山羊支原体山羊肺炎亚种特异性分子检测靶标的鉴定和应用

本文旨在筛选出新的山羊支原体山羊肺炎亚种（Mycoplasma capricolum subsp. capripneumoniae, Mccp）特异性分子诊断靶标。首先通过全基因组本地BLASTp方法筛选得到Mccp理论上特异的蛋白基因序列,经BLASTn验证、优选特异性基因92.1作为候选靶标,设计引物92.1F/R,采用普通PCR体系检测4株Mccp（1801、1601、1309F、Zly-14）和7种其他支原体基因组DNA,包括无乳支原体（Ma）PG2、丝状支原体山羊亚种（Mmc）PG3、Mmc YG（前称丝状支原体丝状亚种大菌落型,MmmLC）、绵羊肺炎支原体（Mo）Y98、山羊支原体山羊亚种（Mcc）Ckid、牛支原体（Mb）08M、李奇氏支原体（Ml）PG50,并检测Mccp、Mo、Mmc人工感染羊试验样本DNA,评估该体系的特异性。结果表明92.1F/R引物只能从Mccp菌株及其感染试验样本中扩增出509 bp目的条带,证实该引物可用于检测Mccp,92.1序列可作为CCPP新的核酸诊断靶标,为CCPP诊断和实验室研究提供了一种新的分子标记。     

绵羊肺炎支原体特异性分子检测靶标的筛选与应用

本文旨在筛选出特异性的绵羊肺炎支原体(Mycoplasmna ovipneumoniae)分子检测靶标,利用全基因组BLASTn筛选出绵羊肺炎支原体特异性蛋白基因序列,再运用NCBI线上Primer BLAST程序,选择G/C含量较高的4个靶基因设计11对引物,通过引物筛选和反应条件的优化,成功筛选到一对针对靶标728...     

山羊支原体山羊肺炎亚种TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法的建立和应用

为了快速诊断和定量检测山羊支原体山羊肺炎亚种(Mycoplasma capricolumsubsp.capripneumoniae,Mccp),选择Mccp arc D基因为靶序列,设计特异性引物和探针,建立并优化反应体系,以Mccp和其他支原体及细菌等16种病原体基因组DNA为模板,进行普通PCR和TaqMan探针实时荧光定量PCR特异性检测,并对该方法的敏感性和重复性进行评估。同时利用该方法对68份山羊临床样本进行检测。结果显示,仅Mccp有扩增条带(185 bp)和明显的荧光扩增信号(Ct值为21.93),其余供试菌株没有扩增条带,且表现出微弱的荧光扩增信号(Ct值均大于31)。普通PCR检测的灵敏度为5.96×104copies/L,而TaqMan探针实时荧光定量PCR检测的灵敏度为5.96 copies/L。Ct值在组内和组间重复的变异系数均小于1%。对68份山羊临床样本进行TaqMan探针实时荧光定量PCR检测,结果有2份为Mccp阳性样本,阳性率为2.94%。本研究建立了一种特异、敏感、稳定可靠的Mccp TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法,可用于Mccp的快速诊断和定量检测,为山羊传染性胸膜肺炎的防控提供了有效的技术手段。     

山羊支原体山羊肺炎亚种黏附相关蛋白的特性

为鉴定山羊支原体山羊肺炎亚种的黏附相关蛋白,通过对山羊支原体山羊肺炎亚种基因组编码的假定的膜蛋白基因(0297)进行扩增,并连接到pET-32a(+)载体,转化于大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导获得了以可溶形式表达的重组蛋白,大小约为43ku,将该重组蛋白命名为P0297。用纯化的P0297免疫BALB/c小鼠获得多克隆抗体。利用激光共聚焦显微镜观察到蓝色的细胞核周围有重组蛋白的绿色荧光存在,其外形与细胞膜的红色荧光基本重合,表明P0297对山羊气管上皮细胞有明显的黏附作用。夹心ELISA结果显示,重组蛋白P0297的黏附作用与蛋白浓度成正比,并且黏附作用可被多克隆抗体阻断,说明该重组蛋白的黏附为特异性黏附。上述结果表明,P0297蛋白是山羊支原体山羊肺炎亚种的一个黏附相关蛋白。     

