中药复方禽球灵抗鸡柔嫩艾美球虫的效果

采用人工感染发病方法 ,观察了中药复方禽球灵抗鸡柔嫩艾美球虫的效果。结果表明 ,10 g/kg禽球灵对柔嫩艾美球虫的感染有较好的预防效果。抗球虫指数 (ACI)达 15 1.4 8,血便分数较感染不给药组降低了 4 8.2 2 % ,料肉比较感染不给药组降低了 2 6 .2 9%。     

鸡球虫田间混合种和柔嫩艾美球虫单一种的抗药性试验

用上海某鸡场分离的球虫田间混合种及从其中分离纯化的 4株柔嫩艾美球虫 (Eimeriatenella)单一种对常用抗球虫药的抗药性进行检测。发现该球虫田间种对氯羟吡啶 (clopidol)、马杜拉霉素 (maduramicin)、莫能菌素 (monensin)、氨丙啉 (amprolium) 4种抗球虫药已产生完全抗药性 ,对氯苯胍 (robenidine)轻度抗药 ,对地克珠利 (diclazuril)无抗药性。 4株柔嫩艾美球虫单一种对氯羟吡啶、马杜拉霉素、莫能菌素、氨丙啉的抗药谱与该球虫田间混合种基本一致     

硒和维生素E与柔嫩艾美球虫感染的关系

选择 1日龄蛋用公鸡 72只 ,随机分为 6组 ,每组 12只。第Ⅰ～Ⅳ组鸡从 1日龄起在日粮中分别添加维生素E 5 6 .3、5 7.4、5 9.6、6 1.8mg/kg和硒 0 .93、1.0 3、1.2 3、1.4 3mg/kg ,第Ⅴ组为感染无添加剂组 ,第Ⅵ组为不感染无添加剂组 ,饲喂基础日粮 (含维生素E 4 8mg/kg和硒 0 .6mg/kg) 。至 2 1日龄时 ,第Ⅰ～Ⅴ组鸡口服接种柔嫩艾美球虫孢子化卵囊 ,1× 10 5个 /只 ,接种后观察感染鸡的状况。结果 ,第Ⅰ～Ⅵ组鸡平均增重分别为 2 2 .0、2 3.8、35 .2、39.2、8.9和 4 7.5 g ;病变值为 2 8、2 4、2 4、2 5、30和 0 ;1g粪便的卵囊数分别为 0 .17× 10 6 、0 .12× 10 6 、0 .0 9× 10 6 、0 .11× 10 6 、0 .2 1× 10 6 和 0个。提示 ,在日粮中添加维生素E和硒能提高鸡体的免疫力 ,增强鸡对球虫的抵抗力。     

柔嫩艾美球虫裂殖子的分离纯化

采用标准分样筛过滤、离心洗涤、差速离心和DEAE 5 2纤维素柱层析法对球虫裂殖子进行了纯化 ,并对不同填充高度的DEAE 5 2纤维素层析柱的纯化效果进行了比较。结果表明 ,采用填充高度为 14cm的层析柱分离纯化效果较好 ,操作程序较简单 ,从 30只鸡的盲肠黏膜中纯化裂殖子 1.85× 10 7个 ,平均每只鸡获得裂殖子 6 .17× 10 5个 ,所获得的裂殖子杂质极少 ,其纯度适用于mRNA差异显示等分子生物学研究。     

柔嫩艾美球虫感染对鸡体内一氧化氮水平的影响

对33日龄健康罗曼公鸡口服接种1.5×105个柔嫩艾美球虫孢子化卵囊,分别于感染0、2、4、6和8 d扑杀,检测其血清、心、肝、脾、肺和肾组织NO含量.结果表明,试验鸡血清NO水平在感染第4 d显著低于对照鸡(P＜0.05),至感染第8 d显著高于对照鸡(P＜0.05);心、肺NO水平与对照鸡相比差异不显著(P＞0.05);肝NO水平在感染第6 d极显著高于对照鸡(P＜0.01),其他时间与对照鸡无显著差异(P＞0.05);脾NO)水平在感染第2 d和第8 d均显著低于对照鸡(P＜0.05);肾NO水平在感染第2 d极显著高于对照鸡(P＜0.01),自第4 d到试验结束与对照鸡相比差异不显著.提示在鸡柔嫩艾美球虫感染过程中NO)可能通过介导机体免疫而参与抗病作用.     

中药"球康"对柔嫩艾美球虫超微结构的影响

利用透射电镜对中药"球康"作用下柔嫩艾美球虫超微结构的变化进行了观察.结果发现,在"球康"作用下,球虫裂殖子形态结构发生明显变化,表现为哑铃形、畸形和不规则形状,裂殖子的顶体肿胀变圆;裂殖子外膜破损,外膜与细胞质分离,出现大的空腔.球虫微线消失,内部出现环状结构;线粒体内出现空泡和致密的电子团块;球虫死亡,完全失去超微结构,仅留下许多支链淀粉颗粒.推测中药"球康"抗球虫的作用机理可能是,通过破坏虫体结构的完整性,抑制虫体物质代谢及能量代谢等生理机能,从而杀死球虫或者抑制球虫的生长和繁殖.     

