间接荧光抗体诊断牛边缘边虫病的研究

间接荧光抗体试验(IFAT)检测边缘边虫(Anaplasma marginale)感染牛血清快速准确,具有实际应用价值。利用冷藏抗原片进行的IFAT结果表明,该法具有特异性强、敏感性高等特点,人工感染牛符合率为100％;就疫区273份血清的检查,阳性率为35.2％,对安全区86份血清的检查,假阳性占3％。抗体消长实验表明,人工感染牛于第5天即可测出IFA抗体,60～70天达到高峰(1:5120),并维特一段时间,在感染后335天,抗体消失。在本试验中边缘边虫抗原与双芽巴贝西虫、牛巴贝西虫、瑟氏泰勒虫、伊氏锥虫感染牛血清均无交叉反应;与绵羊边虫感染羊血清有很强的交叉反应。     

酶标记免疫吸附试验

酶标记技术是在标记抗体(荧光标记、同位素标记)试验和组织化学基础上发展起来的一种新技术。1966年Nakane和Avra-meas等首先应用酶标记的抗体和细胞抗原发生反应,再用细胞化学染色法显示出病毒抗原在细胞内的位置。其后,Miles和Hales首先在免疫测定中用酶代替同位素。直到1971年Van Weeman和Schuurs,以及En-gvall和Perlman才分别详细地介绍了酶免     

免疫萤光技术在兽医诊断上的应用

免疫萤光技术,是根据免疫学上的抗原和抗体相遇时,发生特异性的反应这一现象,即将已知抗体(或抗某种传染病的血清)用一种萤光色素处理,使其互相结合,然后用这种含有萤光色素的抗体,对未知抗原(或病原材料)进行染色,染色后在紫外线显微镜下观察。如果抗原和抗体之间存在有特异性,则显示有特异萤光,从而可以识别未知抗原。     

应用ELISA检测囊虫病猪循环抗原的研究

本项研究应用McAb以ELISA双抗体夹心法检测以免疫复合物(IC)形式存在于囊虫病猪血清中的循环抗原(CA)。用3.5％聚乙二醇沉淀猪血清中的IC,再经沸水浴破坏IC中的抗体,可以明显提高CA的检出率。病猪血清CA阳性率为100％(113/113),与棘球蚴和细颈囊尾蚴感染的猪血清有交叉反应。     

猪瘟酶标抗体和荧光抗体诊断猪瘟的比较试验

荧光抗体技术始子四十年代,在1969年和1970年间,法国巴斯德研究所专门就荧光抗体技术在兽医上的应用召开过两次国际性会议。目前荧光抗体技术已广泛用于细菌、病毒、原虫的鉴定,传染病的快速诊断,肿瘤抗原的研究等。继荧光抗体之后,在六十年代,医学工作者即开始用酶代替荧光素标记抗体,作生物组织抗原的鉴定和定位,从而创造了酶标记抗体新技术。近年来,国内亦开展了这方面的研究。笔者应用猪瘟酶标抗体和荧光抗体诊断猪瘟作了对比试验,现将其结果介绍如下。     

补体结合试验诊断边虫感染牛的研究

利用边缘边虫DS-1株接种除脾易感牛,制备出补反诊断抗原。所制备的抗原具有良好的特异性和敏感性,并建立了总量为0.6ml的补反诊断方法。对试验条件下人工感染牛的补反检出率为100％,安全区无假阳性反应。人工感染牛第5天出现补反抗体,感染后20～50天血清抗体达到高峰,以后开始下降,7个月后补反抗体消失。所制备的补反抗原与双芽巴贝西虫、牛巴贝西虫、大巴贝西虫,环形泰勒虫、瑟氏泰勒虫、伊氏锥虫和日本血吸虫等几种血液寄生虫抗血清之间没有交叉反应。抗原保存期达一年以上。所制备的抗原达到了国外同类产品的水平。     

