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利用PCR扩增出中国昆明鼠 β2 肾上腺素能受体基因 ,将其与 pUCm T载体在体外连接 ,转化E .coliDH5α宿主菌 ,利用α 互补筛选出白斑后 ,经PCR鉴定、酶切鉴定和测序鉴定后 ,进一步将克隆的基因在NCBI核酸数据库中进行序列比较 ,确定鼠 β2 肾上腺素能受体基因已被克隆 相似文献
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根据植物组成型表达质粒pBin438的限制性酶切位点及FMDVVP1的核苷酸序列设计并合成引物,从种子特异性启动子7S质粒pU82质粒中扩增7S启动子,经HindⅢ和BamHⅠ酶切,与经同样双酶切的植物组成型表达载体pBin438大片段连接,经酶切、PCR鉴定及序列分析,种子特异性表达载体p7SBin438构建完成。从FMDVVP1基因的pGEMVP1质粒中扩增VP1基因,经BamHⅠ和SalⅠ双酶切后,与p7SBin438质粒酶切后的大片段连接,经酶切、PCR及测序鉴定,FMDVVP1基因已置于种子特异性启动子7S下游,成功构建了FMDVVP1基因的种子特异性表达载体p7SBin438VP1。通过三亲交配法,将表达载体p7SBin438VP1导入根癌农杆菌,为研究FMD可饲疫苗奠定了基础。 相似文献
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《中国兽医科学》2017,(12)
采用酶联免疫吸附(ELISA)试验对福建某花鸟市场采集的40份猫血液样本进行弓形虫IgG抗体检测,对抗体呈现阳性的血液样品进行弓形虫B1基因PCR扩增;对扩增结果呈现阳性的样本采用多位点巢式PCR-RFLP技术,在SAG1、5’SAG2、3’SAG2、Alt.SAG2、SAG3、BTUB、GRA6、c22-8、c29-2、L358、PK1和Api co共12个位点进行弓形虫基因分型研究和部分位点的遗传变异分析。结果表明,40份血清中,19份血清呈弓形虫IgG抗体阳性,阳性率为47.5%,19份血清抗体呈阳性的血液样品中,B1基因PCR扩增出3份阳性样品,进一步多位点巢式PCR-RFLP分析和遗传变异分析发现,PCR阳性样品中的弓形虫基因型均表现为New Genotype型。 相似文献
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用猪睾丸细胞增殖并扩增猪传染性胃肠炎病毒 (TGEV)国内分离株TH 98,根据基因库中已发表的TGEVS基因cDNA序列 ,利用Oligo软件设计并合成 2对引物 ,进行逆转录聚合酶链反应 (RT PCR) ,扩增出 2 .3kb和 2 .1kb2个片段 ,即Sa与Sb。将Sa与Sb先后插入到pUC18质粒载体上的EcoRⅠ和PstⅠ多克隆位点上 ,构建了重组质粒pUC S。根据TGEVS基因位点和 pUC18的物理图谱 ,用相应的限制性内切酶进行酶切及套式PCR方法鉴定、分析 ,证明克隆的pUC S为TGEVS基因。同时对pUC S进行序列测定分析 ,并与来自美国、英国和日本的 5个毒株进行核苷酸及编码氨基酸同源性比较 ,证明了S基因的高度保守性 相似文献
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犬新孢子虫NcAMA1基因重组腺病毒穿梭质粒的构建及其真核表达 总被引:1,自引:0,他引:1
为构建犬新孢子虫NcAMA1基因重组腺病毒穿梭质粒,并在真核细胞中表达,以重组质粒pVAX1-NcAMA1为模板,PCR扩增了NcAMA1基因,以此构建了pMD18T-NcAMA1重组克隆质粒;对该重组克隆质粒进行双酶切鉴定后,将其亚克隆至腺病毒穿梭载体pCR259中。应用脂质体介导转染法将经PCR鉴定和酶切鉴定正确的pCR259-NcAMA1重组穿梭质粒转染293细胞,应用IFAT和Western-blot技术检测了AMA1基因在293细胞中的表达情况。结果显示,扩增的NcAMA1基因长度为1 695bp,构建的重组腺病毒穿梭质粒pCR259-NcAMA1能在293细胞中获得瞬时表达,表达蛋白的分子质量约为68ku。 相似文献
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对FMDV 3C基因克隆质粒p3C-T进行PCR扩增,获得了口蹄疫病毒3C蛋白酶基因片段,将此片段与T4噬菌体整合质粒pR的EcoRⅠ酶切片段连接,转化E.coli,DH5α工程菌,经EcoRⅠ酶切、质粒PCR扩增、插入方向筛选及测序鉴定,成功获得了T4噬菌体重组整合质粒pR- 3C。将其转化E.coli E2后,与SOC基因缺失的噬菌体φT4-Z1同源重组,经溶菌酶依赖性筛选,获得了快速溶菌型噬菌体φT4-3C。经噬菌体PCR扩增、SDS-PAGE分析和Western-bot分析,重组噬菌体可展示约26 ku的重组蛋白;其大小与预期相符,具有免疫原性。 相似文献
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根据已发表的禽脑脊髓炎病毒 (AEV)序列设计了 1对引物 ,利用RT PCR技术 ,从AEVVR株感染的SPF鸡胚脑以及内脏器官组织中成功扩增出了VP3基因 ,回收、纯化后克隆到T载体中 ,用常规方法转化JM1 0 9感受态细胞。阳性重组质粒经酶切及PCR鉴定后测定核酸序列。结果表明 ,VR株VP3基因全长 73 5bp ,共编码 2 4 5个氨基酸 ,与AEV 1 1 4 3标准毒株相应片段的核苷酸和氨基酸同源性分别为 93 .0 %和 97.0 % ;并将其与其他小RNA病毒进行了比较 相似文献
