特异性引物对病鸡肝组织样品进行PCR检测时部分结果呈阳性,产物大小为924 bp;用REV特异性引物对病鸡肝组织样品进行PCR检测时部分结果也呈阳性,产物大小为438 bp。经PCR检测的17份活毒疫苗DNA中,2份为REV核酸阳性,5份为ALV-J核酸阳性,其中有1份疫苗样品呈双阳性,并且PCR阳性产物的序列分别与从蛋鸡体内分离的病毒毒株相一致。系统进化分析表明,分离的疑似REV毒株与中国其他地方分离的REV毒株的同源性高于与REV HA株的同源性,而本研究中分离的ALV-J毒株与ALV-J原型株HPRS-103的亲缘关系最近。以上结果表明,疫苗污染ALV-J和REV与田间ALV-J与REV的高感染率存在着因果关系。     

鹦鹉博尔纳病毒4型SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立

为建立鹦鹉博尔纳病毒4型SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法,通过扩增病毒M基因并与pMD19-T载体连接,构建重组质粒作为标准品,根据M基因序列设计特异性定量引物,进行了荧光定量PCR的敏感性、特异性、重复性试验。结果显示,荧光定量PCR比普通PCR检测灵敏度高100倍,可检出最低拷贝数为6.7×10~2 copies,μL的标准品,而普通PCR只能检测到最低拷贝数为6.7×10~4 copiesμL的标准品;用荧光定量PCR方法检测H5N6、H7N9、H9N2 AIV,NDV,IBV时均未见扩增;批内及批间重复变异系数均小于1%;对8只鹦鹉脑组织样品进行检测,荧光定量PCR检出阳性样品6份,普通PCR检出阳性样品4份,检出率两者相差25%。采用本方法对64份临床采集的鹦鹉粪便样本进行检测,结果筛选出阳性样品1份。以上结果表明,本研究建立的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法具有良好的灵敏性、特异性和重复性,可用于鹦鹉博尔纳病毒4型的检测。     

四川省美姑县羊蓝舌病病原分离鉴定

对采自四川省美姑县的疑似蓝舌病绵羊、山羊血清14份,全血13份,进行蓝舌病抗原、抗体检测和病毒分离鉴定.结果在10份血清样品中检测到蓝舌病抗体,在13份全血样品中分离到2株病毒,经蓝舌病病毒群、血清型鉴定,分离毒株的血清型为BTV-1型.     

乳牛布鲁氏菌病PCR诊断试剂盒的实验室评估

对前期研制的布鲁氏菌omp25基因-PCR试剂盒的保存期、特异性和可重复性进行了测定,并应用该试剂盒对采自宁夏、甘肃、内蒙古、山西、黑龙江、新疆省(区)的98头血清凝集试验(SAT)阳性乳牛的6批98份乳样和350头SAT阴性乳牛的2批350份乳样进行了检测。检测结果显示,PCR试剂盒与SAT的阳性符合率为100%(98/98),阴性符合率为97.71%(342/350);从SAT阴性乳牛的乳样中,用PCR试剂盒检出8份阳性,表明其敏感性高于SAT;对2株田间野毒Br-gs和Br-nmg株进行了克隆与测序,二者与标准菌株序列的同源性分别为99.8%和100%。试验结果证实,本试剂盒的可重复性良好,特异性较高,-20℃下的有效保存期为5个月。     

福建猫源弓形虫IgG抗体检测及PCR-RFLP基因分型与遗传变异分析

采用酶联免疫吸附(ELISA)试验对福建某花鸟市场采集的40份猫血液样本进行弓形虫IgG抗体检测,对抗体呈现阳性的血液样品进行弓形虫B1基因PCR扩增;对扩增结果呈现阳性的样本采用多位点巢式PCR-RFLP技术,在SAG1、5’SAG2、3’SAG2、Alt.SAG2、SAG3、BTUB、GRA6、c22-8、c29-2、L358、PK1和Api co共12个位点进行弓形虫基因分型研究和部分位点的遗传变异分析。结果表明,40份血清中,19份血清呈弓形虫IgG抗体阳性,阳性率为47.5%,19份血清抗体呈阳性的血液样品中,B1基因PCR扩增出3份阳性样品,进一步多位点巢式PCR-RFLP分析和遗传变异分析发现,PCR阳性样品中的弓形虫基因型均表现为New Genotype型。     