不同日龄雏鸡对柔嫩艾美球虫早熟株卵囊的易感性及免疫力

对１,７和２５日龄鸡分别感染１０００个早熟柔嫩艾美球虫孢子化卵囊,感染１２０ｈ后,每２４ｈ收集粪便１次,进行卵囊计数,连续７ｄ,３种日龄鸡排卵囊总数分别为４６０．９,８０２．０和１４１７．７万个／只。感染后１４ｄ对１日龄和７日龄鸡的免疫组及相对应的２个不免疫对照组每只鸡攻击１００个柔嫩艾美球虫亲本株孢子化卵囊,攻毒１４４ｈ后,每２４ｈ收集粪便１次,进行卵囊计数,连续５ｄ,各组鸡的卵囊总量分别为４１．４,５．８和８９１．０,９７７．１万个／只。结果表明球虫卵囊对１日龄和７日龄雏鸡具有一定的感染力,分别占２５日龄雏鸡的３２．５％和５６．６％,与对照组相比,保护率分别为９５．４％和９９．４％。     

利用AP-PCR对柔嫩艾美球虫不同地理株及其杂交株多态性的研究

用随机引物PCR(AP PCR)技术对鸡柔嫩艾美球虫(Eimeria tenella)黑龙江株(H)、山东株(S)及黑龙江株与山东株的杂交株(F1)进行了研究,同时对 2 个不同地理株的子代株与亲代株和F1 株的亲缘关系进行了分析。结果,鸡柔嫩艾美球虫不同地理株之间以及同一地理株的亲代与子代之间存在DNA多态性;并且不同地理株间的种内变异程度较大(Si=0.642 3~0.637 0);同一地理株亲代与子代之间的亲缘关系也稍有改变,但其变异程度不大(Si=0.983 0~0.981 1)。对F1 株的AP PCR分析发现,F1 株与H株、S株的相似值分别为0.692 9、0.682 5,介于H株与S株相似值和传代株间的相似值之间。结果表明,F 株既具有两亲本株的遗传性状,又发生了变异。     

柔嫩艾美球虫抗药株第二代裂殖子的双向电泳图谱比较

对实验室诱导的柔嫩艾美球虫马杜拉霉素、地克珠利抗药株及其同母源敏感株第二代裂殖子的蛋白质进行双向电泳 ,构建了稳定的双向电泳图谱。经Imagemaster 2DElite软件分析 ,敏感株和抗药株平均可分离 90 0个点 ;以敏感株平均胶作为参考胶 ,抗药株平均胶与之比较 ,得到差异蛋白质斑点 ,其中地克珠利抗药株和马杜拉霉素抗药株各有 4个表达差异点。这些差异表达的蛋白质可能参与了球虫抗药性产生的过程。     

柔嫩艾美球虫扬州株SO7抗原基因表达条件的研究

通过RT-PCR扩增柔嫩艾美球虫YZ株折光体SO7抗原基因,并进行克隆和测序。将不含信号肽编码区片段的SO7基因克隆入表达载体pGEX-6p-1谷胱甘肽-S-转移酶基因的下游,构建表达质粒pGEX-6p-1-SO7,转化宿主菌BL21,获得重组菌。通过建立生长曲线,对诱导条件的摸索,根据SDS-PAGE确定融合蛋白的最佳表达条件。通过融合蛋白切胶免疫小鼠制备超免疫血清,经间接ELISA检测其与E.tenella子孢子抗原反应的特异性。结果显示,诱导时机和诱导时间是影响表达的主要因素,诱导温度、IPTG浓度次之;诱导时机以3 h为最佳,诱导时间以4.5 h为最佳;诱导温度以37℃最佳,0.008~1.000mmol/L的IPTG对表达量的影响不大。在优化的表达条件下,表达产物主要以包涵体存在,表达量占菌体总蛋白的37.5%。间接ELISA结果表明融合蛋白具有一定的免疫原性,保留了天然蛋白的部分抗原性。     

柔嫩艾美耳球虫地克珠利与马杜拉霉素抗药株的基因重组选育

将柔嫩艾美耳球虫地克珠利抗药株与马杜拉霉素抗药株等剂量同时感染无球虫鸡,再将得到的杂交后代经饲喂了地克珠利与马杜拉霉素的鸡筛选获得重组体,对该重组体的部分生物学特性进行了研究,旨在采用基因重组方法筛选出具有双重抗性的重组抗药株。结果显示,该重组体的重组率为0.4%;对地克珠利与马杜拉霉素具有完全抗性,而对氯苯胍与尼卡巴嗪完全敏感;卵囊繁殖能力介于两母株之间,致病性与母株无显著性差异。表明,用基因重组法首次成功筛选出了对地克珠利与马杜拉霉素同时具有抗性的柔嫩艾美耳球虫抗药株。     

