鹅Ⅰ型禽副粘病毒融合蛋白基因3''''端cDNA片段的分子克隆

参考禽副粘病毒的融合蛋白基因(F基固)cDNA序列,设计并合成了1对引物,以分离到对鹅有致病力的Ⅰ型禽副粘病毒GPMV/QY97-1株的核酸(RNA)为模板,用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)对其融合蛋白基因3'端进行扩增,获得了预计的884 bp左右的片段.将该片段克隆进pGEM-T Easy质粒载体,获得重组质粒T-GPMVF3',采用限制性内切酶和PCR方法对该重组质粒进行鉴定,证明所克隆的片段即为目的基因片段,这为进一步开展鹅Ⅰ型禽副粘病毒的分子生物学研究奠定了基础.     

禽副粘病毒Ⅰ型引起鹅副粘病毒病的诊断

用鹅胚和鸡胚从山东、安徽两地患病鹅群的病鹅肝、脾中分离到2株病毒,代号分别为SD20和AH20.经电镜观察、血凝试验和血凝抑制试验、理化特性鉴定等试验表明,2株分离毒符合禽副粘病毒Ⅰ型特征,单克隆抗体介导的间接ELISA检测结果表明,SD20和AH20分离株都能与禽副粘病毒Ⅰ型单克隆抗体发生反应.     

鹅副粘病毒HN基因的克隆与序列分析

以鹅副粘病毒GPVSF0 2毒株的基因组RNA为模板 ,通过RTPCR方法扩增出HN基因片段 ,然后将其克隆至T载体中。经PCR鉴定后 ,对阳性克隆进行测序 ;测序后拼接得出HN基因的全序列。经分析HN基因编码区核苷酸序列 ,所测GPVSF0 2毒株与参考毒株NL 96核苷酸序列的同源性为 86 %。     

鹅副粘病毒的分类地位初探

对从病鹅体分离的禽副粘病毒(GPV)YG97株,经红细胞凝集(HA)和红细胞凝集抑制(HI)试验证明,与新城疫病毒(NDV)存在着极大的相关性.参考NDV的3个毒力指标--最小致死量致病鸡胚平均死亡时间(MDT)、1日龄雏鸡脑内接种致病指数(ICPI)和6周龄非免疫雏鸡静脉接种致病指数(IVPI),对YG97株进行测定,表明其具有与NDV速发型类似的毒力,属强毒力的毒株.应用RT-PCR技术对F基因重要功能区片段扩增后进行序列测定,并与多株已报道的NDV相应片段进行序列比较,经遗传进化树分析后,初步判定其为禽副粘病毒-Ⅰ型,属基因Ⅶ型NDV.     

鹅Ⅰ型禽副黏病毒F基因重组质粒的构建及其DNA免疫

通过RT PCR扩增出鹅Ⅰ型禽副黏病毒GPMV/QY97 1株F蛋白基因的cDNA ,并将F基因cDNA克隆到含CMV启动子的pCI载体上 ,构建这一基因的真核表达质粒pC GPMVF ,以此质粒肌肉注射 3周龄非免疫鸡 ,并分别于免疫后第 2、4、6周通过ELISA方法检测抗体水平。结果证明 ,用重组质粒pC GPMVF免疫鸡 ,能刺激机体产生抗Ⅰ型禽副黏病毒的特异性抗体和免疫应答     

鸽Ⅰ型副粘病毒的分离和鉴定

用分离的对鸽有致病性的4株禽副粘病毒通过电镜观察、病毒中和试验和动物回归试验结果显示,病毒粒子呈球形,直径100～450 nm,表面有纤突;能凝集鸡红细胞,血凝反应能被新城疫病毒(NDV)和鸽Ⅰ型副粘病毒(PPMV-1)阳性血清所抑制;接种1月龄乳鸽能使其发病,出现明显症状和病变并有死亡,接种1月龄SPF鸡不发病;能在鸡胚成纤维细胞(CEFs)上生长,并能产生细胞病变(CPE);对高温敏感,在55℃放置60 min基本上无感染力;对乙醚、胰酶和酸(pH4.0)等敏感,二价镁离子对其有保护作用;各毒株均能产生蚀斑,蚀斑为浅灰色,形态较规则,清晰透明,直径2.0～4.5 mm.根据以上特性鉴定为PPMV-1,其中ZQ98-1及SZ98-1为中强毒力毒株,ZJ98-1及DG98-1为较弱毒力毒株.采用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR),扩增出ZQ98-1株F基因全长cDNA,经全自动测序,获得了ZQ98-1株F基因全序列,进一步从分子水平证明4株分离毒株为PPMV-1.     

