牛血孢子虫单一种的分离技术及其保藏方法的研究——牛巴贝斯虫和卵形巴贝斯虫在其媒介蜱血淋巴中的裂殖子观察

将洁净微小牛蜱幼虫和长角血蜱饥饿成虫分别饲喂到人工感染牛巴贝斯虫和卵形巴贝斯虫单一种的牛体上,收集脱落饱血雌虫培育,逐日用断腿法制作血淋巴涂片观察。结果微小牛蜱脱落后第4天的血淋巴中,就观察到了牛巴贝斯虫的游离大裂殖子,其形态似压扁的圆锥体,前端大而钝,后端小而尖,有的尖端稍弯曲或弯曲如钩状。虫体中央有1～3个圆形的核,绝大多数为1个。原生质中有数目不等的空泡,大小为9.0～22.0×1.5～6.0μm,平均13.6×3.14μm。另有圆环形、逗点形、蝌蚪形及其它形态的裂殖子,大多周边布有染色质带,中央往往呈现出一个大空泡。在脱落后第4天的个别长角血蜱的血淋巴涂片中,就可查到大裂殖子,直到第20天,存活蜱的涂片中还可检出。蜱全部获得感染,但虫体出现的时间不规律,仅在少数蜱的涂片中可连续观察到。其形态与上述牛巴贝斯虫血淋巴中典型大裂殖子相似。大小为10.0～19.0×1.5～4.5μm,平均13.84×3.72μm。     

甘肃张家川牛卵形巴贝斯虫的分离及补充传播试验

利用甘肃张家川牛体所采集的长角血脾饱血雌虫的次代幼虫，叮咬除脾健康易感牛，于第９天的未稍血液涂片中，发现了典型的卵形巴贝斯虫，第１２天染虫率达到３．１２％的高峰，随后下降至带虫水平。这是在甘肃省首次发现并分离出的一株卵形巴贝斯虫。试验证实，长角血脾雄虫也具有传播卵形巴贝斯虫的能力，卵形巴贝斯虫也可以通过长角血脾隔代垂直传播，这两个结果尚属首次报道。在自然感染牛体采集的饱血雌虫血淋巴涂片中也观察到了卵形巴贝斯虫大裂殖子。     

牛大巴贝西虫在我国的发现及其媒介蜱的确定

首次在我国发现和分离出一株牛的大巴贝西虫并确定了其媒介蜱为长角血蜱。1988年4月,从河南省卢氏县同一群黄牛体上采集到长角血蜱饱血雌虫4只和微小牛蜱饱血雌虫16只,然后分别用其第二代幼虫、若虫和成虫感染除脾小牛。结果证明长角血蜱饱血雌虫能经卵传递大巴贝西虫,第二代幼虫对牛具有感染力,若虫和成虫不能感染。微小牛蜱的幼虫、若虫和成虫各期都不能传播这种巴贝西 虫。长角血蜱幼虫感染的小牛,红细胞内的虫体稍小于双芽巴贝西虫,大于牛巴贝西虫,双梨子形虫体较宽,其量度为3.1～3.7×1.5～2.3μm,长宽指数为1.87。     

牛血孢子虫单一种分离技术及其保藏方法的研究——双芽巴贝斯虫纯种虫株的分离

本文报道了牛双芽巴贝斯虫纯种虫株的分离方法和步骤。将洁净微小牛蜱幼虫饲喂在事先人工感染的混合种带虫牛体上,收集感染的饱血雌虫,俟次代幼虫孵出后,将其释放到另一健康易感牛体上,自行叮咬18天之后,从该头牛体上摘下450只半饱雄虫,人为地移至另一健康牛体上,使其继续叮咬。雄虫叮咬后的第13天,在该头牛的血液涂片中,出现了典型的双芽巴贝斯虫,在其后30天的检查过程中,未发现其他种虫体。感染后第13天,体温开始升高,最高达39.6℃,持续3天;第20天染虫率达到6.11％的高峰;第27天出现血尿。同时对红白细胞进行了计数,并观测了某些临床症状。     

牛血孢子虫单一种的分离技术及其保藏方法的研究——牛巴贝斯虫纯种虫株的分离

本试验对感染双芽巴贝斯虫和牛巴贝斯虫混合种的牛连续注射1％台盼蓝溶液3天,用其脑匀浆滤液接种健康易感牛,未分离出牛巴贝斯虫单一种。将洁净微小牛蜱幼虫释放到牛体叮咬10天后,用混合种含虫血感染牛,收集饱血雌虫,置28℃、相对湿度约90％的条件下产卵孵化,用次代幼虫分批感染健康易感牛5头,准确地于幼虫释放后5、4、3天,用杀虫剂杀死正在吸血的幼虫终止感染,对试验牛逐日耳尖采血涂片检查,仅3天杀死幼虫的牛只感染有牛巴贝斯虫单一种。试验结果表明,台盼蓝不能杀灭双芽巴贝斯虫;脑涂片中尽管有大量牛巴斯虫,但它不是寄生于该部位的唯一种;叮咬3天的次代幼虫仅传播牛巴贝斯虫。     