应用间接ELISA检测微小隐孢子虫抗体的研究

以在大肠埃希氏菌中表达的微小隐孢子虫 (Cryptosporidum parvum )子孢子表面抗原CP15为抗原 ,以辣根过氧化物酶 (HRP)标记的山羊抗鼠IgG为二抗 ,建立了检测微小隐孢子虫抗体的间接ELISA。试验筛选出的最佳反应条件为 :大肠埃希氏菌CP15抗原包被量为 1μg/孔 ,用10 0mL/L的兔血清进行封闭 ,以正常大肠埃希氏菌裂解上清液稀释待检血清。试验结果表明 ,应用CP15重组蛋白作为诊断微小隐孢子虫抗体的抗原具有特异性高、抗原易纯化和成本低等特点     

禽腺病毒T型琼脂扩散抗原的研制及应用

研制了禽腺病毒Ⅰ型琼脂扩散抗原,检测了该抗原的效价和特异性,并用该抗原对人工感染鸡沉淀抗体的变化以及现地血清样本进行了检测.结果显示,该抗原不与其他主要禽类病原体阳性血清反应,可与1:8稀释的禽腺病毒工型阳性血清反应.对3月龄SPF鸡进行人工感染后,第7 d可检测到沉淀抗体,血清中的沉淀抗体可持续3个月以上.抗原在-20℃条件下可保存2年.经对现地38个鸡场进行检测,其中阳性场14个,阳性率为36.84%,表明我国的禽腺病毒感染率很高.结果证实,研制的禽腺病毒Ⅰ型琼脂扩散抗原敏感、特异,可用于禽腺病毒感染的血清学检测.     

狂犬病病毒抗体免疫金标检测试纸的制备及其应用

为了建立一种快速检测狂犬病病毒抗体水平的方法,用浓缩提纯的狂犬病病毒CVS11株作为胶体金标记抗原,以金黄色葡萄球菌A蛋白为检测线上的捕获抗原,制备狂犬病病毒抗体水平检测试纸条。应用该试纸条进行临床样品检测,结果表明,以稀释后的犬全血或血清作为检测样品,试纸条检测的灵敏度为0.002U/mL,特异性试验证明该试纸条与犬细小病毒、犬瘟热病毒、犬腺病毒2型犬科疾病阳性血清没有交叉反应,稳定性试验证明该试纸条在室温下保存的有效期为12个月,检测结果与快速荧光抑制试验的符合率为95.12%。证实该狂犬病病毒抗体免疫金标检测试纸可以方便、快速、灵敏、特异地检测狂犬病病毒的抗体水平。     

旋毛形线虫P53重组蛋白抗体间接ELISA检测方法的建立

以纯化的旋毛形线虫P53排泄分泌(ES)重组蛋白作为包被抗原,建立了检测旋毛形线虫P53 ES蛋白抗体的间接ELISA方法,并确定了间接ELISA的最适反应条件:抗原包被浓度为2/μg/mL(100 μL),血清稀释度为1∶200,辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG抗体稀释度为1∶10 000,抗原和血清于37℃反应1.5 h,血清和二抗于37℃反应1 h,底物于37℃显色10 min.应用该方法对试验小鼠血清进行检测,结果表明,建立的间接ELISA方法具有较好的特异性和重复性,适用于检测特异性P53血清抗体.     

微量补体结合试验诊断边虫感染牛的研究

利用边缘边虫DS—1株接种除脾易感牛,制备出补体结合试验诊断抗原,并建立了边虫感染牛总量为0.2ml的微量补反诊断法。所制备的抗原具有良好的特异性和敏感性,对实验室条件下人工感染牛的补反检查,符合率为100％;自然条件下感染牛补反检查的符合率为92.3％;安全区牛无假阳性反应。人工感染牛于第10天可测出补反抗体,30～40天抗体滴度达到高峰,60天后开始下降。边虫补反抗原与瑟氏泰勒虫、双芽巴贝西虫、牛巴贝西虫、伊氏锥虫、肝片吸虫、日本裂体吸虫感染牛血清无交叉反应,与正常红细胞免疫牛血清反应为阴性结果。     