绵羊和山羊嗜血支原体感染的检测及分子鉴定

为了解绵羊和山羊嗜血支原体在甘肃、辽宁、内蒙古、宁夏、重庆、海南等地的流行状况及病原种类,利用瑞氏染色方法和已发表的嗜血支原体通用qPCR方法,对2011—2015年间采自上述地区的绵羊和山羊血液样品346份进行了检测,并对部分qPCR阳性样品扩增产物进行了测序和序列分析。结果,在甘肃、内蒙古的绵羊样品中和重庆、海南的山羊样品中检出嗜血支原体;其中,瑞氏染色方法的绵羊样品阳性率为12.45%(33/265),山羊样品阳性率为24.69%(20/81);qPCR绵羊阳性率为22.26%(59/265),山羊阳性率为37.04%(30/81)。对部分阳性样品的qPCR产物进行的序列分析结果显示,绵羊样品中5/7份为绵羊支原体和绵羊嗜血支原体待定种共同感染,1/7为绵羊支原体感染,1/7为绵羊嗜血支原体待定种感染;山羊样品中,2/3为绵羊支原体感染,1/3为绵羊嗜血支原体待定种感染。本文在我国首次证实山羊和绵羊中流行绵羊支原体和绵羊嗜血支原体待定种两种不同的嗜血支原体,且绵羊中存在两种嗜血支原体共同感染的情况。     

山羊支原体山羊肺炎亚种M1601株外膜蛋白的免疫原性

通过免疫印迹试验对山羊支原体山羊肺炎亚种M1601株外膜蛋白及M1601株全菌蛋白进行了免疫原性分析,并与绵羊肺炎支原体抗血清和丝状支原体山羊亚种抗血清进行了比较,以筛选M1601株特异性的外膜蛋白。结果表明,存在于外膜蛋白中的分子质量分别为60.0和49.7 ku的蛋白是其主要的免疫原性蛋白,也是山羊支原体山羊肺炎亚种区别于丝状支原体山羊亚种和绵羊肺炎支原体的主要特异性抗原,这一结论为山羊传染性胸膜肺炎的诊断和疫苗研制奠定了良好的理论基础。     

山羊支原体山羊肺炎亚种M17基因的原核表达及细胞定位研究

为分析山羊支原体山羊肺炎亚种(Mycoplasma capricolum subsp.capripneumoniae,Mccp)氨基肽酶M17的特征及细胞定位。参照GenBank中Mccp M1601株的M17基因序列,优化密码子,合成原核表达载体pET30a-M17,将鉴定正确的表达载体转化大肠杆菌BL21 (DE3),经IPTG诱导后获得融合表达蛋白;用其免疫新西兰兔,制备超免疫血清,并测定其效价和代谢抑制效果;通过Western-blot和i ELISA两种方法对M17在Mccp细胞内的分布进行了初步研究。结果显示,pET30a-M17重组蛋白在大肠杆菌中获得成功表达,大小约50 ku,与预期相符,密码子优化后的表达产物以可溶性和包涵体两种形式存在;免疫后的兔血清抗体效价达1∶80 000以上,说明M17重组蛋白具有较好的免疫原性和反应活性;M17多抗血清对Mccp无代谢抑制作用,但能够与Mccp的膜蛋白、胞浆蛋白及全菌蛋白发生特异性反应,表明M17蛋白在Mccp的细胞膜和细胞质中均有分布,但细胞膜中含量略高于细胞浆。M17的成功表达以及在Mccp中的细胞定位为其生物学功能研究奠定了基础,也为山羊传染性胸膜肺炎的诊断和疫苗研制提供了参考。     