牛血孢子虫单一种的分离技术及其保藏方法的研究——微小牛蜱对边缘边虫的传递试验

将洁净微小牛蜱幼虫释放到感染有边缘边虫的牛体上,摘取正在吸血的半饱成虫、饥饿成虫、半饱稚虫,分别人为地转移到3头健康易感牛体上事先用锌明胶贴好的布袋中。使其继续叮咬,试验牛均遭感染,其潜伏期分别为13天、13天、19天。最高染虫率分别达53.1％、12.0％、8.6％,用从感染牛体脱落饱血雌虫的次代幼虫,叮咬4头健康易感牛,检查时间最短的为30天,最长的达180天,在整个检查过程中,4头试验牛的血液涂片,始终均未发现边缘边虫。试验证明,边缘边虫不能通过微小牛蜱经卵传递,只有当代各变态期的蜱,由感染牛体转移到易感牛且继续叮咬时,才能使边缘边虫得以传播。     

甘肃省羊泰勒虫媒介蜱的传播试验

用采自羊泰勒虫病疫区甘肃省永靖县的麻点璃眼蜱饥饿成虫叮咬健康羊体,试验羊体内未发现羊泰勒虫;用其饱血雌虫孵化的幼虫叮咬羊泰勒虫感染羊,收集饱血若虫,再用其饥饿成虫叮咬健康羊体,被叮咬羊体内也未查出羊泰勒虫,证明麻点璃眼蜱不传播羊泰勒虫.用采自羊泰勒虫病疫区张家川和永靖县的青海血蜱经人工孵化的幼虫叮咬羊泰勒虫自然感染羊,收集饱血幼虫蜕皮后,用其若虫叮咬健康羊,40 d后在被叮咬羊血片中发现羊泰勒虫,但未显示明显的临床症状.用采自羊泰勒虫病疫区羊体的青海血蜱成虫、若虫、幼虫同时叮咬健康羊,18 d时在试验羊体内发现羊泰勒虫,试验羊表现贫血、黄疸、稽留热、肩前淋巴结肿大等特征性症状,出现心包积液,肝、脾、肾肿胀及出血的典型病理变化.由此确定,甘肃省的羊泰勒虫是由青海血蜱传播的.     

牛源环形泰勒虫吐鲁番流行株Ta-t的体内扩繁试验

以被去除脾的昆明小白鼠为实验动物(40只),接种牛源环形泰勒虫吐鲁番流行株Ta-t,进行小鼠体内扩繁试验,并于接种后第8、12、24、48小时以及第3~10天每天经血液涂片检查接种后昆明小白鼠的红细胞染虫率,观察分析其扩繁情况;经昆明小白鼠心脏、眼球采血的方法收集其最高染虫率(15%以上)的血液内裂殖子,并进行冻存,摸索其保存、复苏条件等。结果显示,除脾术后昆明小白鼠均存活,检测其呼吸、脉搏、食欲、精神状态皆良好,说明摘脾手术成功;接种后第48小时可在昆明小白鼠血液里观察到裂殖子,第5~9天每组昆明小白鼠的平均染虫率可达15%~20%(最高峰),第10天后染虫率开始下降,血液涂片中裂殖子数量渐渐减少;经试验发现,在雌雄性昆明小白鼠体内的染虫率差异极显著(P=0.0070.01),去脾昆明小白鼠与未去脾昆明小白鼠的染虫率差异也极显著(P=0.000 20.01),牛源环形泰勒虫在除脾的昆明小白鼠血液内能被置换、增殖。染虫率为15%以上时昆明小白鼠血液里的裂殖子可用冷冻(-80℃)保存,亦可制作玻片裂殖子抗原备用,保存半年以内的裂殖子复苏活性最佳。该试验数据可为建立环形泰勒虫动物模型、教学、科研提供丰富的血液原虫株资源。     