制取牛粘膜病病毒和绵羊边界病病毒的试样供电镜检验

牛病毒性腹泻──粘膜病(简称BVD-MD)是欧美各国奶牛和肉牛群的常发病,近年测知,我国也有少数地区存在本病。其病原属RNA病毒,对牛粘膜病毒或牛病毒性腹泻病毒、绵羊边界病病毒和猪瘟病毒已进行分类,同属于披盖病毒科(Togaviridae)的瘟疫病毒属(genus Pestvirus)。 病毒在动物体产生中和抗体和补体结合抗体;在琼脂扩散系统中,BVD-MD病毒抗原和猪瘟血清或绵羊边界病血清产生沉淀反应,所以说,三种病毒有共同的可溶性沉淀抗体。还     

鸡IL-5基因在毕赤酵母中的表达及重组蛋白抗体间接ELISA检测方法的建立

参照GenBank中登录的鸡白介素5(IL-5)基因的核苷酸序列,设计1对特异性引物。用聚合酶链反应(PCR)以克隆载体pMD18-T-IL-5为模板扩增IL-5基因,然后将IL-5基因克隆到酵母表达载体pPICZαA中并电转化入酵母X-33,在Zeocin作为筛选标记的YPD培养基上筛选阳性菌落。经甲醇诱导表达鸡IL-5蛋白,对表达产物进行SDS-PAGE和Western-bolt分析。以纯化的鸡白介素5蛋白作为包被抗原,建立了检测鸡白介素5蛋白抗体的间接ELISA。结果显示,鸡白介素5基因获得成功表达,诱导表达培养物上清中表达出具有反应活性的26ku左右的重组鸡白介素5蛋白。从而实现了鸡白介素5蛋白高效的酵母表达。确定了间接ELISA的最佳反应条件:抗原包被浓度为10.00μg/mL,包被时间为37℃2h,血清稀释度为1∶1 600,HRP标记的山羊抗小鼠IgG抗体的稀释度为1∶1 000,血清与抗原在37℃反应1h,血清和二抗于37℃反应1h。应用该方法对试验小鼠血清进行检测,结果显示建立的ELISA具有较好的重复性,适用于检测抗鸡白介素5蛋白的抗体。     

电化学免疫检测技术简介

电化学免疫检测技术是近十几年发展起来的一种微量检测新技术,主要用于生物活性物质如抗原、抗体、激素等的检测。它将免疫反应的特异性和微电子技术结合,使免疫检测具有精度高、速度快、适合于小型化和集成化,显示了广阔的发展前景。(一)原理 电化学免疫检测是根据抗原、抗体特异结合的原理,首先把抗体或抗原结合在载体或电极表面,即进行抗体或抗原的固化。然后用固化的抗体或抗原与待测样品中的抗原或抗体反应,用直接或间接法测量电化学信号的变化,从而得出待测样品中抗原或抗体的浓度。(二)分类 电化学免疫检测技术大致可以分为两大类:1.直接测量法:是利用抗原、抗体反应产生抗原—抗体复合物的膜电位,用电化学传感元件测     

口蹄疫病毒O型和A型交互反应性单克隆抗体的筛选与鉴定

不同血清型口蹄疫病毒(FMDV)之间不能产生交叉免疫保护,但是血清学的交叉反应确实存在。本研究旨在建立一种筛选型间交互反应性抗体的方法,以期为解析FMDV血清型间保守的抗原结构奠定基础。本方法主要依据单个B细胞抗体技术,首先采用两种不同的荧光染料FluoProbes 647H和Pacific Blue分别标记O型与A型FMDV 146S灭活抗原,然后利用流式细胞分选技术,从免疫牛外周血单个核细胞(PBMCs)中分选出结合两种抗原的特异性B细胞,通过单个B细胞抗体基因测定,获得Ig G抗体重链与轻链可变区编码序列,并将可变区基因插入含有牛IgG抗体恒定区的pcDNA3.4载体中,构建IgG抗体的重链与轻链表达质粒。将重链与轻链表达质粒共转染中国仓鼠卵巢悬浮细胞(CHO-S)进行完整抗体表达。结果显示,通过该方法获得了5株FMDV特异性单克隆抗体,其中4株(H64、R82、I16、R29)经间接免疫荧光(IFA)检测都可特异性识别O和A型FMDV;ELISA结果显示,H64、R82、I16与O、A型抗原均具有较好的亲合力;Western-blot结果显示,I16可特异性结合O、A型FMDV结构蛋白VP2中的线性表位,说明在衣壳蛋白VP2上存在血清型间保守的抗原表位,通过本研究进一步加深了对FMDV抗原结构的认识。     