副溶血性弧菌LUXTM荧光PCR快速检测方法的建立

根据LUXTM荧光PCR技术原理,针对副溶血性弧菌toxR基因的保守序列,设计了特异的LUXTM荧光标记引物,通过优化反应条件与参数,建立了可快速检测副溶血性弧菌的LUXTM荧光PCR方法。结果显示,该方法高度敏感,对纯菌的检测低限达到每个反应体系7个菌(CFU),经6 h增菌培养后检测,对样品的检测低限(CFU)达到100/25 g;特异性强,对副溶血性弧菌2株标准菌株和10株参考菌株的检验均呈阳性,而对霍乱弧菌等28株非目标菌的检测均呈阴性;重复性好,定量检测的批内和批间变异系数均小于1%。应用此方法检测水产样品103份,检出阳性样品6份,与TaqMan荧光PCR和SN标准的检测结果完全一致。用此方法可在8 h内完成对样品中副溶血性弧菌的检测,其检测的快速性、敏感性和特异性与TaqMan荧光PCR技术相当,但检测成本更低。     

猪流行性腹泻病毒流行毒株的分离与鉴定

2016年3月江苏某猪场发生了哺乳仔猪腹泻疫情,导致大部分哺乳仔猪严重腹泻和死亡。为确定此次腹泻的病原,从该猪场采集了6份仔猪腹泻样品,利用RT-PCR方法对可引起仔猪腹泻的猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪轮状病毒(PoRV)三种主要腹泻病毒进行了检测。结果显示,6份样品均呈现PEDV阳性,而TGEV和PoRV为阴性。无菌处理6份阳性样品后分别接种于Vero细胞,进行病毒分离培养;结果,6份样品中仅JSqd3/2016接种后可产生明显细胞病变,且连续传至第5代时细胞病变仍稳定存在。对JSqd3/2016分离株利用针对PEDV S蛋白的特异单抗进行间接免疫荧光鉴定结果显示,PEDV S蛋白单抗能够特异性识别JSqd3/2016分离株感染的Vero细胞。对JSqd3/2016-F5分离株S基因和ORF3基因进行克隆测序和序列比较分析结果显示,分离获得的JSqd3/2016毒株与目前的流行毒株亲缘关系较近,与经典毒株相比S基因存在较大变异,氨基酸同源性为93.0%~93.3%。本研究结果证实,PEDV变异毒株感染是该猪场仔猪腹泻疫情的主要病因。     

猪圆环病毒3型的分离与鉴定

为分离获得猪圆环病毒3型(PCV3),对疑似PCV感染死亡的仔猪病料进行PCR检测,将检测呈PCV3阳性的样品利用PK-15细胞进行病毒分离,同时利用原核表达的Cap蛋白制备多克隆抗体,通过IFA、免疫电镜和序列测定分析对分离株进行鉴定。结果显示,分离获得1株PCV3流行毒株,IFA检测有特异性荧光;电镜下可见圆形、直径约为20 nm的病毒粒子;与PCV1、PCV2的同源性分别为22.2%、22.1%,属于3a亚型,将其命名为LJ0603株。LJ0603株繁殖至第72小时病毒含量最高,且能稳定传代至第13代。PCV3 LJ0603株的获得为其结构功能和致病机制及免疫预防等研究奠定了基础。     

检测987p+肠毒素性大肠埃希氏菌PCR方法的建立

以 98 7p菌毛结构基因保守序列为靶序列 ,设计合成了 1对可扩增 45 9bp目的片段的引物 ,建立了检测肠毒素性大肠埃希氏菌 987p菌毛基因的PCR方法。该方法对K 88 ( 为菌毛阳性 )、K 99 、F 41 参考菌株和链球菌、葡萄球菌、巴氏杆菌的检测结果均为阴性 ;该方法的敏感度可达 10 2 CFU ,对 2 0株腹泻仔猪粪便分离物进行检测 ,有 1株为阳性 ,与血清学检测的结果一致。结果表明 ,此方法特异性和敏感性都很高 ,可用于临床 987p肠毒素性大肠埃希氏菌病的快速诊断和流行病学调查     