禽脑脊髓炎病毒VR株衣壳蛋白基因的克隆及序列分析

用冻存的禽脑脊髓炎病毒VanRoekel(AEVVR)株通过SPF鸡胚传代复壮 ,获得了试验用病毒株样本。根据已知禽脑脊髓炎病毒 114 3(AEV 114 3)株的衣壳蛋白VP0、VP3、VP1基因序列 ,设计了 3对引物 ,分别扩增AEVVR株的VP0、VP3、VP1基因 ,将RT PCR产物进行分子克隆和序列分析。结果表明 ,AEVVR株与AEV 114 3株VP0、VP3、VP1基因的核苷酸同源性分别为 95 .1%、93.6 %和 93.9% ;氨基酸的同源性分别为 97.5 %、97.5 %和 99.6 %。     

应用反转录-聚合酶链反应检测鸽Ⅰ型副粘病毒的研究

根据鸡新城疫病毒(NDV)和鸽Ⅰ型副粘病毒F基因的保守序列,设计合成1对引物XZ9、XZ10,用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)对3株鸽Ⅰ型副粘病毒和6种其它禽病原体进行检测.结果,该引物对3株鸽Ⅰ型副粘病毒均扩增出与预期大小相符的RT-PCR产物,而对鸡传染性支气管炎病毒、禽呼肠孤病毒、鸡传染性喉气管炎病毒、大肠埃希氏菌、禽腺病毒、禽巴氏杆菌扩增结果均为阴性;RT-PCR最低能检出1pg的鸽Ⅰ型副粘病毒的核酸模板.     

鹅细小病毒VP3基因重组禽痘病毒转移载体的构建

从含有鹅细小病毒 (GPV)H1株主要结构蛋白VP3基因的重组质粒pPROEXHTb VP3中切取GPVH 1株VP3基因片段 ,将其亚克隆于 pSY5 3 8的EcoRⅠ位点 ,并将带有痘苗病毒启动子P11的LacZ报告基因平端克隆于上述重组子的SmaⅠ位点 ,再用NotⅠ切下同时含有VP3基因和LacZ报告基因的片段 ,亚克隆于pSY681的NotⅠ位点 ,构建了含有VP3基因的重组禽痘病毒转移载体。上述结果为GPV基因工程疫苗的研制奠定了基础     

禽脑脊髓炎病毒 VP3基因的克隆与序列测定

根据已发表的禽脑脊髓炎病毒 (AEV)序列设计了 1对引物 ,利用RT PCR技术 ,从AEVVR株感染的SPF鸡胚脑以及内脏器官组织中成功扩增出了VP3基因 ,回收、纯化后克隆到T载体中 ,用常规方法转化JM1 0 9感受态细胞。阳性重组质粒经酶切及PCR鉴定后测定核酸序列。结果表明 ,VR株VP3基因全长 73 5bp ,共编码 2 4 5个氨基酸 ,与AEV 1 1 4 3标准毒株相应片段的核苷酸和氨基酸同源性分别为 93 .0 %和 97.0 % ;并将其与其他小RNA病毒进行了比较     

鸭Ⅰ型干扰素基因的克隆与序列测定

从植物血凝素 (PHA)刺激的鸭外周血单核细胞提取总RNA ,采用RT PCR扩增鸭Ⅰ型干扰素 (DuIFN Ⅰ)基因 ,将其克隆到pMD 1 8T载体中 ,进行序列测定。克隆到的鸭Ⅰ型干扰素基因与已公布的DuIFN α核苷酸序列同源性为 99.65 % ,氨基酸序列同源性为 98.95 %。同时表明 ,鸭外周血单核细胞在PHA刺激下能够表达Ⅰ型干扰素mRNA。     

鹅IL-18基因的克隆和原核表达及其多克隆抗体的制备

参考GenBank中鸡、火鸡和鸭IL-18基因序列,设计了1对特异引物,以提取的鹅脾细胞总RNA为模板,应用RT-PCR扩增、克隆鹅IL-18基因中间的333bp序列。序列分析结果表明,其与鸭IL-18基因对应序列相似性最高,达99%。参考鸭IL-18全基因序列设计上、下游引物各3条,以梯度PCR探索扩增、克隆鹅IL-18全基因。以上述策略成功扩增、克隆了3个广东地方杂交品种鹅的IL-18基因。序列分析表明,这3个杂交品种鹅的IL-18基因序列一致,长642bp,含一个603bp的ORF,编码200个氨基酸,分子质量为23.2ku。ORFN端的30个氨基酸为前导序列,其余170个氨基酸为功能蛋白序列。在GenBank中注册了第一条鹅的IL-18基因序列,登录号为EF159728。随后,构建了鹅IL-18基因ORF的重组原核表达质粒pET-GIL-18,经诱导表达、纯化获得重组鹅IL-18融合蛋白,并以其制备了兔抗重组鹅IL-18多克隆抗体。     

鸡卵清蛋白基因5′端调控区的克隆及其序列分析

应用PCR技术从鸡输卵管组织基因组中扩增出了 1.0 0kb的鸡卵清蛋白基因 5′端调控区序列。序列分析表明 ,该区域含有TATA框及激素识别位点 ,具备输卵管定位表达的调控能力。为外源基因在鸡输卵管中的定位表达奠定了基础。     