牛血孢子虫单一种分离技术及其保藏方法的研究——牛边缘边虫纯种虫株的分离

本文叙述了牛边缘边虫的分离方法和步骤。将洁净微小牛蜱幼虫培育在接种含边缘边虫混合种虫血的牛体上,叮咬17天后,摘取600只(雌雄各半)未饱血成虫,人为地移至另一头易感健康牛体上。于继续叮咬后13天,在该头牛的血液涂片中发现了典型的边缘边虫。至33天时染虫率达到高峰,为53.11％,个别红细胞 内的感染强度高达9～10个虫体。35天染虫率降至41.34％,牛只死亡。在该头牛虫体出现至死前23天的涂片中,只见到了单一的边缘边虫,未发现其他形态的虫体。同时对感染牛只的血红蛋白、红白细胞数及临床症状等进行了观测。为了使染虫率升高,在本试验中采用了肌注氢化泼尼松的办法,起到了与手术除脾差不多的效果,且省事安全。     

长角血蜱对牛大巴贝西虫的经卵传递试验研究

我国河南省卢氏县流行的牛的大巴贝西虫病,传播媒介为长角血蜱。本试验进一步证实,清洁的长角血蜱成虫饲喂在大巴贝西虫带虫的牛体上可被感染,病原能在饱血的雌蜱体内经卵传递,其第二代幼虫、若虫和成虫都具有将大巴贝西虫传递给易感牛的能力。微小牛蜱不能传播这种病原。     

小白鼠对旋毛虫感染的自然抵抗力研究

本文研究了普通小白鼠对旋毛虫感染的自然抵抗力。结果表明感染后第1天开始出现成虫,一直持续到感染后第28天。第10天成虫回收率最高达96.67％。雌雄成虫比为2:1左右。成虫的平均大小:雄虫为1.13～1.64×0.04～0.06mm,雌虫为3.20～3.60×0.05～0.06mm。最迟感染后第17天开始出现卷曲的肌幼虫,第21天幼虫开始包囊化。第28天幼虫回收率达高峰。每克横纹肌平均荷虫量为11200条,每条饲喂的幼虫可产生448条幼虫。研究结果提示普通小白鼠对旋毛虫感染的自然抵抗力不强。     

牛羊蜱传性血液原虫超微结构研究——双芽巴贝斯虫的超微结构观察

双芽巴贝斯虫电镜观察显示，红细胞内的虫体可分为裂殖子、正在分裂的裂殖子及滋养体三个阶段。典型的裂殖子为双梨子形，环绕着一层外膜和一层内膜，细胞质内可看到前后极地环、微丝体、线粒体、内质网和一个大的核及一个独特的球形体。球形体大小与核一样，位于核与前极环之间。滋养体多形，膜为单层，虫体内有线粒体、微丝体     

微小牛蜱对牛巴贝西虫和双芽巴贝西虫传播能力的研究

河南省卢氏县为午巴贝西虫和双芽巴贝西虫的混合感染地区。将该地区自然感染的微小牛蜱的饱血雌虫置28℃产卵和孵育,然后分别用其次代幼虫、若虫和成虫感染除脾牛,结果证明微小牛蜱能经卵传递牛巴贝西虫和双芽巴贝西虫。幼虫不仅能传播牛巴贝西虫,同时也能传播双芽巴贝西虫。若虫和成虫只能传播双芽巴贝西虫,对午巴贝西虫不再具有传播能力。用若虫感染除蜱牛分离出1株纯双芽巴贝西虫。     

刻点血蜱生活史的研究

对从新疆伊宁县和霍城县牛、羊体获得的刻点血蜱在实验室进行了生活史观察，实验证实刻点血蜱为三宿主蜱，一个生活周期为１０７～１７３天，一年发生一个世代。饱血雌蝉的产卵前期和产卵期随温度的不同而有差异，在２８℃时分别为４～８天和２４～３２天。卵为椭圆形，大小为０．３２～０．４２ｍｍ×０．４７～０．５７ｍｍ，孵化期为３３～３８天。幼蜱吸血期为７～１４天，蜕变期为１０～１９天，若蜱吸血期为６～１５天，蜕变期为９～１９天，雌蜱吸血期为１２～１７天。６～７月份饱血雌蜱部分发生生殖滞育，８月份以后饱血者则全部发生滞育，９月份以后饱血的若蜱也发生滞育，表现为变态延迟。饥饿成蜱在１０月份以后饲喂在动物体时，发生行为滞育和摄食滞育。各个发育阶段都有较强的耐饥饿能力，在室温下，幼蜱生存１３０～２２０天，若蜱２１０～３８０天，成蜱２４０～６００天。     

环形泰勒焦虫(Theileria annulata)裂殖体细胞培养的研究

牛环形泰勒焦虫病为我国北方地区危害较大的一种血液寄生虫病,裂殖体(Schizont)或柯霍氏小体(Kochs bodies)是泰勒焦虫在网状内皮系统发育阶段的一种形态,主要寄生在肝脏,脾脏和淋巴结的网状细胞和成淋巴细胞内,具有很强的病原性和免疫原性。目前,通过细胞培养的方法,已能使裂殖体连续不断地在体外繁殖。     