鸡柔嫩艾美耳球虫哈尔滨株3-1E基因的重组表达及其表达产物的免疫保护性

应用RT-PCR技术扩增柔嫩艾美耳球虫哈尔滨株子孢子表面抗原3-1E基因,再克隆至质粒载体pMD18-T中,获得重组质粒pMD18-T-3-1E,采用EcoR I+Hind III双酶切法及PCR扩增鉴定正确后,将3-1E基因cDNA目的片段亚克隆到原核表达载体pET-32a(+)中,获得重组质粒pET-32a-3-1E,用EcoR I+Hind III双酶切法及DNA测序证明cDNA序列完全正确.表达蛋白的SDS-PAGE分析表明,表达产物与预期大小(36.47 ku)一致,为可溶性表达.对诱导时间以及IPTG浓度的优化结果表明,当诱导6 h且IPTG浓度在0.8 mmol/L时表达量最大.Western-blot分析表明,表达的蛋白可被感染柔嫩艾美耳球虫鸡的阳性血清特异性识别.将重组3-1E蛋白纯化后分为肌注蛋白组和肌注蛋白加弗氏完全佐剂组免疫AA鸡,通过计算抗球虫指数检测其保护力.结果显示,肌注重组蛋白组与肌注重组蛋白加弗氏完全佐剂组均能刺激鸡体产生一定的免疫反应,对柔嫩艾美耳球虫感染产生有力的保护,其中后者优于前者,表明该重组3-1E蛋白具有研制成亚单位疫苗的潜力.     

串联型黄色荧光蛋白表达载体的构建及其在柔嫩艾美球虫中的瞬时表达

为了探索黄色荧光蛋白(YFP)在柔嫩艾美球虫子孢子中的瞬时表达情况,以柔嫩艾美球虫的组蛋白4(Histone4,H4)上游启动序列和肌动蛋白(Actin)下游调控序列为元件构建了串联型YFP重组转染载体pH4-YFP-YFP-ACT。将构建的载体经电穿孔法转染柔嫩艾美球虫子孢子,并在MDBK细胞中进行培养。结果显示,在荧光显微镜下可以观察到黄色荧光。提示,串联型YFP可以在柔嫩艾美球虫中瞬时表达。     

柔嫩艾美耳球虫感染鸡的盲肠上皮间淋巴细胞表达白介素17的动态变化

以1×104个柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)孢子化卵囊感染10日龄AA肉鸡,于感染后第24、48及72小时分离鸡盲肠上皮间淋巴细胞(IELs)。提取鸡盲肠IELs总RNA,用实时荧光定量PCR方法检测IL-17的表达动态;然后用FITC标记的抗鸡CD4单抗和PE标记的抗小鼠IL-17单抗作为抗体对盲肠IELs进行荧光抗体染色,再进行流式细胞术分析,检测了表达IL-17的CD4+盲肠IELs在柔嫩艾美耳球虫感染后的动态变化。实时荧光定量PCR结果表明,鸡在感染柔嫩艾美耳球虫后能够显著上调IL-17mR-NA的表达水平,流式细胞分析结果表明,在球虫感染后表达IL-17的CD4+细胞数量显著上升。这些结果表明,IL-17参与了宿主抵抗球虫感染的反应。     

柔嫩艾美耳球虫DF-1细胞培养体系的建立及应用

为了建立柔嫩艾美耳球虫的鸡胚成纤维传代细胞(DF-1)培养体系,并应用于柔嫩艾美耳球虫子孢子的细胞入侵活力检测,将CFDA-SE标记的子孢子接入DF-1细胞,利用流式细胞仪测定子孢子的细胞入侵活力。比较了37℃和41℃培养温度下,子孢子对DF-1、MDBK、Vero、BHK、MDCK五种细胞的入侵活力。优化了在子孢子入侵活力检测时,DF-1细胞最佳培养条件。结果表明,柔嫩艾美耳球虫子孢子在DF-1细胞中可发育为第一代裂殖子。在不同培养温度下,子孢子对DF-1细胞的入侵活力均高于其他细胞。优化后的DF-1细胞培养体系的培养程序为:用含100mL/L胎牛血清的DMEM稀释DF-1细胞,以每孔1×105个细胞铺被24孔板,37℃、50mL/L CO2培养24h后,用含50mL/L胎牛血清的DMEM换液后,每孔接入3×105个子孢子,41℃、50mL/L CO2培养8～12h,收集细胞进行检测。     

柔嫩艾美球虫pEtK2抗原基因的克隆表达及其表达产物的抗原性分析

应用RT-PCR技术从纯化的柔嫩艾美球虫孢子化卵囊子孢子中克隆了pEtK2抗原基因,并进行了原核表达和抗原性分析,同时用MTT法检测了重组蛋白对球虫耐过鸡淋巴细胞的刺激效果。结果显示,克隆的pEtK2基因全长1464 bp,具有一个完整的开放阅读框,编码487个氨基酸,具有多个T细胞表位。重组蛋白诱导5 h后表达量最多,分子质量约55 ku,占菌体总蛋白的32%。纯化的重组蛋白能够刺激球虫耐过鸡T淋巴细胞增殖,可作为球虫基因工程疫苗或DNA疫苗的候选基因。