北京鸭Ⅱ型干扰素基因分子克隆与序列分析

应用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术,从伴刀豆球蛋白A(ConA)刺激培养的北京鸭脾淋巴细胞提取的总RNA中扩增得到北京鸭Ⅱ型干扰素(1FN-γ)基因(DuIFN-γ2).序列分析表明,DuIFN-γ2基因长度与报道的鸭IFN-γ基因(AF087134)长度一致,为497个核苷酸,共编码145个氨基酸的成熟蛋白,推测其分子量约17 ku.两者核苷酸水平的同源性为99.6%,有2个位置发生非同义变异,其氨基酸序列的同源性为98.6%;与其他禽类的同源性为67.0%-68.0%,与人的同源性为34.4%.     

禽呼肠孤病毒σNS非结构蛋白基因的克隆和表达

采用RT-PCR技术扩增了禽呼肠孤病毒(ARV)S1133株与广西分离株R2σNS非结构蛋白基因,将σNS基因克隆到质粒表达载体pGEX-4T-1上,获得的重组质粒经PCR、酶切鉴定以及测序分析,σNS基因的插入位置、大小和阅读框均正确,将阳性克隆命名为pGEX-S1133-σNS和pGEX-R2-σNS。构建好的重组质粒经37℃1 mmol/L IPTG诱导、SDS-PAGE分析超声裂解后的上清和沉淀,显示目的蛋白以包涵体方式表达,其蛋白质分子质量约为66.2 ku,约占菌体总量的31.5%~34.8%。Western-blotting分析表明,目的蛋白能够与ARV阳性血清发生特异性反应,表明该重组蛋白具有较好的抗原性。     

鸭肝炎病毒Ⅰ型VP3基因的克隆及原核表达

参照鸭肝炎病毒Ⅰ型(DHV-Ⅰ)的基因组序列设计并合成了1对引物.通过RT-PCR方法扩增获得了DHV-Ⅰ病毒161/79/Ⅴ结构蛋白VP3基因,并将VP3基因片段插入pGEX-6p-1表达载体,转化E.coli Rosetta-gami(DE3)pLysS.SDS-PAGE分析表明,经用0.1 mmol/L IPTG于16℃诱导表达后,菌体裂解产物有特异的、分子质量约52 ku的目的蛋白条带.Western-blotting检测表明,表达产物与DHV-Ⅰ阳性血清发生特异性反应,具有良好的反应原性.     

鹅细小病毒VP1基因的克隆及序列分析

参照GenBank中收录的鹅细小病毒 (GPV)B株基因序列设计并合成了扩增GPVH1株VP1的 1对引物 ,利用PCR技术扩增出长约 2 .2kb的目的片段 ,将其克隆到 pMD 18 T载体上 ,进行了序列测定及分析。测序结果表明 ,GPVH1株VP1基因由 2 199个核苷酸组成 ,编码 732个氨基酸。经与B株、YG株进行同源性比较 ,核苷酸的同源性分别为 98.5 0 %和 93.18% ;推导的氨基酸同源性分别为 98.0 9%和 95 .77%。     

禽呼肠孤病毒σNS基因的克隆及其功能分析

采用RT-PCR技术对8株禽呼肠孤病毒(ARV)σNS基因进行了扩增,将获得的PCR产物分别与pMD18-T载体连接。测序结果表明,所构建的克隆质粒中均含有相应的σNS蛋白基因,大小为1 107bp。经DNAStar软件分析,除R1株外,其他ARV毒株的σNS基因核苷酸及其推导氨基酸序列与标准毒株S1133和1733株的同源性很高。Antheprot 5.0蛋白分析软件的分析结果表明,σNS蛋白无跨膜区,拥有较多的疏水区和抗原位点,可作为诊断候选蛋白。     

大通牦牛LF基因的克隆与分子特征

通过RT-PCR克隆了牦牛包含LF基因编码区的cDNA序列(GenBank登录号为EU547251);将克隆获得的LF基因的cDNA与乳牛相应序列进行了比对;对牦牛LF蛋白的氨基酸序列(GenBank登录号为ACB29794)与其他物种的相应序列进行了比较,应用在线生物软件对牦牛LF蛋白的特性和结构进行了预测.结果表明,克隆获得的牦牛LF基因cDNA片段长度为2 344 bp,其中LF基因编码区全长2 124bp,编码708个氨基酸;克隆获得的牦牛cDNA序列与乳牛该序列存在15个碱基的变异;各物种LF蛋白具有较高的同源性,LF蛋白进化树符合物种进化规律;牦牛LF蛋白含有α-螺旋36.0%、β-折叠22.4%、β-转角31.1%、无规卷曲12.9%;同源建模预测的LF 3D模型显示,LF为多肽链在二级结构基础上折叠形成的2个极相似的、对称的球状叶,即N叶和C叶,中间由一段对蛋白酶敏感的α-螺旋连接,呈"二枚银杏叶型"结构.