绵羊肺炎支原体特异性诊断靶标筛选及其间接ELISA方法的建立

本研究旨在筛选出绵羊肺炎支原体（Mo）特异性抗原靶标,并建立间接ELISA方法。利用Pulldown实验结合LC-MS技术分析,筛选Mo的抗原靶标并进行表达纯化,使用Western-blot试验分析纯化蛋白的反应原性;免疫小鼠,分析蛋白免疫原性、制备免疫血清,建立基于靶标蛋白的间接ELISA方法,并对其进行性能评价。结果显示,筛选出的Mo pdhD蛋白的分子质量为71 ku,该蛋白与稀释度为1∶4 000的Mo阳性血清仍可以发生反应,免疫小鼠血清效价可达1∶102 400,建立的间接ELISA方法不与绵羊痘病例等的阳性血清产生交叉反应,批间及批内重复的变异系数均在12%以内,与IHA法符合率可达82.5%。可见,Mo pdhD蛋白具有良好的反应原性与免疫原性,建立的间接ELISA方法性能良好,可用于Mo的血清学诊断,为进一步研发Mo ELISA抗体检测试剂盒奠定了基础。     

丝状霉形体山羊亚种巢式PCR检测方法的建立

根据已发表的丝状霉形体簇各成员核苷酸序列,设计合成了2对引物McF、McR和MmcF、MmcR,建立了可以鉴别丝状霉形体山羊亚种(Mycoplasma mycoidessubsp.capri,Mmc)的巢式PCR方法。特异性和敏感性试验结果显示,该方法只能对Mmc扩增出195 bp的片段,而对其他病原菌不能扩增出任何条带,它最低能够检测出10 pg的Mmc DNA,说明该方法具有良好的特异性和很高的敏感性。田间试验结果显示,对4株霉形体分离株及其病料均可扩增出Mmc特异性片段,表明,该巢式PCR方法可用于Mmc快速鉴定和流行病学调查。     

猪肺炎支原体PCR快速检测方法的应用研究

为对猪场中猪肺炎支原体的感染和发病情况进行有效地病原学监测,本研究筛选国内外最常用且引用率最高的靶向16S rRNA基因的引物对作为检测猪肺炎支原体的特异性引物,通过制定临床猪肺组织样品、鼻拭子样品和肺泡灌洗液样品的标准化采集与处理方法,比较菌液样品、肺组织样品、鼻拭子样品与支气管肺泡灌洗液等不同样品的不同DNA提取方法,验证PCR检测方法适用的临床样本范围。结果表明,对于菌液样品和鼻拭子样品可选用经济快速的水煮法,对于肺组织样品和肺泡灌洗液样品使用高效的试剂盒提取法。本研究表明,使用靶向16S rRNA基因的引物对进行PCR检测,可满足临床上对猪肺炎支原体快速检测的要求。     

丝状霉形体山羊亚种血清抗体间接ELISA检测方法的建立

利用丝状霉形体山羊亚种标准株PG3制备抗原,经纯化后作为包被抗原建立了间接ELISA方法,用于检测丝状霉形体山羊亚种血清抗体。经方阵滴定确定最佳抗原包被浓度为1.09μg/mL,血清样品最佳稀释度为1∶64,兔抗羊IgG辣根过氧化物酶结合物的最佳稀释度为1∶40 000,抗原抗体最佳结合时间为1 h。判定标准为样品D490 nm值与标准阴性血清D490 nm值之比(P/N)≥3为阳性,≤2.5为阴性,介于二者之间的为可疑。重复性和稳定性试验证明,建立的间接ELISA的稳定性和重复性良好,与间接血凝试验相比,其敏感性较高。     