东北地区野生鸟类B亚群禽白血病的分子流行病学调查及env基因的序列分析

为掌握我国东北地区野生鸟类感染禽白血病病毒(ALV)的情况,从黑龙江、吉林和辽宁三省采集了300份野生鸟类样品,经PCR检测,4份野生鸟类样品为ALV-B阳性,并扩增了这4份样品的env基因,对其序列进行了遗传进化分析。结果显示,4份ALV-B阳性样品的env基因与原型毒株RAV-2的同源性为99.1%～99.4%,与美国的另外2株代表毒株Schmidt-Ruppin B和Prague subgroup B的同源性为93.3%～98.4%,而与2株中国蛋鸡分离株SDAU09C2和SDAU09E3的同源性为90.2%～90.6%。以上结果表明,目前我国野生鸟类已经存在禽白血病。env基因序列分析结果表明,这4份阳性样品的env基因部分位点发生了变异,并且在多处位点存在突变。     

通用型牛病毒性腹泻病毒RT-PCR检测方法的建立及初步应用

牛病毒性腹泻病毒(BVDV)是牛的主要病原之一,对全球养牛业造成了巨大的经济损失。本文根据GenBank中BVDV基因组中5′-UTR序列合成引物,建立了同时检测BVDV两个基因型的RT-PCR方法。结果显示,所建方法具有较强特异性和敏感性,可扩增出长约300 bp的特异性片段,最低检测限量为6.8×10~3copies/μL。用该方法对30份临床样品进行病原检测,结果显示,BVDV阳性样品4份,阳性率为13.33%。对阳性PCR产物测序及序列分析的结果表明,该牛病毒性腹泻病毒流行株属于BVDV-2型。3份阳性样品SD3、NM26、NM29与国内流行株新疆XJ-04亲源关系最近,相似度达96.9%。本研究建立的通用型牛病毒性腹泻病毒RT-PCR方法特异性强、灵敏度高,可用于临床上牛病毒性腹泻病毒的检测。     

乙型脑炎病毒XJ/08/01株的分离鉴定及PrM/E基因的遗传进化分析

从新疆维吾尔自治区石河子地区某猪场采集了150份猪脑组织样品,利用RT-PCR方法进行流行性乙型脑炎病毒(JEV)NS1基因扩增,结果有32份组织样品扩增出了430 bp的特异性目的条带.用检测的阳性样品研磨液接种乳鼠进行JEV的分离,经3次乳鼠传代后获得了1株JEV,命名为XJ/08/01.在此基础上,设计引物从接毒乳鼠脑组织样品中扩增JEV的主要抗原基因PrM/E并进行序列分析,结果表明,该分离毒株与JEV疫苗株SA14-14-2的同源性为99.6%,根据基因分型法确定该分离株属于基因Ⅲ型JEV.     

三种致奶牛流产病原多重巢式PCR检测方法的建立

为同步检测引起奶牛流产的新孢子虫、布氏杆菌和弓形虫这三种常见病原,本研究分别设计针对新孢子虫ITS1基因(Nc-ITS1)、布氏杆菌16S rRNA基因(Ba-16S rRNA)及弓形虫529 bp重复序列基因(Tg-529 bp)的特异性巢式PCR引物,建立并优化了能够同时检测这三种病原的多重巢式PCR方法。结果显示,多重巢式PCR对Nc-ITS1、Ba-16S rRNA及Tg-529 bp扩增产物的大小分别为601 bp、380 bp、245 bp。外引物退火温度为57℃,内引物为53℃;Taq酶、dNTP和Mg2+浓度分别为1.0 U、2.0 mmol/L和1.0 mmol/L;Nc-ITS1和Tg-529 bp外、内引物浓度均为0.4 m ol/L,Ba-16S rRNA为0.2 mol/L。该多重巢式PCR对Nc-ITS1和Ba-16S rRNA检测敏感性达3×102 copies/L,对Tg-529 bp达3×101 copies/L,对住肉孢子虫、大肠杆菌、沙门菌、李氏杆菌、金黄色葡萄球菌和链球菌扩增均无目的条带,表明该多重巢式PCR方法具有良好的敏感性和特异性。利用该方法对86份临床样品进行检测,结果显示新孢子虫阳性样品26份,布氏杆菌阳性样品2份,弓形虫阳性样品1份,其中新孢子虫和布氏杆菌均为阳性的样品1份,与单巢式PCR检测结果一致。结果表明,建立的多重巢式PCR方法可以用来对致奶牛流产的新孢子虫、布氏杆菌和弓形虫这三种常见病原进行快速、准确地检测。     