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采用RT PCR技术从长白猪的肌肉组织中扩增出了泛素 (Ubiquitin)基因 ,并将其克隆到 pGEM Teasy载体 ,经测序表明 ,所克隆的基因与GenBank中已登录的序列同源性达 99%。利用设计的融合表达引物 ,分别将泛素基因与猪生殖与呼吸综合征病毒 (PRRSV )GP5蛋白成熟肽基因进行扩增 ,用重叠区扩增基因拼接法将 2个基因片段进行拼接 ,并插入真核表达载体 pcDNA4 .0HISMAXA中 ,构建出了 pcDNA U GP5重组质粒。 相似文献
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应用RT-PCR方法扩增出猪日本乙型脑炎病毒(JEV)的NS1基因,通过SalⅠ EcoRⅠ双酶切后把该基因插入到经过同样双酶切的穿梭质粒pDC315中。重组穿梭载体经过双酶切和PCR鉴定后进行测序,序列测定正确。将获得的重组穿梭质粒与腺病毒骨架质粒共转染293细胞后获得重组腺病毒。PCR鉴定及间接ELISA检测的结果证明所构建的重组腺病毒成功地表达了JEV的NS1。 相似文献
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《中国兽医科学》2021,(11)
为了比较PRV、CAstV-Ⅰ和CIAV的单重纳米PCR方法和单重PCR方法的敏感性,探讨靶基因GC含量和引物T_m值对纳米PCR和常规PCR的影响,本研究根据PRV的gE基因、CIAV的VP1基因和CAstV-Ⅰ的ORF1b基因设计了12对引物,运用这12对引物建立单重的纳米PCR方法和常规PCR方法,分别优化纳米PCR和常规PCR方法的退火温度和引物浓度,比较两者的敏感性。结果显示,纳米PCR和常规PCR方法在最佳的反应条件下的敏感度基本一致,纳米PCR方法在敏感度上没有明显的优势;纳米PCR反应液对高GC含量靶基因的扩增比常规的PCR反应液更容易;纳米PCR的可选退火温度范围宽松,而常规PCR则需要严格的退火温度才能增强扩增效果或减少非特异性扩增;常规PCR的退火温度只与靶基因的GC含量呈现正显著相关(P0.01),纳米PCR的退火温度与靶基因的GC含量和引物T_m值无相关性。以上数据为相关的技术人员对于病原体检测技术的选择上提供了数据参考。 相似文献
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根据已发表的PRRSV基因组序列,设计并合成了1对特异扩增ATCC VR-2332株的ORF6基因的引物.以ATCC VR-2332基因组为模板,通过RT-PCR扩增出586 bp的cDNA产物.将该cDNA片段经T-A连接插入pGEM-Teasy载体中,用重组质粒转化大肠埃希氏菌JM109,获得重组质粒转化菌.对重组质粒DNA进行PCR及酶切鉴定,证明插入的DNA片段与PCR扩增的DNA片段大小相符.对整个ORF6进行序列分析,将测序结果与已发表的ATCCVR-2332序列相比较,证实插入片段为PRRSV VR-2332的ORF6片段的cDNA. 相似文献
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刚地弓形虫GJS株微线体蛋白3基因真核表达质粒的构建及在BHK-21细胞中的表达 总被引:2,自引:0,他引:2
采用PCR技术从刚地弓形虫GJS株基因组DNA中扩增微线体蛋白3(MIC3)基因,并克隆到pMD18-T载体,经PCR、酶切及测序鉴定后,阳性重组质粒酶切并亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+)后进行PCR、酶切及测序鉴定.将重组质粒转染BHK-21细胞.间接免疫荧光染色证明,质粒DNA成功转染到细胞中并得以表达.Western-blot分析证实,细胞裂解液及上清样品中有1条约39.2 ku的条带,可被山羊抗刚地弓形虫超免疫血清所识别,大小与预测值相符.表明,真核表达质粒pcDNA3-MIC3中的MIC3基因在BHK-21细胞中获得表达且表达产物具有抗原性. 相似文献
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利用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增出A群猪轮状病毒(PRV)G5型OSU株长度约为1.0kb的基因片段,将其克隆到pMD 18-T载体上进行测序鉴定,证明为该PRV的VP7蛋白基因,与已发表的该PRV VP7基因序列的同源性为99.8%.将该基因黏端克隆至表达载体PblueBAChisC质粒中,酶切及PCR鉴定表明获得了PRV-VP7蛋白基因与PblueBAChisC质粒的阳性重组子.纯化该重组质粒并与线性杆状病毒DNA分子Bac-N-Blue共转染昆虫细胞sf9,5 d后收获重组病毒.通过对重组杆状病毒DNA分子的酶切及PCR鉴定,确定PRV-VP7基因已正确插入.将经3次蚀斑筛选纯化后的该重组杆状病毒接种于sf9细胞大量增殖后,获得了重组杆状病毒PRV-VP7蛋白的真核表达. 相似文献