绵羊肺炎支原体荧光定量PCR检测方法的建立与应用

为建立快速检测绵羊肺炎支原体的荧光定量PCR方法,根据EF-Tu基因序列设计合成引物,构建含有EF-Tu基因的重组质粒,以其为标准品绘制标准曲线,检验该方法的特异性、敏感性和重复性,并用于临床样本的检测。结果显示,本研究建立的方法能特异性扩增绵羊肺炎支原体,与其他病原无交叉反应,最低检测限为5 copies/L,在5×104~5×109稀释度范围内具有良好的线性关系(r2=0.996),检测的批内和批间变异系数均小于5%。对临床肺组织样本中绵羊肺炎支原体的检出率(105/134,78%)与基于P113基因的q RT-PCR方法的相符,而对鼻腔棉拭子样本的检出率(27/50,54%)略高于后者(25/50,50%)。对人工感染绵羊肺炎支原体山羊肺的病变部位、病健交界部位和无明显病变部位的检出率分别为1/6、6/6和4/6,确定肺的病健交界部位为最佳采样部位。对采自四川、新疆、青海的439份表观健康羊肺绵羊肺炎支原体的平均检出率分别为48%(61/126)、63%(103/163)和75%(113/150),提示受检羊群仍存在严重的绵羊肺炎支原体带菌感染情况。该方法的建立对绵羊肺炎支原体感染的监测与快速诊断有重要意义。     

山羊成骨细胞的体外培养和鉴定

采用初生山羊羔股骨骨膜,通过植块培养法、完全消化法和半消化植块法分离、培养成骨细胞。结果表明,植块培养法、完全消化法和半消化植块培养法的贴壁时间分别为4、24、4 h;培养4 d时的细胞数量分别为少量细胞、少量细胞、大量细胞,细胞汇合时间分别为21、19、10 d。传代后第7 d即可汇合,第14 d出现矿化结节,茜素红染色呈橘红色,Von Kossa染色呈黑色;姬姆萨和HE染色后可见体外培养的细胞呈三角形、多角形,胞质丰富,胞核卵圆形,单核,有1~3 个核仁;碱性磷酸酶染色后胞质呈黑色颗粒或块状沉淀;扫描电镜观察胞突发达,伸出的突起与临近细胞的突起相连。体外培养传至15代时细胞的生物学性状未发生变化。试验结果显示,半消化植块培养周期短,细胞损害小,有利于细胞贴壁,是一种可行的骨组织工程研究方法。     

SDS┐PAGE和免疫印迹技术对绵羊肺炎霉形体和丝状霉形体山羊亚种膜蛋白的分析

ＳＤＳ┐ＰＡＧＥ和免疫印迹技术对绵羊肺炎霉形体和丝状霉形体山羊亚种膜蛋白的分析１）逯忠新邓光明包慧芳梁桂香（中国农业科学院兰州兽医研究所７３００４６）绵羊肺炎霉形体（ｙ－９８，下同）和丝状霉形体山羊亚种（ＰＧ３，下同），都能引起山羊传染性胸膜肺炎，两...     

应用聚合酶链反应检测绵羊和山羊慢病毒

应用聚合酶链反应检测绵羊和山羊慢病毒符子华李淑霞呼西旦易中王进成（新疆畜牧科学院兽医研究所乌鲁木齐８３００００）绵羊进行性肺炎（ＯＰＰ）和山羊关节炎脑炎（ＣＡＥ）均由反转录病毒科慢病毒亚科的相关慢病毒引起。ＯＰＰ在临床上的主要症状为间质性肺炎、乳房炎...     

猪肺炎支原体抗原定量ELISA检测方法的建立

为建立猪肺炎支原体抗原的快速检测方法,本研究以抗猪肺炎支原体P46蛋白单克隆抗体为包被抗体,抗P46蛋白多克隆抗体为检测抗体,建立了猪肺炎支原体双抗体夹心ELISA方法。通过优化后的反应条件为:抗猪肺炎支原体P46蛋白单克隆抗体包被浓度为2.5μg/mL,抗P46蛋白多抗及酶标二抗稀释度分别为1∶40 000和1∶10 000。该ELISA的重复性变异系数小于10%,最低检出量为9.754 ng/mL,与猪鼻支原体、猪滑液支原体、絮状支原体等无交叉反应。使用该ELISA方法对人工稀释的培养物中抗原含量进行检测,通过单点法和对样品倍比稀释后进行双平行线拟合两种方法计算,得出两种计算方法结果均与真实值基本相符,但双平行线法检测比单点法检测更加稳定。本研究建立的双抗体夹心ELISA方法为猪肺炎支原体的定量检测提供了有效手段,可用于猪支原体肺炎灭活疫苗生产过程中抗原的检测,为灭活疫苗生产中的质量控制提供了便利。     