蓝舌病毒14型的分离与鉴定

为了解我国新疆地区羊蓝舌病的流行情况,对某羊场疑似发生蓝舌病的羊病料进行了采集,并进行病毒分离和鉴定。应用间接ELISA试剂盒检测血清抗体,抗凝血样品接种敏感的BHK21细胞进行连续盲传,对细胞病变呈阳性的样品进行间接免疫荧光鉴定,同时针对VP7片段和VP2片段设计引物进行RT-PCR检测鉴定,并对其L2基因进行系统发育树分析。结果显示,血清中BTV抗体检测均为阳性,接种BHK21细胞后均产生了特异性细胞病变,并与FITC标记的抗BTV单抗特异性结合,针对VP7扩增出1 156 bp片段,针对VP2分别扩增出850 bp和1 581 bp片段,经测序和序列分析确定为BTV-14型。结果表明,我国新疆地区存在蓝舌病毒14型,这也是我国境内首次分离到蓝舌病毒14型,为进一步防控我国蓝舌病疫情提供了科学依据。     

广西鸡毒霉形体的分离与鉴定

从广西不同地区采集疑似鸡毒霉形体 (MG)感染的 46份病鸡病料中分离到 7个菌株 ,经分离培养、L形细菌检验、理化特性鉴定、血清学定型、人工感染试验以及PCR扩增检测等方法鉴定 ,确定 7个分离株为MG。     

西宁市猪圆环病毒2型感染的流行病学调查

用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测了西宁市8个规模养殖场和部分散养户的161份猪血清样品的猪圆环病毒2型(PCV2)抗体。结果显示,所有被检猪场均有PCV2抗体阳性猪存在,161份血清样品中PCV2抗体阳性率为86.95%。从上述样品中随机抽取28份样品,用PCR方法检测了PCV2 ORF1基因;结果,从13份血清中扩增到了特异性PCV2 ORF1基因,阳性率为46.42%。证实,西宁市猪场和散养猪群中存在PCV2感染。     

牛结节性皮肤病病毒TaqMan-MGB荧光PCR检测方法的建立

为建立快速、特异鉴别检测牛结节性皮肤病病毒(LSDV)的方法,本研究参照GenBank中发表的LSDV全基因组序列,设计并合成一对特异性引物和探针,经优化条件,建立了可鉴别LSDV的TaqMan-MGB荧光定量PCR检测方法。结果显示,该方法可特异性检测LSDV,而与山羊痘病毒、绵羊痘病毒、牛痘病毒和猪痘病毒均无交叉反应;标准曲线在各浓度范围内呈现良好的线性关系,该方法建立的标准曲线方程为y=-3.141x+32.10,线性相关系数为0.999,扩增效率达到108%,最低检出下限为1.48 copies/L;组内、组间重复性试验的变异系数均小于2%。采用此方法对52份模拟临床样品和112份临床样本的检测结果显示:32份模拟阳性样品检出LSDV核酸阳性,20份模拟阴性样品未检出LSDV;而用OIE推荐的普通PCR方法仅检出28份模拟阳性样品的LSDV核酸阳性,24份模拟样品的LSDV核酸阴性(其中20份为模拟阴性样品,4份为模拟阳性样品);两种方法均未从112份临床样品中检出LSDV核酸阳性。上述结果表明,荧光PCR的敏感性明显优于普通PCR,能够快速准确地检测LSDV,适用于临床样品的检测,为外来疫病防控提供了技术支撑。