免疫酶斑点法快速检测小鹅瘟病毒

至今,有关小鹅瘟病毒(GPV)的快速诊断尚未找到一种较为理想的方法,Malkinson(1974)和Peleg(1974)发现牛精子能被GPV所凝集,但为非特异反应,难以说明问题;Dosz-kow,K.I.等(1982)用酶组化法技术测定细胞培养和小鹅组织中的抗原;Bondarerke(1982)用免疫扩散技术测定鹅胚绒毛尿囊液中的抗原,然而,前者所用的抗体是常规血清,非特异性反应较强,后者需高效价血清及多倍浓缩的尿囊液,且灵敏度不高,这些方法在实际应用上均有一定的困难。1981年徐为燕等和1989年孙怀昌等用反向间接血凝技术检测鹅胚尿囊液及组织中的GPV,效果虽     

牛环形泰勒焦虫补反抗体测定

据资料报道,补体结合反应(CF)是动物和人感染原虫后出现的一种比较特异性的血清学反应。 ( 1966)用环形泰勒焦虫红细胞型虫体作抗原。检测了实验感染环形泰勒焦虫牛的补反抗体,对补反阳性牛进行攻蜱试验,结果表明阳性牛具有对该病的免疫力。P.Hooshmand-Rad等(1971)利用环形泰勒焦虫组织培养物作抗原成功地测定了牛体注苗后血液中的补反抗体。关于这方面的资料国内尚未见报道。本实验以人工培养     

牛病毒性腹泻病毒荧光标记单克隆抗体的制备及鉴定

为制备可以区分牛病毒性腹泻病毒(BVDV)基因型的荧光标记单克隆抗体,分别利用分泌抗牛病毒性腹泻Ⅰ型病毒(BVDV-Ⅰ)、牛病毒性腹泻Ⅱ型病毒(BVDV-Ⅱ)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV-Ⅰ和BVDV-Ⅱ)单克隆抗体的杂交瘤细胞株BV1、BV2、BV12,腹腔接种BALB/c小鼠,大量制备单克隆抗体,用辛酸-硫酸铵法提纯,经活性、浓度、纯度检测合格后,利用搅拌法与异硫氰酸荧光素(FITC)偶联,制备成3种荧光标记单抗。结果显示,3种标记单抗的F/P比值范围均在2.0～4.0之间;细胞DFA法测定其效价均≥1∶200;抗原交叉试验证实标记单抗的特异性良好;标记单抗可以检测到1TCID50的病毒粒子;临床初步应用表明,3种标记单抗的阳性检出率均≥95%,与进口BVDV荧光抗体的符合率为100%。3种荧光抗体的研制对BVDV基因分型鉴定、NCP型BVDV的鉴定以及BVDV与CSFV的鉴别诊断有很好的应用价值,值得进一步开发。     

酶标记和间接血凝法对锥虫病牛循环抗体消长的测定

伊氏锥虫病的诊断过去主要依靠末稍血液内虫体的镜检方法,但伊氏锥虫在末稍血液中时隐时现,出没无常,除急性病例外,对亚急性、慢性及带虫者的诊断是较困难的。近年来随着免疫学研究的进展,对伊氏锥虫病的诊断也取得了很大的成绩。如沉淀试验(Bansal和Pathank 1971)、凝胶扩散(Draper 1976)、补体结合反应(Sabanshiev 1973)和荧光抗体技术(Kagan 1974)等法相继建立,均有一定的诊断价值。然而寻求一种更新的特异性     

酶联接(标记)免疫吸附试验

(一)定义酶联接(标记)免疫吸附试验(EnzymeLinkedImmunosorbentAssay,以下简称ELISA),是根据抗原与抗体的免疫反应原理和酶的高效催化作用的显色原理,以酶降解底物而显色浓淡和消光值大小为指标,用酶标记的抗免疫球蛋白抗体检测特异性抗体或抗原的一种较敏感的技术。