绵羊肺炎支原体P108蛋白的分子特征分析及免疫原性研究

为进一步探究绵羊肺炎支原体P108蛋白的结构及其免疫原性,在进行生物信息学分析的基础上,对编码P108的部分基因片段进行了PCR扩增、克隆和原核表达,并采用Western-blot方法对其免疫原性进行了分析。结果显示,p108基因与猪肺炎支原体黏附相关基因mhp385的核苷酸同源性较高,扩增的p108部分基因在大肠杆菌BL21(DE3)中成功获得表达,重组蛋白以包涵体的形式存在;重组蛋白可以与山羊抗绵羊肺炎支原体血清发生结合反应,表明P108蛋白是免疫原之一。本研究结果表明P108蛋白可以诱导机体产生免疫应答,是建立绵羊肺炎支原体感染血清学诊断技术的潜在抗原。     

绵羊肺炎支原体TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立与应用

本研究旨在建立一种灵敏性高、特异性强的检测绵羊肺炎支原体的TaqMan实时荧光定量PCR方法。根据GenBank上已发表的绵羊肺炎支原体HSP70基因序列设计引物和探针,构建标准阳性质粒,建立实时荧光定量PCR方法。试验结果显示,该方法标准曲线的线性关系良好,标准曲线的相关系数R2=1.000,斜率S=-3.334,扩增效率E=99.5%;敏感性高,可以检测出的最低样品浓度为1×101copies/L,是普通PCR的100倍;特异性强,能有效区分巴氏杆菌等9种病原;重复性好,组内、组间的Ct值变异系数均小于2%。运用本试验建立的实时荧光定量PCR方法可简便、准确地鉴定绵羊肺炎支原体。     

猪鼻支原体荧光PCR检测方法的建立和应用

为了建立猪鼻支原体（Mycoplasma hyorhinis）快速荧光PCR检测方法,本研究合成了该病原特异性基因P37的重组质粒,根据该基因设计荧光PCR引物和探针,并对设计的引物和探针的特异性、敏感性和重复性进行了检测。结果显示,该方法具有高度的特异性,除了识别猪鼻支原体基因组外,对猪的基因组和猪常见病原的基因组均不发生交叉反应。在敏感性和重复性试验中,该方法对猪鼻支原体的检测限为1 000copies/m L,变异系数小于3%,因此具有优良的敏感性和稳定性。用该方法检测临床样本,阳性检出率为76%(38/50),远高于普通PCR的阳性检出率（40%,20/50）。上述结果表明,本研究建立的荧光PCR方法在特异性、敏感性和稳定性方面均满足猪鼻支原体的临床检测要求,可以用于猪鼻支原体临床样品的检测。     

山羊STING和TBK1基因组织特异性表达和分布的研究

干扰素刺激基因(STING)和TANK结合激酶1(TBK1)是介导宿主Ⅰ型干扰素抗病毒应答的关键因子。为深入研究STING和TBK1在山羊天然免疫应答中的作用,采用RT-qPCR方法进行了STING和TBK1组织特异性表达检测,并进行了其组织分布的研究。由于物种差异较大,缺乏山羊STING的商品化抗体,本试验首先利用原核表达的STING蛋白制备了多克隆抗体。结果显示,利用原核表达的STING重组蛋白免疫新西兰大白兔后,经ELISA和Western-blot证明获得了特异性好的多克隆抗体。组织特异性表达检测结果显示,STING在肠系膜淋巴结、心脏和脾的相对表达水平较高,而TBK1在大脑、肝、心脏和肾的相对表达水平较高。免疫组织化学检测结果显示,在心肌细胞、肝细胞、淋巴细胞、细支气管上皮细胞、肾小管上皮细胞和大脑皮层神经元中均呈STING和TBK1阳性。研究结果为进一步探索STING和TBK1在山羊天然免疫应答中的作用提供了基础数据。