寄生牛环形泰勒焦虫裂殖体的淋巴细胞冻存液的研究

牛环形泰勒焦虫裂殖体胶冻细胞苗,是我国血孢子虫免疫方面的第一个活虫苗,并已大面积应用于牛环形泰勒焦虫病流行区。我们于1977年试验成功了用液氮(-196℃)冻存含裂殖体牛淋巴细胞,为工厂化大量制苗提供了种子细胞,但种子细胞在液氮内冻存的过程中,也有程度不同的死亡,所以研究如何延长含裂殖体细胞苗的存活时间和提高种子细胞在掖氮中(-196℃)冻存后的存活率,是目前急待解决的问题。1985年我们曾用鱼鳞明胶和     

麻点璃眼蜱的鉴定及部分生物学特性研究

1999-2000年3-9月份从甘肃省永靖县的绵羊、山羊体表采集蜱842只(雄虫453只,雌虫389只),经鉴定为麻点璃眼蜱(Hyalomma rufipes).该种蜱对山羊的侵害大于绵羊,一般寄生于羊后肢内侧、肛门周围和母羊外生殖器周围等无毛或毛稀少、毛很短的部位.经实验室人工饲养,证明该种蜱为二宿主蜱,饱血雌虫产卵前的生殖滞育期平均39.5 d,产卵期平均22.5 d,卵孵化平均27 d,幼虫从开始吸血到变为饱血若虫19.5 d,饱血若虫蜕皮约37 d;成虫活动季节为3-10月份,5-6月份为高峰期,羊在高峰期的感染率达100%.     

感染环形泰勒虫裂殖体的牛淋巴细胞酵母双杂交文库的构建

为研究环形泰勒虫裂殖体与牛淋巴细胞之间的相互作用,以感染了环形泰勒虫裂殖体的淋巴细胞系为材料,构建了感染环形泰勒虫裂殖体的牛淋巴细胞系的酵母双杂交cDNA文库。首先,提取纯化细胞系的mRNA,经反转录合成第一条链cDNA,通过LD-PCR合成双链cDNA。柱层析剔除250bp以下的小片段;将双链cDNA与经SmaⅠ处理过的文库质粒pGADT7-Rec一起转入到酵母Y187感受态细胞内,双链cDNA与文库质粒会发生同源重组,经过抗性筛选即可得到酵母双杂交cDNA文库。文库构建结果显示,该文库库容量达2.4×107 CFU,插入片段的平均长度在1 000bp左右,达到试剂盒建库要求。     

旋毛虫TsP53重组蛋白对小鼠的免疫保护性

将旋毛虫TsP53重组蛋白以20μg/只的剂量免疫小鼠3次后攻击感染旋毛虫肌幼虫200条/只。检查小鼠肠道旋毛虫7日龄成虫数、雌虫体外产新生幼虫数和感染35d后的肌幼虫数,并计算减虫率,同时用间接ELISA检测血清中抗TsP53重组蛋白的抗体应答。结果显示,TsP53重组蛋白免疫小鼠旋毛虫7日龄成虫、雌虫产新生幼虫的减虫率分别为14.34%和16.93%,与感染对照组和佐剂对照组相比差异不显著(P0.05);感染35d后肌幼虫减虫率为38.68%,与感染对照组和佐剂对照组相比差异显著(P0.05)。TsP53重组蛋白免疫小鼠在首次免疫后第7天出现抗体应答,可检测到抗TsP53重组蛋白的抗体,第3次免疫后第7天达到峰值,攻击感染后略有下降,但直到试验结束时仍然维持在较高水平,TsP53重组蛋白可诱导小鼠产生部分抗旋毛虫的免疫保护性。     

应用琼脂扩散试验诊断鸡住白细胞虫病

鸡住白细胞虫病的诊断,以往多采用病原检查,即从病鸡翅静脉血涂片中发现鸡住白细胞虫裂殖子即可确诊。由于住白细胞虫的形态与鸡异嗜性中性白细胞极相似,常会造成误诊。为此,我们建立了应用琼脂扩散试验诊断住白细胞虫病的方法,初步试验效果较好。1　抗原制备　　选末稍血片中有典型住白细胞虫裂殖体,并表现出明显症状的10只病鸡,从翅静脉采血。待血液凝集后分离血清和血凝块,与其肝、脾、肾等内脏混合,匀浆;用0.01ｍｏｌ/Ｌ(ｐＨ8.0)ＰＢＳ离心洗涤3次,在沉淀物中加5倍体积的ＰＢＳ,在振荡器上振荡5ｍｉｎ;然后分别在50、100、150……500ｇ…